Читать книгу "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Точность поляриметра проверяют, исследуя стандартный раствор глюкозы, но этот раствор годен для работы только через 24 ч после его приготовления.

Определению могут мешать β-оксимасляная кислота, препараты тетрациклинового ряда, стрептомицин.

Колориметрический метод Альтгаузена

Принцип метода

Используется цветная реакция, получаемая при нагревании раствора глюкозы со щелочью.

Необходимый реактив

10 %-ный раствор едкого натра.

Ход исследования

К 4 мл мочи приливают 1 мл 10 %-ной щелочи. Кипятят в течение 1 мин. Через 10 мин после кипячения цвет жидкости сравнивают с цветной шкалой. На шкале соответственно каждой окрашенной полоске обозначено процентное содержание сахара. Можно приготовить цветную шкалу в пробирках (стандарты). Приготавливают следующие растворы глюкозы: 0,5; 1; 1,5; 2; 3 и 4 %-ный и обрабатывают их так же, как исследуемую мочу. Пробирки закрывают пробками. Таким стандартом можно пользоваться примерно 7–10 дней, что удобнее, чем бумажная шкала.

Метод Альтгаузена прост и удобен в практической работе и может быть рекомендован в тех случаях, когда нет поляриметра, и для быстрого определения уровня сахара у постели больного.

Определение уровня сахара в моче по цветной реакции с ортотолуидином

Принцип метода

Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием перекиси водорода, которая под действием пероксидазы окисляет ортотолуидин с образованием синего хромогена. Обе реакции протекают одновременно при рН 4,8.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO₄) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1 %-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта (раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев, имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция).

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH₃COONa × 3Н₂О в 1 л).

6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ЕД/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена (желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера (реактив 5), в холодильнике можно хранить несколько дней).

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл (рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде; если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать).

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при 37 °C и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3 %-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл.

Ход исследования

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл мочи или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо мочи берут физиологический раствор хлорида натрия. При приготовлении калибровочного графика вместо проб мочи берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой – величину экстинкции.

Существуют другие методы определения уровня сахара в моче (титрационный, бродильный), которые редко применяют в практических лабораториях.

Определение уровня других видов сахаров (левулезы, лактозы, галактозы)

При необходимости пользуются различными пробами (цветные качественные, бродильные, вращение поляризованного света, образование озазонов и пр.).

Из этих проб специфическими являются только бактериальное разложение, хроматографическое исследование и энзимные пробы.

Определение уровня молочного сахара (лактозы)

Лактоза появляется в моче беременных и кормящих женщин. Положительная качественная реакция на лактозу позволяет исключить в этих случаях глюкозурию, которая обусловлена другой патологией. Лактоза дает те же реакции восстановления, что и глюкоза. Плоскость поляризации вращает вправо.

Необходимые реактивы

1. 10 %-ный раствор едкого натра.

2. Аммиак (не слабее 10 %).

Ход исследования

К 8–10 мл мочи приливают 4–5 мл аммиака и 5–10 капель щелочи, нагревают на водяной бане при температуре 60–70 °C. В присутствии лактозы появляется розовое окрашивание. Глюкоза дает желтое окрашивание.

Количество лактозы определяют в поляризационном аппарате. Полученный результат умножают на 0,947.

Определение фруктозы (левулезы)

Левулеза иногда встречается в моче при нарушении обмена веществ и при диабете (вместе с глюкозой).

Необходимые реактивы

1. Резорцин.

2. Соляная кислота концентрированная.

Ход исследования

Растворяют несколько зерен резорцина в 3 мл концентрированной соляной кислоты, прибавляют двойное количество мочи и быстро нагревают на водяной бане. Пробу не следует долго кипятить, так как при этом из глюкозы может образоваться левулеза. При наличии левулезы проба окрашивается в вишнево-красный цвет. Проба считается положительной при быстром появлении интенсивной окраски.

Моча, содержащая левулезу, дает все реакции на глюкозу и вращает плоскость поляризации влево. При определении ее количества в поляриметре полученный результат умножают на 0,54. Так как фруктоза большей частью встречается одновременно с глюкозой, то вращения влево обнаружить не удается.

Определение кетоновых тел

К кетоновым телам относятся ацетон, ацетоуксусная и β– оксимасляная кислоты.

В норме с мочой выделяется 20–50 мг кетоновых тел за 24 ч.

Чаще всего кетонурия наблюдается при диабете, что является критерием правильности подбора пищевого режима: если количество вводимых жиров не соответствует количеству усвояемых углеводов, то увеличивается выделение кетоновых тел. При уменьшении введения углеводов (лечение без инсулина) при обычном количестве жиров начинает выделяться ацетон; при лечении инсулином отсутствие глюкозурии достигается лучшим усвоением углеводов и не сопровождается кетонурией. Таким образом, исследование кетоновых тел в моче больных диабетом необходимо для коррекции диеты. Присутствие кетоновых тел наблюдается также при голодании, безуглеводной диете, лихорадке, у детей – при рвоте и поносе.

Кетоновые тела в моче в основном встречаются совместно, поэтому раздельное определение их клинического значения не имеет.

Большинство качественных реакций на кетоновые тела основано на их взаимодействии с нитропруссидом натрия в щелочной среде и появлении цветной реакции (образование комплексных соединений).

Унифицированная проба Ланге

Принцип метода

Нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами (ацетоуксусной кислотой, β-оксимасляной кислотой и ацетоном) с образованием комплекса красно-фиолетового цвета.

Необходимые реактивы

1. Раствор натрия нитропруссида готовят из Расчета 50 г/л перед употреблением.

2. Уксусная кислота концентрированная.

3. Аммиак водный (NH₄OH) – 25 %-ный раствор.

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 3 ч после мочеиспускания. В пробирку к 3–5 мл мочи приливают 5–10 капель раствора натрия нитропруссида и 0,5 мл уксусной кислоты, смешивают, а затем осторожно, по стенке пробирки, пипеткой наслаивают 2–3 мл водного раствора аммиака. Пробу считают положительной, если в течение 3 мин на границе сред образуется красно-фиолетовое кольцо.

Модифицированная проба Ротеры

Принцип метода тот же, что и в пробе Ланге.

Необходимые реактивы

1. Натрия нитропруссид, раствор из Расчета 50 г/л готовят перед употреблением.

2. Аммония сульфат.

3. Аммиак водный (NH₄OH) – 25 %-ный раствор.

Ход исследования

Приблизительно 200 мг сухого сульфата аммония, 5 капель мочи и 2 капли раствора натрия нитропруссида тщательно смешивают в пробирке, а затем на эту смесь осторожно наслаивают 10–15 капель раствора водного аммиака. При наличии кетоновых тел на границе раздела в течение 3–5 мин образуется красно-фиолетовое кольцо, интенсивность окраски которого позволяет ориентировочно судить о концентрации кетоновых тел в моче (табл. 35).

Таблица 35

Ориентировочная количественная оценка кетоновых тел в моче

При незначительной концентрации кетоновых тел слабое кольцо может появиться на 8–10-й минуте.

Проба Легаля

Необходимые реактивы

1. Свежеприготовленный водный раствор нитропруссида натрия (5 %).

2. 10–15 %-ный раствор едкого натра.

3. Уксусная кислота ледяная.

Ход исследования

К 5–6 мл мочи прибавляют несколько капель водного раствора нитропруссида натрия и 0,5 мл раствора едкого натра. Получается красное окрашивание. Добавляют 0,5–1 мл ледяной уксусной кислоты.

Если красный цвет исчезает, проба отрицательная, если сохраняется – положительная. Если получается слабая розовая окраска, то проба считается также положительной.

Метод с готовым набором для экспресс-анализа ацетона в моче

Принцип метода тот же, что и в предыдущих двух пробах.

Ход исследования

На полоску фильтровальной бумаги помещают таблетку, на которую пипеткой наносят 2 капли исследуемой мочи. Через 2 мин окраску таблетки сравнивают с цветной шкалой. Наличие ацетона вызывает фиолетовое окрашивание разной интенсивности; согласно шкале реакцию оценивают как слабоположительную, положительную и резко положительную.

Ряд фирм выпускает экспресс-тесты для определения кетоновых тел; определение с помощью таких тестов проводят строго по инструкции.

Ацетоуксусная кислота в стерильной моче стабильна до 8–10 дней, при бактериурии или большом количестве дрожжевого грибка может полностью исчезнуть в течение 24 ч. Около 20 % ацетона при комнатной температуре исчезает за 24 ч, но сохраняется в холодильнике.

Кетоновые тела могут исчезать из мочи и in vivo при бактериурии.

Определение желчных пигментов

Моча здоровых людей содержит минимальные количества билирубина, которые не могут быть обнаружены качественными пробами, применяемыми в практической медицине. С мочой выделяется только билирубина глюкуронид (прямой билирубин), концентрация которого в норме в крови незначительна.

Билирубинурию наблюдают главным образом при поражениях паренхимы печени (паренхиматозных желтухах) и нарушении оттока желчи (обтурационных желтухах).

Для гемолитической желтухи билирубинурия нехарактерна, так как гемобилирубин (непрямой билирубин) не проходит через почечный фильтр.

Большинство качественных проб для обнаружения билирубина в моче основаны на его превращении под действием окислителя в зеленый биливердин или пурпурно-красные билипурпурины, которые, примешиваясь к биливердину, дают синее окрашивание.

Унифицированная проба Фуше

Необходимые реактивы

1. 15 %-ный раствор хлорида бария.

2. Реактив Фуше: 25 г трихлоруксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и приливают 10 мл 10 %-ного раствора хлорного железа (FeCl₃).

Ход исследования

К 10 мл мочи прибавляют 5 мл 15 %-ного раствора хлорида бария. Смешивают, фильтруют. На вынутый из воронки и расправленный на дне чашки Петри фильтр наносят 2 капли реактива Фуше. Появление на фильтре сине-зеленых пятен говорит о присутствии билирубина. Если реакция мочи щелочная, то необходимо подкислить ее несколькими каплями уксусной кислоты.

Унифицированная проба Розина

Необходимый реактив

1%-ный спиртовой раствор йода.

Ход исследования

В пробирку наливают 4–5 мл мочи и осторожно, по стенкам пробирки, наслаивают раствор йода. Появление на границе между жидкостями зеленого кольца говорит о наличии билирубина.

Проба Готфрида

Принцип метода

Билирубина глюкуронид (холебилирубин) при соединении с диазотированной сульфаниловой кислотой (диазобензосульфоновая кислота) дает розовую окраску за счет образования билирубина.

Необходимые реактивы

1. 10 %-ный раствор хлорида бария.

2. Диазореактив: диазораствор I – 5 г сульфаниловой кислоты растворяют в небольшом количестве воды, прибавляют 15 мл концентрированной HCl и доливают до 1000 мл дистиллированной водой.

3. Диазораствор II – 0,5 %-ный раствор нитрата натрия. Непосредственно перед определением смешивают 10 мл диазораствора I и 0,25 мл диазораствора II.

4. Спирт этиловый 96 %-ный.

5. 6 %-ный раствор двузамещенного фосфата натрия.

Ход исследования

К 10 мл мочи, подкисленной несколькими каплями уксусной кислоты, прибавляют 5 мл 10 %-ного раствора хлорида бария, перемешивают, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтр раскладывают на дне чашки Петри и на осадок, содержащий билирубин, капают 1–2 капли свежеприготовленной диазосмеси, 4 капли спирта и 1 каплю двузамещенного фосфата натрия. При положительной пробе получается красно-фиолетовая окраска.

Этот принцип лег в основу экспресс-тестов для определения билирубина, выпускаемых зарубежными фирмами «Ames» (Англия), «Boehringer» (Германия) и др.

Определение содержания желчных кислот

В нормальной моче содержится минимальное количество желчных кислот. При механической желтухе оно постоянно повышено; часто отмечается увеличение его и при паренхиматозной желтухе. При гемолитической желтухе количество желчных кислот не увеличено.

Проба Гея

Необходимый реактив

Серный порошок.

Ход исследования

40–60 мл фильтрованной мочи оставляют в колбе на 20–30 мин. Затем на ее поверхность насыпают серный порошок. Если частицы серы начинают тонуть, проба положительная (так как уменьшается поверхностное натяжение вследствие увеличения выделения желчных кислот и солей). Проба отрицательная, если серный порошок задерживается на поверхности. Наилучшие результаты получаются при разведении мочи до удельного веса 1,015. Проба становится положительной при концентрации желчных кислот и солей выше 0,01 %.

Проба Петтенкофера

Необходимые реактивы

1. Раствор сахара.

2. Концентрированная серная кислота.

Ход исследования

К 10 мл мочи прибавляют небольшое количество раствора сахара и взбалтывают до образования пены. После этого добавляют по каплям концентрированную серную кислоту. При наличии желчных кислот пена становится пурпурно-красной.

Определение содержания уробилиноидов

В моче здорового человека содержатся следы уробилиногена, а за сутки выделяется не более 6 мг, у детей – не более 2 мг.

В свежевыпущенной моче содержится уробилиноген, который при стоянии мочи окисляется в уробилины. Все эти вещества являются производными билирубина и называются уробилиноидами.

Уробилиноиды образуются под действием ферментов бактерий и клеток слизистой оболочки кишечника из билирубина, выделившегося с желчью.

Определение уробилина имеет большое клиническое значение. Присутствие его в количествах, превышающих норму, может быть при гемолитических состояниях (таких как гемолитическая желтуха, гемоглобинурия, некоторые инфекции, например малярия, и др.), при заболеваниях печени (гепатитах, циррозе печени, отравлениях и пр.), при кишечных заболеваниях и лихорадочных состояниях, что связано с токсическим поражением печени. Большое диагностическое значение имеет исследование уробилина в моче при желтухах.

Полное отсутствие уробилина указывает на обтурационную желтуху. Повышение содержания уробилина обнаруживается при паренхиматозной и гемолитической формах желтухи.

Проба Шлезингера

Принцип метода

Появление флюоресценции уробилина за счет образовавшихся цинкуробилиновых комплексов.

Необходимые реактивы

1. Насыщенный спиртовой раствор ацетата цинка (10 г на 100 мл 96 %-ного спирта).

2. Раствор Люголя.

Ход исследования

К 4–5 мл мочи приливают равное количество реактива (реактив предварительно взбалтывают) и 1 каплю раствора Люголя. Оставляют на 10 мин, затем фильтруют. Пробирку просматривают на темном фоне в отраженном свете. При наличии уробилина образуется зеленая флюоресценция. Некоторые медикаменты, например атебрин, дают положительную пробу Шлезингера.

Для разграничения настоящей положительной пробы и медикаментозной прибавляют разведенную соляную или серную кислоту. Флюоресценция, вызванная уробилином, исчезает, медикаментозная остается.

Унифицированная проба Флоранса

Принцип метода

С НСl уробилин образует соединение, окрашенное в красный цвет.

Необходимые реактивы

1. Серная кислота концентрированная.

2. Диэтиловый эфир.

3. НСl концентрированная.

Ход исследования

Мочу в количестве 8–10 мл подкисляют в пробирке 8–10 каплями концентрированной серной кислоты, перемешивают, затем приливают 2–3 мл эфира и, закрыв пробирку пробкой, несколько раз осторожно пропускают эфир через слой мочи для экстрагирования уробилина. Затем эфирную вытяжку мочи наслаивают, лучше пастеровской пипеткой, на 2–3 мл концентрированной НСl, налитой в другую пробирку. При наличии уробилина на границе жидкостей образуется розовое кольцо. Интенсивность окраски пропорциональна количеству уробилина.

Проба настолько чувствительна, что даже в норме на границе между двумя жидкостями видно легкое розовое окрашивание. Этой пробой можно установить полное отсутствие уробилиноидов в моче.

Унифицированная проба Богомолова

Принцип метода

Уробилин с сульфатом меди образует соединение красно-розового цвета.

Необходимые реактивы

1. Меди сульфат, насыщенный раствор: 23 г CuSO₄ × 5H₂O растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

2. Хлороформ.

Ход исследования

К 10–15 мл мочи приливают 2–3 мл насыщенного раствора сульфата меди.

Если образуется помутнение, то прибавляют несколько капель концентрированной НСl до прояснения раствора. Через 5 мин приливают 2–3 мл хлороформа и, закрыв пробирку пробкой, несколько раз встряхивают.

Если хлороформ окрашивается в розовый цвет, то концентрация уробилина в моче выше нормальной.

Унифицированная бензальдегидная проба Нейбауэра

Проба основана на том, что уробилиногеновые тела с пара-диметиламинобензальдегидом (реактив Эрлиха) дают соединение красной окраски.

Необходимые реактивы

Реактив Эрлиха – 2 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 100 мл 20 %-ного раствора соляной кислоты.

Ход исследования

К 3–4 мл свежевыпущенной мочи, охлажденной до комнатной температуры, прибавляют 3–4 капли реактива Эрлиха (1 каплю на 1 мл мочи). Окрашивание жидкости в красный цвет в течение первых 30 с говорит об увеличенном содержании уробилиногена в моче; если окрашивание развивается по прошествии 30 с, то концентрация уробилина в моче нормальная, а если через 30 с окраска не развивается, то это может быть вариантом нормы или можно говорить о полном отсутствии уробилиногена в моче.

Билирубин мешает определению уробилиноидов, поэтому, если он обнаружен в моче, его следует предварительно удалить, осаждая хлоридом бария с последующим фильтрованием. Для этого к 10–12 мл мочи приливают 5–6 мл 10 %-ного раствора ВаСl₂ и фильтруют. Затем фильтрат проверяют на полноту осаждения билирубина и процедуру повторяют, если первое осаждение было неполным.

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Уробилиноген с парадиметиламинобензальдегидом образует комплекс, окрашенный в красный цвет; интенсивность окраски пропорциональна содержанию уробилиногена. Для восстановления уробилина в уробилиноген используют аскорбиновую кислоту и гидрат окиси железа. Для увеличения специфичности реакции добавляют ацетат натрия.

Необходимые реактивы

1. 4-диметиламинобензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. НСl концентрированная; реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтоватым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

3. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH₃COONa × 3H₂O (или 226 г CH₃COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °C. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

4. Аскорбиновая кислота.

5. Натр едкий, 0,5 г/л раствора.

6. Бария хлорид, 100 г/л раствора.

7. Фенолсульфофталеин (феноловый красный). Используют для приготовления калибровочного раствора.

8. Основной калибровочный раствор: 20 мг фенолсульфо-фталеина растворяют в 100 мл 0,5 г/л раствора едкого натра. Стабилен при хранении.

Рабочий калибровочный раствор готовят разведением основного раствора 0,5 г/л раствором едкого натра в 100 раз. Стабилен в течение недели с условием хранения при 20 °C.

Рабочий раствор содержит 0,2 мг фенолсульфофталеина в 100 мл и эквивалентен по окраске раствору уробилиногена – 0,345 мг на 100 мл. Точность приготовления можно проверить измерением оптической плотности раствора на спектрофотометре: при длине волны 562 нм оптическая плотность раствора должна быть 0,380–0,390.

Специальное оборудование – фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.

Исследование проводят в первые 2–3 ч после мочеиспускания. При наличии мутности мочу центрифугируют, а затем проводят качественное определение билирубина. Если обнаруживают билирубин, то 8 мл мочи смешивают с 2 мл 100 г/л раствора хлорида бария и фильтруют через бумажный фильтр. Конечный результат умножают на 1,25, чтобы внести поправку на разведение.

Ход исследования

100 мг аскорбиновой кислоты растворяют в 10 мл исследуемой мочи и помещают по 1,5 мл в 2 пробирки для опытной и холостой пробы. В пробирку с холостой пробой прибавляют 4,5 мл свежеприготовленной смеси одного объема раствора Эрлиха и двух объемов насыщенного раствора ацетата натрия.

В пробирку с опытной пробой прибавляют 1,5 мл раствора Эрлиха и немедленно приливают 3 мл насыщенного раствора ацетата натрия. Через 5 мин измеряют экстинкцию обеих проб против воды на фотоэлектроколориметре при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 см, на спектрофотометре при длине волны 562 нм.

Рабочий калибровочный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Результаты выражают в единицах Эрлиха (1 ед. соответствует 1 мг уробилиногена). Концентрацию уробилиногена выражают количеством единиц Эрлиха в 100 мл мочи (Едэ).

Расчет производят по формуле:

Едэ = Ео – Еx / Ек × 0,346 × 6,0 / 1,5 = Ео – Еx / Ек × 1,38,

где Е_о – экстинкция опытной пробы;

Е_х – экстинкция холостой пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

0,346 – концентрация уробилиногена в растворе (0,346 мг на 100 мл), окраска которого эквивалентна окраске калибровочного раствора фенолфталеина;

6,0 – объем пробы, мл;

1,5 – количество мочи в пробе, мл. Соотношение ингредиентов при определении уробилиногена в моче представлено в таблице 36.

Таблица 36

Соотношение ингредиентов (в мл) при определении уробилиногена в моче

Рекомендуется собирать мочу в посуду из темного стекла, так как при дневном свете окисление уробилиногена происходит значительно быстрее.

Для Расчета выделения уробилиногена за определенное время для исследования надо брать мочу из всего собранного за это время объема и, учитывая его, провести Расчеты по формуле:

Ео – Еx / Ек × 1,38 × V / 100,

где V – объем мочи, мл, выделенный за определенный промежуток времени;

1/100 – коэффициент для Расчета количества уробилиногена в 1 мл мочи.

Определение порфобилиногена

Унифицированный метод с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода

Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с парадиметиламинобензальдегидом с образованием окрашенного в красный цвет соединения. Для повышения специфичности реакции добавляют ацетат натрия. Соединения, дающие аналогичную реакцию с парадиметиламинобензальдегидом (уробилиноген, производные индола, скатола и др.), удаляют путем экстракции хлороформом и бутанолом, в которых ПБГ нерастворим.

Необходимые реактивы

1. 4-(диметиламино) – бензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).

2. Соляная кислота концентрированная.

3. Реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.

4. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH₃COONa × 3Н₂О (или 226 г CH₃COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °C. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.

5. Хлороформ.

6. Бутиловый спирт.

7. Бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0–5,0).

Ход исследования

Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. Смешивают в пробирке 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают. Измеряют рН индикаторной бумагой; рН должен быть в интервале 4,0–5,0.

Если рН меньше 4,0, то добавляют раствор ацетата натрия до установления нужного рН. Если окраска не развивается, результат считают отрицательным. При развитии розовой или красной окраски к пробе добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний слой остается бесцветным или слегка желтоватым, то результат следует считать отрицательным. Если окраска остается в слое над хлороформом, то 6–8 мл из окрашенного слоя переносят в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 1: 2 и встряхивают. Если фазы не сразу разделяются, то смесь центрифугируют при переходе окраски в слой бутилового спирта – результат отрицательный, если же окраска остается в исследуемом слое, то в исследуемой моче концентрация ПБГ превышает нормальную.

Если концентрация ПБГ в моче нормальна (до 2 мг/л), то проба отрицательная. ПБГ данным методом обнаруживают при концентрации выше 6 мг/л.

При хранении мочи более 3 ч при комнатной температуре положительная реакция может стать отрицательной. Это можно объяснить превращением порфобилиногена в порфирин и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2 ч, то хранить ее надо в холодильнике при 4 °C, доведя рН мочи до 6,0–7,0, так как в этих условиях порфобилиноген стабилен длительное время.

Определение крови и кровяных пигментов

Кровь можно обнаружить в моче микроскопически (см. «Микроскопия осадка мочи») и с помощью химических реакций.

Химические реакции на кровь

Принцип методов

Каталитическое свойство гемоглобина и окисление веществ в присутствии окислителей (перекись водорода, озонированного скипидара и др.) с образованием цветной реакции.

Бензидиновая проба

Необходимые реактивы

1. Основной бензидин.

2. Раствор уксусной кислоты 50 %-ный, перед употреблением немного бензидина (на кончике ножа) растворяют в 5 мл уксусной кислоты.

3. Раствор перекиси водорода 3 %-ный или (лучше) пергидроль, разведенный в 10 раз.

Ход исследования

К 3–5 мл мочи добавляют 2–3 капли раствора бензидина в уксусной кислоте и столько же перекиси водорода, перемешивают. Положительная реакция на кровь дает зеленое или сине-зеленое окрашивание в течение первых 2 мин. Окрашивание, наступившее после 2 мин, не учитывается. Вместо перекиси водорода можно пользоваться перекисью бария. 0,025 г основного бензидина и 0,1 г перекиси бария растворяют в 5 мл 50 %-ной уксусной кислоты. Реактив готовят непосредственно перед употреблением.

Ход исследования

К 3–5 мл мочи добавляют 2–4 капли реактива, отмечают изменение цвета в первые 2 мин. В положительном случае появляется сине-зеленое окрашивание.

Бензидиновая проба считается наиболее чувствительной.

Проба с гваяковой смолой (Вебера – Ван-Деена)

Необходимые реактивы

1. Ледяная или 80 %-ная уксусная кислота.

2. Спирт 96 %-ный.

3. Эфир.

4. Свежеприготовленная гваяковая настойка: растертую в порошок гваяковую смолу, взятую на кончике ножа, всыпают в сухую пробирку, приливают 2–6 мл спирта, дают отстояться, для реакции берут отстоявшуюся жидкость без осадка.

5. 3 %-ная перекись водорода.

6. Хлороформ.

Ход исследования

3–5 мл мочи разводят уксусной кислотой и приливают равное количество эфира, тщательно размешивают и сливают в пробирку. Дают отстояться. Эфирный слой переносят в другую чистую пробирку, приливают 15–20 капель гваяковой настойки, 10–15 капель перекиси водорода. При наличии крови тотчас или через 1–3 мин появляется синее или фиолетовое окрашивание.

Упрощенная гваяковая проба

Небольшое количество мочи наносят на бумажный фильтр, положенный на чашку Петри. На него накапывают поровну (по 2–3 капли) уксусной кислоты, гваяковой настойки и перекиси водорода. В присутствии крови появляется сине-зеленое окрашивание.

Пирамидоновая проба

Необходимые реактивы

1. 5 %-ный спиртовой раствор пирамидона (амидопирина).

2. 30 %-ный раствор уксусной кислоты.

3. Перекись водорода.

Ход исследования

Берут равные количества мочи и раствора пирамидона (по 2–3 мл), прибавляют по 10–12 капель уксусной кислоты и перекиси водорода.

В присутствии крови появляется сине-фиолетовое окрашивание. Интенсивность и время появления окраски зависят от количества крови. Отрицательный ответ дается через 2–3 мин.

Определение гемоглобина

Для диагноза гемоглобинурии необходимо доказать наличие гемоглобина в моче одной из химических проб.

При отсутствии эритроцитов в осадке (при микроскопическом исследовании) желательно спектроскопически определить природу пигмента.

Определение гемосидерина. Реакция на берлинскую лазурь

Необходимые реактивы