Читать книгу "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Микроскопическое исследование

Микроскопическое исследование мокроты проводят в свежих неокрашенных и фиксированных окрашенных препаратах. При приготовлении препаратов необходим тщательный отбор материала. Прокаленной и остуженной лопаточкой или металлической петлей из мокроты выбирают поочередно все подозрительные зернышки, кровяные прожилки, комочки и приготавливают из них препараты, помещая на предметное стекло.

Нативный препарат

Нативный препарат готовят из выбранных элементов мокроты. Препаровальными иглами помещают комочек мокроты на середину предметного стекла и накрывают покровным стеклом.

Чистым концом препаровальной иглы слегка надавливают на покровное стекло, делая препарат более плоским, полупрозрачным. При этом следят, чтобы мокрота не выходила за края покровного стекла. Готовят не менее четырех нативных препаратов из различных участков мокроты.

Микроскопируют вначале под малым увеличением (обзорная микроскопия), а затем под большим увеличением.

Элементы мокроты, которые обнаруживаются в нативном препарате, можно разделить на 3 основные группы: клеточные, волокнистые и кристаллические образования.

Клеточные элементы

Плоский эпителий – это слущенный эпителий слизистой оболочки ротовой полости, носоглотки, надгортанника и голосовых связок, имеющий вид тонких клеток с небольшим пиктоническим пузырчатым ядром и гомогенной цитоплазмой. Одиночные клетки плоского эпителия встречаются всегда, в большом количестве – при примеси слюны или воспалительных явлениях в ротовой полости.

Цилиндрический эпителий – эпителий слизистой оболочки бронхов и трахеи. Имеет вид удлиненных клеток, один конец которых, обращенный в просвет бронха, расширен, другой заострен и сужен, содержит овальное ядро. Клетки снабжены венчиком из ресничек (обычно реснички видны только в очень свежей мокроте). Цилиндрический эпителий иногда видоизменяется, приобретает веретенообразную форму, при этом один из концов вытягивается в длинную нить. Встречается в больших количествах при остром приступе бронхиальной астмы, остром бронхите, острых катаральных поражениях верхних дыхательных путей.

Макрофаги – клетки костномозгового происхождения, имеют овальную или круглую форму, размер от 15 до 20–25 мкм, обычно одно (иногда больше) эксцентрично расположенное ядро, вакуолизированную цитоплазму, содержащую различные включения темно-бурого цвета. Встречаются при различных воспалительных процессах в бронхах и легочной ткани (пневмонии, бронхитах). Макрофаги с явлениями жировой дистрофии – липофаги («жировые шары»), окрашиваемые Суданом 3 в оранжевый цвет, встречаются при раке легкого, туберкулезе, эхинококкозе, актиномикозе. Макрофаги, содержащие гемосидерин, сидерофаги (старое название «клетки сердечных пороков»), имеют в цитоплазме золотисто-желтые включения. С достоверностью их определяют реакцией на берлинскую лазурь.

Определение сидерофагов. Кусочек мокроты помещают на предметное стекло, прибавляют 1–2 капли 2–5 %-ного раствора хлористо-водородной кислоты и 1–2 капли 5 %-ного раствора желтой кровяной соли (железисто-синеродистого калия). Гемосидерин, лежащий внутриклеточно, окрашивается в голубой и сине-зеленый цвета.

Сидерофаги встречаются в мокроте у больных с застойными явлениями в малом круге кровообращения, при инфаркте легкого, синдроме Гудпасчера, идиопатическом легочном гемосидерозе.

Пылевые макрофаги (кониофаги) распознаются по содержанию в цитоплазме частиц угля или пыли иного происхождения. Эти клетки располагаются в виде тяжей и скоплений в слизистой части мокроты. Их обнаружение имеет значение в диагностике пневмокониозов и пылевого бронхита.

Опухолевые клетки чаще представлены в виде клеток плоскоклеточного (с ороговением или без него) железистого рака или аденокарциномы. Нередко возникают трудности в разграничении опухолевых клеток с метаплазированными клетками плоского или цилиндрического эпителия. Опухолевые клетки характеризуются полиморфизмом (могут быть гигантских размеров), увеличением и гиперхромией ядра с нуклеолами и митозами, базофилией цитоплазмы, способностью к фагоцитозу. При этом достоверно лишь обнаружение конгломератов, комплексов опухолевых клеток, расположенных на волокнистой основе. Подозрения на опухолевые клетки при изучении нативного препарата подтверждаются тщательным цитологическим исследованием окрашенных препаратов. При этом более информативно исследование бронхиальных смывов и плеврального экссудата.

Лейкоциты – круглые клетки диаметром от 10–12 до 15 мкм с плохо различимым ядром, равномерной обильной зернистостью. Встречаются почти в каждой разновидности мокроты: в слизистой – единичные, а в гнойной сплошь покрывают все поле зрения (иногда среди лейкоцитов можно выделить эозинофилы – крупные лейкоциты с отчетливой и темной зернистостью).

Эритроциты – круглой или слегка овальной формы клетки, желтоватого цвета (свежие) или бесцветные (измененные и потерявшие пигмент), диаметром меньше лейкоцитов, никогда не имеют зернистости в протоплазме, двухконтурные (клетка-мишень), несколько преломляющие свет. Единичные эритроциты могут встречаться в любой мокроте; в большом количестве обнаруживаются в мокроте, окрашенной кровью (легочное кровотечение, инфаркт легкого, застойные явления в легких и др.).

Волокнистые образования

Эластические волокна имеют вид извитых, блестящих, преломляющих свет тонких нитей, собранных в пучки, иногда повторяющих строение альвеолярной ткани. Как правило, эти волокна располагаются на фоне лейкоцитов и детрита. Указывают на распад легочной ткани и обнаруживаются при туберкулезе, абсцессе, новообразованиях легких. Иногда при этих заболеваниях в мокроте встречаются коралловые волокна – грубые, ветвящиеся образования с бугристыми утолщениями вследствие отложения на волокнах жирных кислот и мыл, а также обызвествленные эластические волокна – грубые, пропитанные слоями извести палочковидные образования.

Для обнаружения эластических волокон к мокроте добавляют 2–3 объема 10 %-ного раствора едкой щелочи и кипятят до растворения (эластические волокна при этом не растворяются). После охлаждения в жидкость добавляют 5–7 капель 1 %-ного спиртового раствора эозина и центрифугируют. Осадок исследуют под микроскопом. При нахождении волокон нужно быть осторожным, чтобы не спутать их с эластическими волокнами из пищи.

Придавать диагностическое значение можно лишь тем волокнам, которые встречаются группами (пучками) и обнаруживают альвеолярное расположение.

Эластические волокна обнаруживаются в мокроте на поздней стадии деструктивного процесса и только в том случае, если каверна дренируется бронхом. Их обнаруживают при туберкулезе, абсцессе, эхинококкозе, опухолях легких.

Фибринозные волокна – тонкие волоконца, которые заметно осветляются в препарате при добавлении 30 %-ного раствора уксусной кислоты, растворяются при добавлении хлороформа. Встречаются при фибринозном бронхите, туберкулезе, актиномикозе, крупозной пневмонии.

Спирали Куршмана – уплотненные, закрученные в спираль образования из слизи. Наружняя рыхлая часть называется мантией, внутренняя, плотно закрученная часть – центральной осевой нитью. Изредка обнаруживаются отдельно только тонкие центральные нити без мантии и спирально извитые волоконца без центральной нити. Спирали Куршмана рассматриваются под малым увеличением микроскопа. При исследовании под большим увеличением по периферии спиралей можно видеть лейкоциты, кристаллы Шарко – Лейдена. Спирали Куршмана наблюдаются при легочной патологии, сопровождающейся бронхоспазмом (бронхиальной астме, астматических бронхитах, опухолях бронхов).

Кристаллические образования

Кристаллы Шарко – Лейдена встречаются в мокроте вместе с эозинофилами и имеют вид блестящих, гладких, бесцветных, различной величины ромбов, иногда с тупыми концами. Образование кристаллов Шарко – Лейдена связывают с распадом эозинофилов, считают их продуктом кристаллизации белков.

Часто свежевыделенная мокрота не содержит кристаллов Шарко – Лейдена, они образуются в ней в закрытой посуде через 24–28 ч. Характерно присутствие этих кристаллов в мокроте при бронхиальной астме даже не на высоте приступа, а в межприступный период. Кроме этого, они встречаются при глистных поражениях легких, реже – при крупозной пневмонии, различных бронхитах.

Кристаллы гематоидина имеют форму ромбов и иголок (иногда пучков и звезд) золотисто-желтого цвета. Эти кристаллы являются продуктом распада гемоглобина, образуются в глубине гематом и обширных кровоизлияний, в некротизированной ткани. В препаратах кристаллы гематоидина располагаются на фоне детрита, эластических волокон. Их следует отличать от зерен гемосидерина – золотисто-желтых включений в цитоплазме макрофагов, дающих положительную реакцию на берлинскую лазурь. Они диагностируются при абсцессе и гангрене легкого.

Кристаллы холестерина – бесцветные, четырехугольной формы, с обломанным ступенеобразным углом; образуются при распаде жироперерожденных клеток, задержке мокроты в полостях и располагаются на фоне детрита (туберкулез, новообразования, эхинококкоз, абсцесс и т. д.).

Кристаллы жирных кислот в виде длинных тонких игл и капелек жира содержатся часто в гнойной мокроте (пробка Дитриха); образуются при застое мокроты в полостях (абсцесс, бронхоэктазы).

Окрашенные препараты

Собранные из 4–6 разных мест гнойные частицы мокроты помещают на стекло, тщательно растирают другим предметным стеклом до гомогенной массы, высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.

Препараты окрашивают тем или иным способом и микроскопируют с иммерсионной системой. Окраска по Граму – самый распространенный метод окраски всех видов материала, полученного от больного для быстрого установления инфекционного агента.

Мокроту считают пригодной для культивирования и идентификации возбудителя, если в мазке при малом увеличении микроскопа обнаруживается более 25 лейкоцитов и менее эпителиальных клеток в поле зрения.

Окраску препаратов для изучения клеток крови в мокроте, окраску по Романовскому – Гимзе, используют главным образом для выявления эозинофилов. Для этого используют 0,5 %-ный спиртовой раствор эозина, 1 %-ный водный раствор метиленового синего. На теплое стекло (после фиксации над пламенем) наливают раствор эозина и окрашивают в течение 3 мин. Затем мазок промывают водой и докрашивают в течение нескольких секунд метиленовым синим. Краску смывают водой, препарат высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. На синем фоне четко выделяется красная зернистость эозинофилов.

Эозинофилы в мокроте в отличие от эозинофилов крови нередко имеют круглое ядро, вид тяжей, скоплений с рассыпанными вокруг эозинофильными зернами. Их обнаружение рассматривается как один из важных диагностических признаков бронхиальной астмы, астматического бронхита. Однако эозинофилия мокроты свойственна также лекарственным и эозинофильным пневмониям, синдрому Леффлера.

При этой окраске удается дифференцировать нейтрофилы, лимфоциты, базофилы, эритроциты, однако необходимость их изучения возникает редко.

Для выявления клеток злокачественных новообразований мокроту окрашивают одним из способов, применяемых для окраски мазков крови.

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Для бактериоскопического исследования мазки мокроты приготавливают, растирая тщательно выбранный кусочек между двумя предметными стеклами таким образом, чтобы мазок занял не более 2/3 поверхности стекла. Препараты высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Окраску мазков мокроты по Цилю – Нильсену используют для выявления кислотоустойчивых бактерий.

Метод обнаружения микобактерий туберкулеза

Микобактерии туберкулеза обнаруживают в мазке, окрашенном по Цилю – Нильсену. Окрашивают карболовым фуксином– Циля (1 г основного фуксина растирают в ступке с 10 мл 96 %– ного этилового спирта; приготовленный раствор вливают в 90 мл 7%– ного раствора фенола, тщательно перемешивают; хранят в посуде из темного стекла). Кроме того, здесь необходим 3 %-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты (3 мл концентрированной хлористо-водородной кислоты добавляют к 97 мл 96 %-ного этилового спирта) и 1 %-ный водный раствор метиленового синего. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, которая должна быть ýже предметного стекла. Наливают 2–3 мл карболового фуксина Циля. Держа препарат пинцетом, подогревают над пламенем горелки до трехкратного отхождения паров. При этом растворяется жировосковая капсула микобактерий, и они воспринимают красную краску.

Остужают, бумажку сбрасывают, препарат промывают водой и полностью обесцвечивают, погружая стекло в 3 %-ный спиртовой раствор хлористо-водородной кислоты. Обесцвечиваются все части мокроты, кроме кислото– и спиртоустойчивых микобактерий.

Промывают водой и докрашивают в течение 30 с метиленовым синим. При этом все части мокроты окрашиваются в синий цвет, кроме микобактерий туберкулеза.

Вновь промывают препарат водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой. На синем фоне хорошо различимы микобактерии туберкулеза красного цвета. Они полиморфны, имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины, могут быть колбовидной, пунктирной формы, располагаться поодиночке или группами.

Метод флотации Потенджера

Микобактерии туберкулеза неравномерно распределяются в мокроте, при количестве менее 100 тыс. в 1 мл обнаружить их в препарате не всегда удается. Методы накопления позволяют сконцентрировать микобактерии. Для их концентрации чаще всего пользуются методом флотации. В основе метода лежит адсорбирование микобактерий туберкулеза бензином, толуолом или ксилолом, которые всплывают на поверхности более плотной жидкости. Для этого используют 0,5 %-ный раствор едкого натра (или калия); бензин (ксилол, толуол), дистиллированную воду.

Свежеприготовленную мокроту помещают в стерильную узкогорлую бутылку вместимостью 200–250 мл с хорошо пригнанной пробкой. Для флотации достаточно 10–15 мл мокроты. Ее заливают двойным объемом щелочи и энергично встряхивают в течение 10–15 мин в аппарате для встряхивания. При этом мокрота гомогенизируется, растворяются слизь и гной, освобождаются микобактерии. Затем в эту же бутылку приливают 1 мл бензина и 100 мл дистиллированной воды для разжижения мокроты. Снова встряхивают в течение 10–15 мин для эмульгирования бензина. Доливают дистиллированную воду до горлышка бутылки. Смесь оставляют при комнатной температуре на 40–50 мин. За это время капельки бензина с адсорбированными на них микобактериями всплывают, образуя в горлышке бутылки сливкообразное флотационное кольцо.

Препараты готовят на новых обезжиренных предметных стеклах, которые предварительно подогревают до 60 °C на воздушной бане. На подогретые стекла пастеровской пипеткой наносят капли из флотационного кольца, высушивают и снова наносят капли на то же место. Каждую последующую каплю наносят на высохшую предыдущую каплю. Таким образом все флотационное кольцо переносят на предметные стекла. Готовят 3–4 препарата, фиксируют и окрашивают по Цилю – Нильсену.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на том, что туберкулезные микобактерии, окрашенные ауромином, люминесцируют под влиянием ультрафиолетовых лучей в виде светящихся золотистых палочек (метод менее трудоемкий и более быстрый, чем предыдущие).

Для диагностики туберкулеза легких, кроме бактериоскопии мокроты, необходимо исследовать бронхиальные смывы, промывные воды желудка, плевральный экссудат, используя методы бактериоскопии, а также посев материала на специальные питательные среды, метод ПЦР (полимеразная цепная реакция).

Окраска препаратов по Граму

В препаратах, окрашенных по Граму, обнаруживают пневмококки, клебсиеллы, стрептококки, стафилококки, друзы актиномицета и другие микроорганизмы.

Для этого используют:

1) карболовый раствор генцианового фиолетового (1 г генцианового фиолетового растирают в ступке с 10 мл 96 %-ного этилового спирта; раствор вливают в 90 мл 2%-ного раствора фенола, хорошо перемешивают; хранят в бутылке из темного стекла);

2) раствор Люголя (1 г йода и 2 г йодата калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды; после растворения навески доливают 295 мл дистиллированной воды);

3) 96 %-ный этиловый спирт;

4) фуксин Пфейффера (10 мл карболового фуксина Циля смешивают с 90 мл дистиллированной воды).

Мазок фиксируют над пламенем горелки. На зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианового фиолетового на 1,5–2 мин. Все части препарата окрашиваются в фиолетовый цвет. Снимают бумажку и заливают мазок раствором Люголя на 2 мин. При этом фиолетовая окраска закрепляется на грамположительной флоре. Сливают раствор Люголя. Препарат обесцвечивают 96 %-ным этиловым спиртом до сероватого цвета. Грамположительная флора фиолетовую окраску сохраняет. Промывают водой и докрашивают фуксином Пфейффера в течение 10–15 с. Все части препарата, кроме грамположительной флоры, окрашиваются в красный цвет. Снова промывают водой и высушивают на воздухе.

Микроскопируют с иммерсионной системой. На красном фоне четко видны фиолетовые грамположительные микроорганизмы. Грамотрицательная флора окрашивается в красный цвет.

Пневмококки представляют собой попарно расположенные грамположительные округлые или вытянутые диплококки, окруженные капсулой. Клебсиеллы имеют вид толстых грам-отрицательных палочек различной величины с закругленными концами, расположенных попарно и окруженных капсулой. Стрептококки представляют собой круглые, мелкие, расположенные цепочками разной длины грамположительные кокки. Находятся внутри лейкоцитов и среди них. Стафилококки – круглые грамположительные кокки различной величины, располагаются единично или группами. Часто встречаются одновременно со стрептококками.

Друзы актиномицета имеют вид сплетений темно-фиолетового цвета. Каждая нить сплетения заканчивается колбовидным утолщением, окрашенным в красный цвет.

Методы ускоренной диагностики. Путем применения молекулярно-генетических методов возможно получение анализов в течение трех суток с момента поступления образца. Тест-системы основаны на амплификации генов возбудителя туберкулеза. Их применение позволяет подтвердить принадлежность возбудителя к виду M. Tuberculosis, а также наличие/отсутствие мутации у выделенного штамма, которая можен привести к устойчивости к изониазиду и рифампицину.

Изучение грибковой флоры в мокроте

Иногда в окрашенном или неокрашенном препарате можно встретить различные виды грибов.

Дрожжевые грибы рода Candida – почкующиеся клетки и короткие почкующиеся нити псевдомицелия (клетки круглой или овальной формы, псевдомицелий – членистый, ветвистый, споры на нем располагаются мутовками). Наличие этих грибов в мокроте свидетельствует об их активизации, но еще не дает основания для диагноза кандидомикоза, который ставится при учете клинических данных и повторных обнаружениях грибов.

Дрожжевой гриб Criptococcus – возбудитель бластомикоза, имеет вид круглых, частью почкующихся клеток с довольно толстыми двухконтурными стенками.

Плесневый гриб из рода Aspergillus имеет вид обрывков широких нитей мицелия и круглых темно-зеленых спор.

Лучистый гриб Actinomyces встречается в мокроте при поражении легких актиномикозом. Для его обнаружения из мокроты выделяют очень мелкие желтоватые и серовато-белые с зеленым оттенком зернышки, представляющие друзы лучистого гриба, и исследуют под микроскопом. При большом увеличении центральная часть друзы состоит из густого компактного сплетения тонких ветвящихся нитей мицелия с пигментированными зернами, по периферии клубок мицелия окружен зоной из булавовидных образований со вздутиями на концах, сильно преломляющих свет. Эти образования расположены частоколом и сообщают друзе лучистое строение. При окраске по Граму нити мицелия окрашиваются в синий цвет, а колбы – в розовый; при окраске по Цилю – Нильсену колбы приобретают красный цвет. Решающую роль в диагностике поражения легких при глубоких микозах играют посев мокроты (и бронхиального содержимого) на специальные питательные среды и серологические методы диагностики.

Химическое исследование

При хронических неспецифических заболеваниях легких отмечается корреляция между содержанием общего белка и сиаловой кислоты в мокроте и активностью воспалительного процесса. Широкое распространение имеет метод альвеолярного лаважа, позволяющий изучать секрет непосредственно из альвеол и бронхов.

В лаважной жидкости определяются число и состав форменных элементов, бактерий, белков. Метод особенно важен для диагностики генетически обусловленных заболеваний легких, на долю которых в структуре причин хронических неспецифических заболеваний легких приходится 10 %. У здоровых лиц в бронхиальном секрете содержатся альбумин, IgG, секреторный IgA, трипсин, α-1-антитрипсин, лизоцим, интерферон, лактоферрин. Появление IgE в бронхиальном секрете характерно для аллергического поражения бронхов (при бронхиальной астме, астматическом бронхите).

Отсутствие в лаважной жидкости IgA свидетельствует об иммунодефицитном состоянии – генетическом или приобретенном (например, при атрофическом бронхите). Для генетического дефицитосекреторного IgA характерно генерализованное поражение легких, а также слизистых кишечника и мочевой системы. При дефиците α-1-антитрипсина – мощного эндогенного ингибитора протеолитических ферментов – слизистые бронхов и альвеол легкого повреждаются протеазами нейтрофилов, альвеолярных макрофагов и бактерий.

Таблица 47

Характеристика мокроты при различной легочной патологии

Этот генетически детерминированный дефицит играет важную роль в патогенезе хронических неспецифических заболеваний легких и первичной эмфиземы легких. При другом наследственном заболевании – муковисцидозе – за счет потери с потом натрия и хлоридов эпителий бронхов и пищеварительных желез продуцирует крайне вязкую слизь, обтурирующую бронхи и протоки поджелудочной железы. Муковисцидоз проявляется хроническими неспецифическими заболеваниями легких с бронхоэктазами, эмфиземой легких, а также синдромом нарушения всасывания.

В лаважной жидкости определяются также сурфактант и его метаболиты. Сурфактант – фосфолипопротеин, называемый антиателектатическим фактором, – обладает поверхностно-активными свойствами; он предотвращает «слипание», облитерацию альвеол. Нарушение синтеза сурфактанта в альвеолярном эпителии (генетически обусловленное или приобретенное) и потеря сурфактанта при тяжелых воспалительных процессах в легких индуцируют ателектаз и являются одной из причин хронических неспецифических заболеваний легких. Мокрота при раздичных заболеваниях органов дыхания отличается (табл. 47).

По изучению клеточного состава бронхиального секрета судят о фагоцитарной способности легочной ткани (альвеолярных макрофагов).

Выделяют варианты хронических неспецифических заболеваний легких, связанные с генетическим дефектом альвеолярных макрофагов: снижением фагоцитоза, потерей способности продуцировать эндогенный интерферон.