Читать книгу "Анализы. Актуальные сведения по лабораторным исследованиям под рукой"

Глава 11
Исследование спинномозговой жидкости

Спинномозговая жидкость образуется в сосудистых сплетениях желудочков головного мозга путем пропотевания плазмы крови через стенки сосудов, а также секретируется клетками сосудистых сплетений. Из желудочков она поступает в субарахноидальное пространство и цистерны мозга. У взрослого человека одновременно в субарахноидальном пространстве в желудочках мозга циркулирует 110–160 мл ликвора, в спинномозговом канале – 50–70 мл. Ликвор образуется непрерывно со скоростью 0,2–0,8 мл/мин, что зависит от внутричерепного давления. В сутки у здорового человека образуется 350–1150 мл спинномозговой жидкости. Исследование спинномозговой жидкости имеет важное диагностическое значение при заболеваниях центральной нервной системы и мозговых оболочек.

Правила получения ликвора

Для получения ликвора чаще всего используют люмбальную, субокципитальную и вентрикулярную пункции. Во время люмбальной пункции необходимо первые 5 капель удалить, затем собрать 3 порции асептической жидкости в стерильные пробирки, плотно их закрыть и оформить направление в клиническую лабораторию. Для пересылки материала используют изотермальные ящики, грелки, термос или другую тару, где поддерживается температура около 37 °C. Доставляется немедленно. Ликворное давление измеряют при пункции в каплях в минуту или миллиметрах ртутного cтолба. Ликвор исследуют клинически, биохимически и бактериологически. Основные показатели церебральной жидкости:

1) общий белок – 0,15–0,45 г/л;

2) альбумин – 0,1–0,2 г/л;

3) глюкоза – 3,6–5,2 ммоль/л;

4) лактат – 1,1–1,6 ммоль/л;

5) магний – 1,0–1,5 ммоль/л;

6) хлориды – 115–130 ммоль/л;

7) лимфоциты – менее 3;

8) лейкоциты – менее 8.

Макроскопическое исследование

Цвет. Нормальная спинномозговая жидкость бесцветна. По виду она не отличается от воды, поэтому ее цвет определяют путем сравнивания с дистиллированной водой, налитой в пробирку такого же диаметра. Зеленовато-желтый цвет ликвора отмечается при гнойном менингите либо при прорыве абсцесса. Темно-вишневый цвет спинномозговая жидкость приобретает при гематоме или кисте.

Мутность спинномозговой жидкости может быть обусловлена присутствием в ней эритроцитов, лейкоцитов и микроорганизмов. Иногда спинномозговая жидкость окрашена в красноватый цвет от крови. Примесь крови может быть случайной, вызванной травмой при проколе, и в связи с патологическим процессом. При центрифугировании полученной жидкости образуется кровянистый осадок, а жидкость над осадком остается бесцветной.

Микроскопическое исследование

Определение количества лейкоцитов

При помощи микроскопа и счетной камеры подсчитывают число лейкоцитов в ликворе после разрушения эритроцитов.

Необходимый реактив

10 %-ная уксусная кислота, подкрашенная метиловым фиолетовым, ледяной уксусной кислоты, – 5 мл, воды – до 50 мл, метилового фиолетового – 0,1 мл.

Специальное оборудование

Микроскоп, камера Фукса – Розенталя, смесители для подсчета лейкоцитов.

В меланжер для подсчета лейкоцитов набирают до метки «I» 10 %-ной соляной кислоты, подкрашенной метиловым фиолетовым, до метки «II» набирают спинномозговую жидкость. Раствор уксусной кислоты гемолизирует эритроциты и подкрашивает в синий цвет лейкоциты, что облегчает их подсчет. После встряхивания запоминают содержание меланжера, предварительно выпустив первую каплю в камеру Фукса – Розенталя, которая состоит из 16 больших квадратов. Глубина камеры 0,2 мм, общий объем 3,1 мкл. При отсутствии смесителя допустимо смешивание ликвора с реактивом: на 10 капель ликвора 1 капля реактива. Лейкоциты считают во всех 256 квадратах и полученное число делят на 3,2 (объем камеры). Результат соответствует количеству форменных элементов в 1 мкл ликвора. Кроме этого, полученный результат необходимо разделить на 10 (степень разведения ликвора).

Нормальное содержание лейкоцитов в 3 мл спинномозговой жидкости следующее:

1) из желудочков мозга – 0–3 клетки;

2) субокципитальной пункции – 0–2 клетки;

3) люмбальной пункции – 7–10 клеток.

У детей цитоз выше, чем у взрослых, и с возрастом постепенно падает. У ребенка до 3 месяцев в 1 мл содержится 20–23 летки, к 1 году – 14–15 клеток, к 10 годам – 4–5 клеток.

Повышенный цитоз наблюдают при воспалительных поражениях мозговых оболочек и органических поражениях вещества мозга.

Подсчет эритроцитов

Производится в камере Горяева или Фукса – Розенталя. Эритроциты могут быть обнаружены в прозрачной, бесцветной жидкости. При наличии 900–1000 эритроцитов в 1 мкл наблюдается помутнение жидкости, при наличии 2000 эритроцитов появляется розовое окрашивание, при наличии 4–5 тыс. эритроцитов жидкость приобретает геморрагический характер.

Для диагностики внутричерепной геморрагии значение имеет не только абсолютное количество эритроцитов, но и нарастание их числа при повторном исследовании.

Дифференциация клеточных элементов в счетной камере

В счетной камере с сухой системой (окуляр 15° или 10°, объектив – 40°) можно дифференцировать почти все элементы. Реактив окрашивает все ядра клеток в красновато-фиолетовый цвет, цитоплазма остается бесцветной. При этом обращают внимание на величину клеток, форму и расположение ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение, наличие включений в цитоплазме. Этот метод используется наиболее часто.

Дифференциация клеточных элементов в окрашенных препаратах

Окраска по Розиной. Жидкость центрифугируют в течение 7–10 мин. Надосадок сливают легким покачиванием его по поверхности стекла, через 1–2 мин жидкость сливают. При небольшом лейкоцитозе (менее 50 мкл) осадок распределяют на участке 1 см²; при лейкоцитозе, превышающем 100 в 3 мкл, – на участке 1,5–2 см²; при лейкоцитозе 500 в 3 мкл – на участке 2–3 см². При очень большом лейкоцитозе осадок распределяют по всему предметному стеклу. Мазок высушивают в сушильном шкафу. Затем фиксируют метанолом в течение 1–2 мин и окрашивают по Романовскому: тонкий препарат с небольшим цитозом – 6–7 мин, с большим цитозом – 10–12 мин. Затем краску сливают, мазок промывают дистиллированной водой и высушивают. Если ядра имеют бледно-голубой цвет, мазок докрашивают еще в течение 1–2 мин.

Окраска по Везновой. Осадок выливают на стекло, слегка покачивая его, жидкость равномерно распределяют по поверхности. Мазок высушивают при комнатной температуре в течение суток, фиксируют метиловым спиртом в течение 5 мин, покрывают специальными красителями, окрашивают в течение 1 ч. Если клетки бледны, докрашивают неразведенной краской под контролем микроскопии в течение 2–10 мин. Чем больше форменных элементов в ликворе, особенно при наличии крови, тем больше надо дополнительно окрашивать.

Окраска по Алексееву. На высохший, но не фиксированный препарат наносят 8–10 капель красителя по Романовскому. Той же пипеткой осторожно распределяют краску на весь препарат и оставляют на 30 с. Затем добавляют на препарат 12–20 капель дистиллированной воды, нагретой до 40–60 °C. Соотношение капель краски и воды должно быть 1: 2. Помешивают краску с водой и оставляют на 3 мин. Смывают краску струей дистиллированной воды, сушат препарат фильтровальной бумагой и микроскопируют. Метод применяется при срочном цитологическом исследовании.

Морфология клеточных элементов в спинномозговой жидкости

Лимфоциты по величине сходны с эритроцитами. При дифференцировании клеток в камере лимфоциты, окрашенные фуксином, имеют крупное ядро и узкий неокрашенный ободок цитоплазмы. В нормальной жидкости содержится 8–10 клеток. Количество их увеличивается при опухолях центральной нервной системы. Лимфоциты встречаются при хронических воспалительных процессах в оболочках (туберкулезном менингите, цистицеркозном арахноидите).

Плазматические клетки. Клетки крупнее лимфоцитов, ядро крупное, эксцентрично расположенное, большое количество цитоплазмы при сравнительно небольшом размере ядра (размер клеток – 6–12 мкм). Плазматические клетки обнаруживаются только в патологических случаях при длительно текущих воспалительных процессах в мозге и оболочках, при энцефалитах, туберкулезном менингите, цистицеркозном арахноидите и других заболеваниях, в послеоперационном периоде, при вялотекущем заживании раны.

Тканевые моноциты. Размер клеток – от 7 до 10 мкм. В нормальной жидкости иногда могут встречаться в виде единичных экземпляров. Обнаруживаются после оперативного вмешательства на центральной нервной системе, при длительно текущих воспалительных процессах в оболочках. Наличие тканевых моноцитов говорит об активной тканевой реакции и нормальном заживлении раны.

Макрофаги. Могут иметь ядра различной формы, чаще ядро расположено на периферии клетки, цитоплазма содержит включения и вакуоли.

Величина – от 7 до 17 мкм, иногда – 20–30 мкм. В нормальном ликворе макрофаги не встречаются. Наличие макрофагов при нормальном цитозе наблюдают после кровотечения или при воспалительном процессе. Как правило, они встречаются в послеоперационном периоде, что имеет прогностическое значение и говорит об активной санации ликвора.

Зернистые шары. Клетки с жировой инфильтрацией – макрофаги с наличием в цитоплазме капель жира. В счетной камере они имеют различную величину, форму, окрашены в темно-коричневый цвет, ядра клеток не видны.

В окрашенных препаратах клетки имеют небольшое периферически расположенное ядро и крупноячеистую цитоплазму. Величина ячеек различна и зависит от включенных капель жира. Зернистые шары обнаруживаются в патологической жидкости, полученной из мозговых кист в очагах распада мозговой ткани, при опухолях.

Нейтрофилы. В камере идентичны по виду нейтрофилам периферической крови. Наличие в ликворе нейтрофилов даже в минимальных количествах указывает или на бывшую, или на имеющуюся воспалительную реакцию.

Присутствие измененных нейтрофилов указывает на затухание воспалительного процесса.

Эозинофилы. Определяют по имеющейся равномерной, блестящей зернистости. Эозинофилы встречаются при субарахноидальных кровоизлияниях, менингитах, туберкулезных и сифилитических опухолях мозга.

Эпителиальные клетки. Эпителиальные клетки, ограничивающие подпаутинное пространство, встречаются редко. Это довольно крупные круглые клетки с небольшими круглыми или овальными ядрами. Обнаруживаются при новообразованиях, иногда при воспалительных процессах.

Опухолевидные клетки и комплексы. Их находят в камере и окрашенном препарате. Злокачественные клетки могут относиться к следующим видам опухолей:

1) медулобластома;

2) спонгиобластома;

3) астроцитома;

4) рак.

Кристаллы. Встречаются в спинномозговой жидкости редко, в случае распада опухоли. Элементы эхинококка – крючья, сколексы, обрывки хитиновой оболочки – находят редко.

Бактериоскопическое исследование на микобактерии туберкулеза

Для бактериоскопического исследования готовят тонкие мазки, высушивают их в термостате, обрабатывают смесью Никифорова (спирт и эфир поровну) в течение 10 мин, высушивают и окрашивают.

Если осадок незначительный, то из него сначала готовят препарат для исследования, а затем снимают покровное стекло и делают мазок для бактериоскопического исследования. Обнаруженные фибринозные свертки сначала исследуют микроскопически, а затем извлекают из-под покровного стекла на сухое предметное стекло, растягивают препаровальными иглами, высушивают, фиксируют на огне и смесью Никифорова и окрашивают по Цилю – Нильсену для исследования на наличие туберкулезных бацилл.

При окрашивании осторожно смывают водой краску и оставляют препарат для высыхания в вертикальном положении, но не высушивают фильтровальной бумагой. Туберкулезные бациллы обнаруживаются почти исключительно в фибринозных свертках.

Для бактериоскопического исследования, помимо окраски по Циль – Нильсену, мазок окрашивают по Граму и по Гале – Якобсону. Краску Гале – Якобсона готовят следующим образом: 1 часть карболового фуксина, 4 части насыщенного раствора метиленовой синьки и 35 частей дистиллированной воды. На фиксированные и обработанные смесью Никифорова мазки наливают краску, окрашивают в течение 10–15 с, смывают водой и высушивают. При этой окраске бактерии интенсивно окрашиваются и их нетрудно обнаружить.

Если материала мало, то следует приготовить для бактериоскопического исследования один мазок, сначала окрасить по Гале – Якобсону, а затем перекрасить его по Граму.

При окраске по Гале – Якобсону обнаруживаются менингококки, они находятся группами внутри нейтрофилов. При других формах гнойных менингитов микроорганизмы легко обнаружить при бактериоскопическом исследовании.

При туберкулезном менингите имеет место трудность обнаружения туберкулезных палочек, и нередко приходится потратить значительное время.

Химическое исследование

Определение белка

Осуществляется унифицированным методом с сульфациловой кислотой и на биохимическом анализаторе. Нормальное содержание белка в спинномозговой жидкости варьирует в пределах:

1) при поясничной пункции – 0,22–0,33 г/л;

2) при цистериальной пункции – 0,1–0,22 г/л;

3) при вентрикулярной пункции – 0,12–0,2 г/л.

Унифицированный метод определения белка с сульфациловой кислотой и сульфатом натрия

Интенсивность получения при коагуляции белка сульфациловой кислотой пропорциональна его концентрации.

Необходимые реактивы

1. 6 %-ный раствор сульфациловой кислоты.

2. 14 %-ный раствор безводного сульфата натрия.

3. Стандартный раствор альбумина – 1 %-ный раствор: 1,0 мл альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) растворяют в небольшом количестве 0,9 %-ного раствора хлорида натрия в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствором хлорида натрия до метки. Реактив нестойкий. Для стабилизации к стандартному раствору прибавляют 1 мл 5%-ного раствора азидида натрия. В этом случае при хранении в холодильнике реактив годен к употреблению в течение 2 месяцев.

4. 1 мл раствора альбумина.

5. 0,9 %-ный раствор хлорида натрия.

Специальное оборудование: фотоэлектроколориметр.

Ход исследования

Для анализа применяют свежеприготовленную смесь равных объемов 6 %-ного раствора сульфациловой кислоты и 14 %-ного раствора безводного сульфата натрия (рабочий раствор). В пробирку наливают 5 мл свежеприготовленного рабочего раствора и 0,5 мл ликвора. Тщательно перемешивают. Через 10 мин интенсивность помутнения измеряют на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля, длина волны 410–480 нм (сине-фиолетовый светофильтр). В контроль вместо реактива берут 0,9 %-ный раствор хлорида натрия. Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из стандартного раствора готовят разведения и обрабатывают их так, как опытные. В 5 пробирок наливают 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1 мл стандартного раствора альбумина и в каждую из них доливают до объема 10 мл 0,9 %-ного раствора хлорида натрия. Концентрация белка в этих растворах соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 г/л.

Примечания

1. Если муть начинает оседать, перед измерением пробирку необходимо встряхнуть.

2. Перед определением целесообразно поставить реакцию Панди, и если результат реакции оценивают – 3+ или 4+, то перед началом количественного исследования ликвор надо развести изотоническим раствором хлорида натрия и при Расчете учесть степень разведения.

3. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до 1 г/л, поэтому при более высоких концентрациях белка ликвор следует разводить.

Повышенное содержание белка отмечают при нарушении гемодинамики, воспалительных процессах, органических поражениях центральной нервной системы и оболочек мозга, при экстрамедуллярных опухолях спинного мозга. Пониженное содержание белка отмечается при гидроцефалии и повышенном образовании ликвора.

Большое практическое значение придается определению белкового индекса, отношению глобулинов к альбуминам. Белковые фракции определяются методом электрофореза.

Глобулиновые реакции

Унифицированный метод определения глобулинов осаждением карболовой кислотой (реакция Панди)

Реакция основана на осаждении глобулинов насыщенным раствором карболовой кислоты.

Необходимый реактив

Насыщенный раствор карболовой кислоты – 100 г карболовой кислоты – растворяют в 1 л воды, встряхивают и оставляют в термостате при 37 °C на 6–8 ч. После пребывания при комнатной температуре в течение 7 дней надосадочную жидкость сливают и используют в качестве реактива.

Специальное оборудование: не требуется.

Ход исследования

На часовое стекло, положенное на черную бумагу, наливают 1 мл реактива и по краю наносят 1–2 капли ликвора.

Оценка результатов

В случае положительного результата в месте соприкосновения реактива с используемой спинномозговой жидкостью образуется молочно-белое облачко, переходящее в муть. Для обозначения результатов реакции Панди пользуются системой 4 плюсов:

1) слабая – 1+;

2) заметная опалесценция – 2+;

3) умеренное помутнение – 3+;

4) значительное помутнение – 4+.

Унифицированный метод определения глобулинов высаживанием (реакция Апельда)

Реакция основана на свойстве солей в определенной концентрации осаждать избирательно глобулины.

Необходимый реактив

Насыщенный раствор сульфата аммония – 85 г соли – растворяют в 100 мл воды. Полученный раствор выдерживают 48 ч при комнатной температуре и после фильтрования употребляют для постановки реакции. Реакция раствора нейтральная.

Ход исследования

В пробирку вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реактива и перемешивают. В контрольную пробирку наливают 1 мл воды.

Оценка результатов

Оценку проводят в течение 3 мин после смешивания ликвора с реактивом. Сравнение опыта с контролем производят на темном фоне. Для выражения результатов пользуются системой 4 плюсов:

1) значительное помутнение – + + + +;

2) умеренное – + + +;

3) заметная опалесценция – + +;

4) слабая опалесценция – +.

Клиническое значение

Реакция дает относительное представление о нормальном и патологическом содержании глобулинов. Слабая опалесценция (+) свойственна и нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении общего белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное представление о содержании глобулинов можно получить при электрофоретическом обследовании ликвора, которое целесообразно проводить при положительной реакции Апельда.

Унифицированная реакция с хлорным золотом (реакция Ломге)

Коллоидные растворы, не изменяющиеся под влиянием различных разведений нормальной спинномозговой жидкости, в патологически измененной жидкости меняют степень дисперсности в зависимости от разведения жидкости, при этом изменяются цвет, растворимость и может выпадать осадок.

Необходимые реактивы

1. 1 %-ный водный раствор чистого хлорного золота.

2. Хлорид натрия, 4,5 г на 1 л воды.

3. Цитрат натрия, 1 %-ный раствор в воде.

4. Рабочий раствор хлорного золота.

Готовят следующим образом: к 95 мл воды приливают 1 мл 1%-ного хлорного золота, нагревают до 90–95 °C.

К рабочему раствору прибавляют 5 мл до появления вишнево-красного окрашивания. В процессе кипячения окраска раствора меняется, переходя из синей в фиолетовую, затем красную и вишневую. Раствор может храниться в темном месте до 2 месяцев.

Ход исследования

Готовят разведения спинномозговой жидкости. Берут 11 пробирок, в первую наливают 0,9 мл, а в остальные – по 0,5 мл 0,45 %-ного раствора хлорида натрия. В первую наливают 0,1 мм спинномозговой жидкости и после перемешивания переносят 0,5 мл во 2-ю пробирку, из последней 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом исключают серию разведений от 1: 10 до 1: 5120. В 11-ю пробирку спинномозговую жидкость не добавляют, она является контрольной. Во все пробирки добавляют до 2,5 мл рабочего раствора хлорида натрия. После энергичного встряхивания пробирок их оставляют на 16–18 ч при комнатной температуре.

Оценка полученных результатов. Если спинномозговая жидкость нормальная, смесь всех 11 пробирок остается пурпурно-красной или в одной из первых пробирок фиолетово-пурпурной. При патологическом ликворе на дне пробирок появляется осадок, а цвет жидкости меняется. Изменение цвета принято регистрировать цифрами:

0 – отсутствие окраски;

1 – красно-фиолетовый цвет;

2 – фиолетовый;

3 – красно-синий;

4 – синий;

5 – светло-синий и голубой;

6 – бесцветный.

Цифровое выражение по пробиркам: отрицательная реакция – 00 000 000 000; дегенеративная кривая – 666 654 320; воспалительная – 00 124 566 530.

Клиническое значение

При изменении альбумино-глобулинового коэффициента происходит изменение коллоидной реакции. Воспалительный тип реакции Ломге наблюдается при повышенном содержании α– и β-глобулинов, дегенеративный тип реакции бывает за счет увеличения мелкодисперсной фракции белка – альбуминов и снижения содержания глобулинов.

Большое значение имеют глобулиновые реакции при дифференциальной диагностике органических и функциональных нарушений, при неврастении, прогрессивном параличе и латентном сифилисе.