Текст книги "Как мы видим? Нейробиология зрительного восприятия"

Нам требовалось найти такой метод, который позволил бы нам надежно выделять отдельный нейрон среди всех остальных. Кроме того, метод должен был быть управляемым, чтобы мы могли использовать его для систематической выборки популяций амакриновых клеток. Техника, на которой мы в итоге остановились, называлась фотозаполнением (photofilling). Сначала сетчатка погружалась в раствор со светочувствительными молекулами, которые посредством диффузии проникали во все нейроны. Затем мы фокусировали крошечное – площадью меньше нейрона – пятно света на случайно выбранной амакриновой клетке. В ответ на мощный световой стимул в клетке запускалась цепь реакций, в результате которой флуоресцентные молекулы распространялись по всему внутреннему пространству целевого нейрона – и высвечивали его на фоне миллионов его нефлуоресцирующих собратьев.

Трудностей, разумеется, хватало. Например, флуоресцентную клетку нельзя было фотографировать обычным способом, потому что используемый в этом случае свет вызывал реакцию флуоресценции во всех окружающих клетках. Мы решили эту проблему, купив самый высокочувствительный (и астрономически дорогой) цифровой фотоаппарат, позволяющий делать снимки менее чем за одну десятую долю секунды – прежде чем флуоресцентная реакция успевала распространиться вокруг. Также выяснилось, что этот метод работал лучше с маленькими клетками, чем с большими. Как бы то ни было, по мере практики наш оператор Маргарет Макнил, опытный постдок, овладела этой техникой почти в совершенстве. Когда она нацеливала луч света на случайно выбранную клетку, ей удавалось зафиксировать изображение ее дендритного дерева в 94 % случаев. Несколько сотен таких фотографий обеспечили нам довольно-таки репрезентативную выборку всей популяции амакриновых клеток.

Помните вопрос, с которого мы начали это исследование? Если 24 % всех амакриновых клеток, которые мы идентифицировали, относятся к специфическим редким типам таких клеток, то каковы тогда обычные амакриновые клетки? К нашему большому удивлению, ответ заключался в том, что обычных амакриновых клеток не существует.

Что это значит? Мы ожидали обнаружить среди амакриновых клеток несколько основных крупных групп, дополненных малочисленными группами специализированных клеток. Но вместо этого оказалось, что амакриновые клетки довольно равномерно распределены среди разнообразного набора клеточных типов. А это предполагало, что все они играют одинаково важную роль в обработке визуальной информации. Наш вывод, который мы (с небольшими трудностями) опубликовали в ведущем научном журнале, заключался в том, что в сетчатке существует 29 различных типов амакриновых клеток, каждый из которых выполняет свою специфическую функцию по обработке визуального изображения.

Почему это короткое заключение заслуживает особого внимания? Оказалось, в нем крылся важный ключ к разгадке того, как работает сетчатка. Зачем сетчатке нужны целых 29 типов амакриновых клеток? Ответ напрашивался сам собой: в сетчатке происходит гораздо больше обработки информации, чем считалось раньше. Амакриновые клетки генерируют основной выход для ганглионарных клеток, которые являются последним звеном цепи перед отправкой зрительных сообщений в головной мозг. Если амакриновые клетки так разнообразны, значит, сообщения должны быть такими же разнообразными. Это был важный шаг вперед к пониманию того, как работает зрительное восприятие.

НЕЙРОНЫ-ПРИЗРАКИ (ПРОДОЛЖЕНИЕ): БИПОЛЯРНЫЕ КЛЕТКИ

Пока мы занимались амакриновыми клетками, наши коллеги изучали другие компоненты микросхемы сетчатки. Главным пробелом в нашей базе знаний были биполярные клетки. Как вы помните, биполярная клетка получает синаптический вход от нескольких фоторецепторных клеток и передает выходной сигнал через амакриновую клетку в ганглионарную. Биполяры являются важнейшим элементом сетчатки. Если удалить из сетчатки все амакриновые клетки, после некоторой перестройки она все равно сможет функционировать благодаря ганглионарным клеткам с транзиторным и устойчивым ответами, хотя изображение будет не таким контрастным и пропадет избирательность в отношении направления. Другими словами, человек без амакриновых клеток все равно будет видеть, но его зрение окажется расплывчатым и замедленным. Если убрать биполярные клетки, сетчатка сможет сообщать мозгу только о наступлении дня и ночи благодаря примитивной функции, выполняемой подгруппой органически светочувствительных ганглионарных клеток.

Все вы слышали о научных прорывах, когда новое открытие или идея внезапно, подобно молнии среди ясного неба, меняли целые области науки. Но гораздо чаще наука движется вперед путем постепенного приращения: по мере накопления данных возможность превращается в вероятность, которая в конце концов трансформируется в факт. Так было и в случае с нашим пониманием биполярных клеток.

Первые системные исследования с регистрацией электрической активности биполярных клеток, проведенные Акимити Канеко, Фрэнком Верблином и Джоном Даулингом, показали существование четырех типов клеток: с транзиторными on– и off-ответами и устойчивыми on– и off-ответами. Казалось логичным предположить, что эти четыре физических типа биполярных клеток соответствуют четырем аналогичным типам ганглионарных клеток.

Но, как и в случае амакриновых клеток, имелись весомые основания подозревать, что это далеко не все разновидности биполярных клеток, которые существуют в сетчатке. В середине 1990-х гг. исследованием биполярных клеток занимались четыре – пять лабораторий, и по их оценкам количество типов таких клеток варьировалось от четырех до девяти. Мы с моей лабораторией присоединились к этой работе довольно поздно с тайной надеждой на то, что накопленная другими база знаний позволит нам понять организацию биполярных клеток. Но, как оказалось, эта база знаний включала в себя слишком много несистематических данных в духе коллекционирования бабочек: небольшая выборка клеток здесь, небольшая выборка там. Поэтому наш набор вопросов был совершенно иным. Во-первых, существуют ли типы биполярных клеток, которые не удалось обнаружить с помощью ранее использованных методов окрашивания? Во-вторых, существует ли среди биполярных клеток разделение на основные, доминирующие группы и малочисленные группы вспомогательных клеток? Или же все типы биполярных клеток более-менее равны?

Чтобы ответить на вопрос, мы объединились с Элио Равиолой. Некоторое время назад он провел потрясающую серию экспериментов с окрашиванием клеток сетчатки, но эти снимки пылились в нижнем ящике его рабочего стола[15]15
  Совершенно естественно, что Элио Равиола стал мастером метода Гольджи: он учился на факультете анатомии в Падуанском университете, который в XIX в. окончил Камилло Гольджи.


[Закрыть]. Один из его студентов провел предварительный анализ, но Элио решил не продолжать работу, потому что, будучи перфекционистом, остро осознавал несовершенство оборудования. В частности, он считал, что ему удалось окрасить далеко не все биполярные клетки.

У нашей лаборатории имелось два важных преимущества. Во-первых, метод фотозаполнения, который позволял получить надежную и всеобъемлющую выборку биполярных клеток. Во-вторых, у нас была Маргарет Макнил, которая к тому времени стала мастером трехмерной визуализации нейронов. Сделанные ею снимки были нашей тайной гордостью. Мы, нейроанатомы, любим красивые фотографии нейронов – нам кажется, что в них кроется что-то мистическое, открывающаяся нашему взору частица Истины.

Наконец, у нас имелся еще один ценнейший набор данных для идентификации клеток: снимки биполярных клеток, в которые были микроинъектированы маркерные молекулы после того, как были изучены их электрические ответы. Эта работа была проделана нашим другом Рэем Дашё из Алабамского университета. Знание того, как клетки реагируют на свет, было важным дополнением, поскольку реакции клеток оказались такими же разнообразными и характерными, как и их формы. Каждый из трех методов – окрашивание, фотозаполнение и микроинъекции – имел свою специфику, и мы надеялись, что ни одному типу клеток не удастся ускользнуть от всех трех детекторов. Итак, объединив все три вида данных, мы с уверенностью пришли к выводу, что существует целых 13 типов биполярных клеток. Вот они, нарисованные рукой Элио:

Этот рисунок подчеркивает определяющую особенность форм биполярных клеток – глубину их аксонных деревьев. Как и другие лаборатории, мы обнаружили, что главная отличительная черта биполярных клеток – конкретный уровень в синаптическом слое сетчатки, на котором разветвляются их аксоны. Как вы видели на рисунке амакриновых клеток, глубина погружения во внутренний синаптический слой сетчатки влияет на то, с какими типами других игроков – амакриновых и ганглионарных клеток – контактирует эта конкретная биполярная клетка.

Мы также обнаружили, что не существует какого-либо основного, преобладающего типа биполярных клеток. Как и амакриновые клетки, биполяры оказались более-менее равномерно разделены на несколько разных групп. Это означало, что сетчатка имеет примерно 13 параллельных путей от фоторецепторных клеток к внутреннему слою, где они подходят к примерно 29 типам амакриновых клеток и далее идут к, предположительно, еще большему числу типов ганглионарных клеток, которые окончательно кодируют визуальное сообщение и передают его в головной мозг.

Некоторое время спустя, когда были изобретены более совершенные красители, группа Хайнца Вессле провела исследование по идентификации биполярных клеток. Продемонстрировав высший пилотаж в технике иммуноокрашивания, они получили настолько однозначные и детальные данные, что суммирование количества отдельных типов клеток в точности дало общее число биполярных клеток сетчатки (установленное нами с Энрикой). Вессле и его коллеги пришли к выводу, что «все основные типы биполярных клеток сетчатки мыши идентифицированы и каталог из 11 типов колбочковых биполярных клеток и одного типа палочковых биполярных клеток можно считать полным»[16]16
  За десятилетие, прошедшее с момента публикации этой работы, два идентифицированных Вессле типа биполярных клеток были подразделены еще на два подтипа каждый, поэтому некоторые исследователи считают, что фактически существует 14 типов. Но это отчасти вопрос семантики, и фундаментальное утверждение Вессле остается верным. Wässle, H., Puller, C., Müller, F., and Haverkamp, S. (2009), “Cone contacts, mosaics, and territories of bipolar cells in the mouse retina”, Journal of Neuroscience, 29, 106–117; Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Turaga, S. C., Jain, V., Seung, H. S., and Denk, W. (2013), “Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina”, Nature, 500, 168–174.


[Закрыть]. Новые исследования, проведенные с использованием самых современных техник электронной микроскопии и мощных молекулярно-генетических маркеров, внесли лишь незначительные изменения и дополнения в каталоги биполярных клеток, составленные Макнил и лабораторией Вессле. Общее количество идентифицированных типов варьируется от 12 до 15 в зависимости от используемых критериев.

Биполярные клетки составляют основу сетчатки. Дюжина типов биполяров представляют собой «примитивы» зрения. На более поздних этапах эволюции сетчатки и мозга сигналы, генерируемые биполярными клетками, стали собираться в различные комбинации, модифицироваться, усиливаться или игнорироваться. Но ни сетчатка, ни мозг не могут выйти за пределы ограничений, установленных биполярными клетками как базовыми элементами зрительного восприятия.

БРАЙАН БОЙКОТТ

Самым влиятельным исследователем сетчатки в конце XX в. был Брайан Бойкотт, член Королевского общества без ученой степени.

Впервые я встретился с ним в его лаборатории в Королевском колледже на Друри-лейн в Лондоне[17]17
  Рассказ о Брайане Бойкотте основан на личных воспоминаниях автора, а также на двух прекрасных биографических очерках: Boycott, B. B. (2001), “Brian B. Boycott”, in Squire, L. R., (Ed.), The history of neuroscience in autobiography, San Francisco: Academic Press. Wässle, H. (2002), “Brian Blundell Boycott, 10 December 1924 – 22 April 2000”, Biographical Memoirs of Fellows of the Royal Society, 48, 51–68.


[Закрыть]. Это было пыльное, необжитое на вид помещение с деревянными шкафами, забитыми старыми лабораторными журналами и оборудованием. Бойкотт тогда уже был знаменитым ученым. Он возглавлял отделение биофизики в Королевском колледже Лондона, где в свое время никому не известная Розалинда Франклин получила необычайно четкие дифракционные рентгенограммы ДНК, благодаря которым будущие нобелевские лауреаты Уотсон и Крик смогли сделать важные открытия, касающиеся структуры ДНК. Бойкотт носил простую рубашку без галстука и старомодные брюки, над которыми нависало брюшко. Он курил сигареты без фильтра. Я был нервным, амбициозным молодым ученым, только начинавшим приобретать известность за пределами своего университета. Мы сидели лицом к лицу на лабораторных табуретах. Брайан без тени снисходительности или скептицизма расспрашивал меня о моих экспериментах, новости о которых доходили до него по сарафанному радио. Мы проговорили до конца рабочего дня. Это была наша первая из длинной череды столь же затяжных, сопровождавшихся бесконечным курением бесед.

Брайан Бойкотт родился в городке Кройдон, Англия, зимой 1924 г. Когда ему исполнилось семь лет, мать вместе с ним сбежала от мужа-алкоголика. Так в разгар Великой депрессии они остались без финансовой поддержки. Несколько месяцев они жили у друзей, пока матери в конце концов не удалось найти низкооплачиваемую работу и снять комнату.

К счастью, непутевый отец Брайана некогда был франкмасоном, что дало мальчику право на поступление в одну из масонских школ. Это была школа-интернат классического британского образца, где учеников обеспечивали жильем, питанием и даже одеждой. Начиная с восьми лет все детство и юность с перерывом на короткие каникулы Брайан провел в масонской школе.

Хотя трудности Брайана далеко не исчерпывались стандартным набором детских болезней, он не чувствовал себя несчастным в школе-интернате. Его успехи в учебе были невелики. Выпускные экзамены по французскому и математике Брайан провалил, по химии и физике едва наскреб на «удовлетворительно». Отвергнутый Кембриджским университетом, он поступил в Бербек-колледж, филиал Лондонского университета с вечерним обучением, где «народ из рабочего класса по вечерам получал высшее образование». Но вскоре разразилась Вторая мировая война; во время «Лондонского блица» в здание Бербек-колледжа попала зажигательная бомба, поэтому занятия проводились в помещениях уцелевшего первого этажа, которые сверху покрыли обычным гофрированным железом. Студентов дневного отделения Лондонского университета эвакуировали в Северный Уэльс, где они продолжили учебу в комфорте и безопасности, тогда как Бойкотту и его сокурсникам пришлось получать знания под жестяной крышей, которая летом раскалялась под солнцем и оглушительно грохотала под дождем.

Чтобы зарабатывать себе на жизнь, Бойкотт устроился техником в виварий Национального института медицинских исследований, где в его обязанности наряду с прочим входила чистка клеток. Вероятно, он хорошо зарекомендовал себя на этой грязной работе, потому что вскоре ему предложили более интересную должность лаборанта в физиологической лаборатории.

До предыдущего года эта лаборатория была вотчиной сэра Генри Дейла, пионера синаптической биологии, и сохранила заведенные им порядки и дисциплину. Бойкотт проработал там четыре года, по вечерам изучая биологию в колледже. Для начинающего биолога это был фантастический опыт. В виварии он работал плечом к плечу с людьми из рабочего класса, которых уважал и любил. В лаборатории Дейла – с представителями научной элиты. В те времена исследовательские группы были небольшими, и даже у знаменитого на весь мир Дейла группа насчитывала не больше 15 исследователей и лаборантов. По-видимому, даровитый молодой лаборант стал всеобщим любимцем, потому что вскоре ему разрешили самостоятельно проводить эксперименты. Один из таких экспериментов состоял в том, что собак ставили на качающуюся платформу и держали их там, пока у них не начиналась рвота. Это исследование было заказано Королевскими военно-воздушными силами, которые хотели узнать биологическую подоплеку морской болезни. Брайан рассказал мне историю об одной умной собаке, которую начинало тошнить при одном виде платформы, из-за чего в тот день она становилась непригодной для эксперимента. Возможно, именно поэтому нейробиологические основы павловского условного рефлекса всегда вызывали у Бойкотта живой интерес.

Позже он писал о большом значении этого этапа его жизни, когда он сформировал свои исследовательские интересы, сдружился с широким кругом ученых и даже написал первую научную статью. В ней был представлен новый метод измерения количества углекислого газа, накапливаемого в ребризере – подводном дыхательном аппарате с повторным использованием выдыхаемого воздуха. Хотя война к тому времени подошла к концу, к сожалению, военные поставили на статье гриф «секретно» и запретили ее публиковать.

Как бы то ни было, Бойкотт приобрел некоторую известность в научных кругах, и после окончания Бербек-колледжа ему предложили место младшего преподавателя на факультете зоологии в Университетском колледже. Он преподавал студентам лабораторный раздел вводного курса (сейчас эту черную работу обычно возлагают на ассистентов кафедры или аспирантов). Он также записался в аспирантуру, но отложил работу над диссертацией, когда получил предложение войти в исследовательскую группу зоолога с мировым именем Дж. З. Янга, работавшего в лаборатории морской биологии в итальянском Неаполе. Море было щедрым источником животных, на которых зоологи могли изучать общие принципы, а Бойкотта, в частности, интересовало, можно ли узнать что-то новое о механизме обучения, используя мозг осьминога.

Проведенное группой Янга исследование нейронных основ обучения вызвало своего рода ажиотаж. О нем много писали не только в различных научных журналах, но и в популярной прессе (еще бы, осьминоги способны учиться!). К сожалению, звездного босса Брайана больше заботила публикация очередной статьи, чем диссертация его сотрудника. В результате Бойкотт так и не написал диссертацию, хотя к тому времени уже заработал себе солидную научную репутацию. Британское научное ведомство решило, что докторская степень не так уж важна для настоящего ученого, и повысило Бойкотта до профессорского звания. Впоследствии он с гордостью поправлял каждого, кто называл его доктором Бойкоттом, – мол, он «просто профессор Бойкотт».

По возвращению из Неаполя в Великобританию ученый заинтересовался другими темами, связанными с обучением, в частности изменениями, которые происходят в мозге у представителей семейства беличьих, когда те впадают в спячку. Отчасти по этой причине он на один семестр отправился преподавать в Гарвард, где найти этих пушистых грызунов для опытов было куда легче, чем в Лондоне.

В Гарварде он познакомился с Джоном Даулингом, и партнерство между ними привело к важному достижению. На тот момент Даулинг как раз занялся изучением сетчатки млекопитающих с помощью электронной микроскопии. Но электронная микроскопия дает слишком большое увеличение. В результате Даулинг обнаружил в сетчатке любопытную организацию синаптических связей, но из-за чрезмерно увеличенного изображения никак не мог понять, каким клеткам они принадлежат. Бойкотт был мастером окрашивания целых клеток и, изучая осьминогов, научился искусно распутывать нейронные сети. Бойкотт и Даулинг быстро осознали, что прекрасно дополняют друг друга. Вместе они провели фундаментальное исследование нейронных связей в сетчатке, которое заложило основу для ее понимания.

Бойкотт и сам обладал уникальным видением: он мог увидеть целиком всю картину и с точностью лазера определить набор ключевых вопросов для последующего движения вперед. Его собственная исследовательская работа, которой он занимался с помощью всего одного лаборанта, касалась микроструктуры сетчатки. Но, пожалуй, его главным вкладом было умение донести свою широту мышления до нас, молодых ученых. Несколько месяцев в году он проводил в лаборатории Хайнца Вессле во Франкфурте в качестве консультанта, критика, серого кардинала и источника кипучей энергии. Вессле, выдающийся ученый и грамотный администратор, предоставлял в его распоряжение все ресурсы Института Макса Планка. Брайан генерировал общие идеи, сотрудники Вессле корпели над частностями. Несмотря на разные поколения, Бойкотт и Вессле были людьми одного типа: великодушными, высоконравственными, преданными своему делу.

Предпочитая вести простой образ жизни, Бойкотт тем не менее не был пуританином. Он интересовался мировыми событиями, политикой, любил поесть и выпить. В любой компании он первым предлагал отправиться в паб. Придерживаясь высочайших научных стандартов и обладая очень критическим мышлением, он на равных заводил разговор с кем угодно – от дворника и постдока до именитого профессора – о чем угодно, будь то случайная тема, политика, мудреная научная теория и т. д. Если вам было что сказать, он уважительно вас выслушивал. Если же ваши стандарты, по его мнению, не соответствовали его высокой планке, он оставался дружелюбным, но не придавал вашему мнению большого значения. Крупных научных сборищ он избегал, насмешливо называя их собранием овец. К публичным выступлениям почти не готовился, поэтому его речи нередко напоминали сбивчивые размышления вслух, будучи полной противоположностью современным презентациям в стиле TED, тщательно подготовленным и отлично проиллюстрированным.

Брайан любил общаться с молодыми учеными, чьи исследования вызывали у него интерес. Во время поездок в США он часто приезжал в мой маленький домик под Бостоном. Мы допоздна засиживались на заднем крыльце, обсуждая популяции клеток сетчатки, сплетничая о друзьях и потягивая бурбон. После смерти Брайана ученые, занимающиеся исследованиями сетчатки, учредили в его память награду за научные достижения – ее вручают раз в два года, когда все сообщество собирается в горах Вермонта на научное биеннале. Стать лауреатом премии Бойкотта – большая честь, поскольку Брайана все уважали и любили. Победитель получает сертификат и бутылку односолодового виски.