Текст книги "Просто геном"

Несколько специфических признаков делают вирусы эффективными в качестве переносчиков генетического материала в клетки. Они обладают исключительной способностью проникать в клетки любого типа. Пока существует жизнь, организмам всех царств – бактерий, растений, животных – приходится бороться с вирусами-паразитами, единственная цель которых захватить клетки, вставить в них свою собственную ДНК и обмануть клетки путём создания всё большего количества своих копий внутри. Вирусы научились использовать практически каждое уязвимое место в защитной системе клетки, чтобы внедриться и захватить её. Вирусы усовершенствовали стратегии вброса своей генетической информации внутрь клетки. В качестве инструмента для внедрения новой информации в клетку вирусные частицы поразительно надежны; исследователи, работающие с вирусами, могут вводить гены в клетки-мишени с эффективностью почти 100 процентов. Таким образом, для первопроходцев, использовавших вирусы в терапевтических целях, они были палочкой-выручалочкой, своеобразными троянскими конями.

Вирусы настолько умны и хитры, что знают не только как внедрить свою ДНК внутрь клетки чужеродного организма, но также как заставить новый генетический код удерживаться в этой клетке. В 1920-1930-х годах, в первые годы генетических исследований, сфокусированных на бактериях, учёные были озадачены уникальной способностью вирусов появляться, казалось бы, ниоткуда и вызывать инфекции. Последующие исследования продемонстрировали, что эти вирусы способны расщеплять свой геном в бактериальную хромосому и оставаться необнаруженными до тех пор, пока условия не станут подходящими, чтобы они могли начать развитие активной агрессивной инфекции.

Ретровирусы, большой класс, который включает вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), делают то же самое с людьми, встраивая свой генетический материал в геном инфицированных клеток, поэтому уничтожить ретровирусы очень сложно.

Генная терапия представляет собой лечение наследственных и приобретенных заболеваний путем введения в соматические клетки пациента генетических элементов для восстановления или подавления функций генов и придания клеткам заданных свойств. После первых попыток генной терапии в 1960-х годах эта область совершила скачок вперёд благодаря революции с использованием рекомбинантной ДНК – универсального термина для генетического кода, созданного в лаборатории, а не природой. Используя новые инструменты биотехнологии и новые биохимические методы, учёные в 1970-1980-х годах разработали способы вырезки и вставки сегментов ДНК в геном и научились изолировать определенные последовательности генов. Это позволило вставлять т. н. терапевтические гены в вирусы, а также удалять опасные гены для того, чтобы вирусы, внедряясь в клетки, больше не наносили им вред. Иными словами, исследователи превратили эти вирусы в своеобразные полезные лифты для доставки полезной генетической информации к желаемой цели.

К концу 1980-х годов, после того как переоснащённые ретровирусы были успешно использованы для введения лабораторно созданных генов мышам, началось тестирование генной терапии в клинических условиях. Френч Андерсон и его коллеги из Национального института здоровья первыми дошли до финиша. Они разработали многообещающий переносчик информации, дополненный здоровой копией гена аденозиндеаминазы, гена, который мутирует у пациентов, страдающих от тяжелого комбинированного иммунодефицита, – алимфоцитоза, при котором в результате дефекта одного из генов нарушается работа компонентов адаптивной иммунной системы. Их целью было использовать генную терапию для постоянной интеграции немутантного гена ADA в клетки крови пациентов с иммунодефицитом, что позволило бы производить недостающий белок – шаг, который, как надеялся Андерсон и его коллеги, излечит болезнь. К сожалению, результаты этого новаторского клинического испытания оказались неутешительными; переоснащённый вирус не нанес вреда реципиентам, но оценить его эффективность не представлялось возможным.

Однако с того раннего эксперимента, проведённого десятилетия назад, в генной терапии были достигнуты феноменальные успехи. Улучшения в конструкции вирусных переносчиков информации и в методах, используемых для их внедрения, привели к чрезвычайно обнадеживающим результатам генной терапиии тяжёлого иммунодефицита у десятков пациентов, страдающих данным заболеванием. Более того, Европейская комиссия одобрила препарат Strimvelis, который представляет собой первую генную терапию для детей, предназначенную для лечения тяжелого комбинированного иммунодефицита.

Strimvelis – это генная терапия, которая создается для каждого конкретного пациента на основе его собственных клеток. Принцип такой терапии заключается в том, что в ДНК предварительно удаленных пораженных стволовых клеток костного мозга пациента внедряют нормальную копию гена аденозиндезаминазы. Затем исправленные клетки вводят обратно в организм. Чтобы генетически модифицированные клетки лучше прижились, перед процедурой пациент проходит низкодозовую химиотерапию.

Френч Андерсон – американский врач, генетик и молекулярный биолог. Известен как отец генной терапии.

Помимо этого, к 2016 году было проведено более 2 тысяч испытаний генной терапии различных болезней. В результате удалось расширить диапазон заболеваний, которые стало возможно лечить данными способом. С этого времени генная терапия позволяет корректировать такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна, гемофилия, некоторые формы слепоты и растущее число сердечно-сосудистых и неврологических заболеваний.

Между тем область иммунотерапии рака, где борющиеся с опухолью клетки оснащаются генами, нацеленными на молекулы, специфичные для опухолей, была названа одним из наиболее многообещающих достижений в лечении онкологии.

Но несмотря на ажиотаж генная терапия не стала панацеей, на которую так надеялись врачи и учёные; порой кажется, что она принесла больше вреда, чем пользы. Область генной терапии претерпела встряску в 1999 году, когда пациент умер после перенесенного массивного иммунного ответа на высокую дозу введённых вирусных переносчиков. Затем, в начале 2000-х годов, у пятерых пациентов в ходе испытаний генной терапии для лечения иммунодефицита развился лейкоз. Рак возник в результате случайной активации ретровирусом онкогена – гена, который заставил клетки бесконтрольно размножаться. Этот случай подчеркнул риски, связанные с внедрением в клетки пациентов большого количества чужеродного агента и случайного внедрения нескольких тысяч букв ДНК в их геномы. Безусловно, эта серия клинических исследований была столь же захватывающей, как и слишком рискованной и отчаянной.

Генная терапия по самой своей природе неэффективна для широкого спектра генетических состояний, причиной которых не является отсутствие или недостаток генов. Такие ситуации не могут быть исправлены путем добавления новых генов в клетки. Возьмём к примеру хорею Гентингтона, при которой измененный ген производит аномальный белок, полностью перекрывающий действие второй, здоровой копии гена. Поскольку мутировавший ген доминирует над немутантным, простая генная терапия – добавление ещё одной нормальной копии гена с использованием переоснащённого вируса – не будет влиять на болезнь Гентингтона. Для этой и многих других трудно поддающихся лечению генетических заболеваний необходимо найти способ восстанавливать дефективные гены, а не просто вытеснять их. Если бы учёные могли исправить дефективный код, вызвавший проблему, то они смогли бы нацелиться на доминантные заболевания, не заботясь о последствиях сращивания гена в неправильном месте.

Достижение такой возможности заинтриговало учёных. В начале 1990-х годов Дженнифер Дудна и Брюс Салленгер не раз обсуждали это в лаборатории Университета Колорадо. Одной из идей, которой они увлеклись, была мысль о том, что молекулы РНК, эти посредники между ДНК и белками в клетках, могут быть изменены таким образом, чтобы исправлять мутации, которые переносят из ДНК. Учёные также обсуждали возможность редактирования исходного кода таких дефектных РНК.

В 1980-х годах, когда одни исследователи совершенствовали генную терапию, основанную на вирусах-переносчиках генного материала, другие искали более простые методы трансформации клеток млекопитающих с использованием ДНК, изготовленной в лабораторных условиях. Эти базовые методы были предназначены в основном для исследований, но по прошествии десятилетий учёные начали изучать их терапевтический потенциал в клетках человеческого организма.

Эти подходы обладали некоторыми ключевыми преимуществами по сравнению с более сложными методами переноса генов. Во-первых, они действовали намного быстрее; вместо того чтобы заниматься сложным процессом перемещения нужных генов в реконструированные вирусы, учёные могли вводить созданную в лабораторных условиях ДНК непосредственно в клетки живого организма или позволить клеткам поглощать эту ДНК, поместив клетки в специально приготовленную смесь из ДНК и фосфата кальция. Во-вторых, эти более простые методы были прямо противоположны сложной технике расщепления вируса для проникновения в клетку – клетка сама могла объединять чужеродную ДНК со своей собственной, хотя на то время и не совсем эффективно.

Мыши были первыми подопытными животными при тестировании этих методов внедрения новой генетической информации, и учёные в свою очередь поразились тому, насколько эффективными оказались новые методы при применении их на крошечных существах. Внедрив новую ДНК в оплодотворенные яйцеклетки мышей, а затем имплантировав эти яйца самкам, исследователи обнаружили, что могут постоянно передавать чужеродную ДНК следующему поколению и вызывать наблюдаемые изменения у развивающихся животных. Эти достижения означали, что любой ген, выделенный и клонированный в лаборатории, можно было проверить, исследовать и проводить эксперименты над ним; добавляя ген в клетки, учёные наблюдали эффекты и лучше понимали функцию гена.

Как именно ДНК попадала в геном? Марио Капекки, профессор Университета в штате Юта, занялся этим вопросом в начале 1980-х годов после удивительного наблюдения. Он обратил внимание на порядок следования множества копий гена, вставленных в геном. Капекки обнаружил: вместо того чтобы копии генов беспорядочно распределялись по хромосомам, они всегда группировались в одной или нескольких областях, причем многие копии накладывались друг на друга, как будто намеренно.

Капекки наблюдал эффекты процесса, называемого гомологичной рекомбинацией – хорошо известного к тому времени явления, но не того, который учёный ожидал увидеть в этом эксперименте. Гомологичная рекомбинация представляет собой тип генетической рекомбинации, при которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя похожими или идентичными хромосомами. Это широко используемый клетками способ устранения повреждений ДНК. В наиболее известном варианте гомологичная рекомбинация происходит во время образования яйцеклеток и сперматозоидов, когда два набора хромосом, которые мы наследуем от родителей, сводятся к одному, чтобы объединиться со вторым набором. Клетки выбирают смесь отцовской и материнской хромосом; несмотря на ошеломляющую сложность смешивания, сопоставления и повторной сборки миллионов букв ДНК, клетки могут сделать это безупречно, используя гомологичную рекомбинацию. Этот же процесс происходит во всех царствах жизни; бактерии, например, обмениваются генетической информацией посредством гомологичной рекомбинации, а биологи годами используют гомологичную рекомбинацию для проведения генетических экспериментов на дрожжах.

Впоследствии Капекки построил на основе гомологичной рекомбинации генетический таргетинг – процесс, при котором в геном организма вносятся искусственные изменения. За развитие этой технологии Марио Капекки и ряд других учёных, среди них Мартин Эванс и Оливер Смитис, были удостоены в 2007 году Нобелевской премии по физиологии и медицине.

К осознанию пользы этой технологии учёные окончательно пришли спустя всего три года после исследования Капекки. Возможность целенаправленно вставлять информацию в гены стала реальностью благодаря статье, опубликованной Оливером Смитисом и его коллегами. Работая с клетками человека, полученными из опухоли, учёные намеревались заменить копии клеток гена бета-глобин искусственной рекомбинантной версией, созданной в лаборатории. Невероятно, но сработало! Это не потребовало от учёных причудливых уловок, они смешали нужную ДНК с фосфатом кальция и впрыснули ее в клетки – несколько клеток приняли чужеродную ДНК; затем соединили последовательности ДНК, встроенные в лаборатории, с соответствующими им последовательностями ДНК в геноме, и произвели некоторые молекулярные перестановки с заменой старого материала новым.

Клетки, казалось, могли сделать большую часть тяжелой работы по модификации их геномов самостоятельно. Это означало, что учёные могли привносить гены в клетки более аккуратным путём, без использования вирусов, чтобы внедрить новую ДНК в геном. Обманывая клетку, заставляя ее «думать», что рекомбинантная ДНК является просто дополнительной хромосомой, которую необходимо соединить с соответствующим геном, уже имеющимся в ее геноме, учёные могли обеспечить объединение новой ДНК с существующим генетическим кодом посредством гомологичной рекомбинации. Потенциал генетиченского таргетинга для исследований был обнадёживающим. Но Смитис знал, что гомологичная рекомбинация также может быть использована в терапевтических целях. Если бы учёные могли выполнять аналогичное нацеливание на гены в стволовых клетках крови пациента, страдающего серповидноклеточной анемией, мутировавший ген бета-глобина мог бы быть заменен нормальной, здоровой последовательностью составляющих. Но всё же учёные знали, что это открытие, бывшее тогда экспериментальным подходом, сможет быть когда-нибудь использовано для лечения болезней.

Марио Капекки – американский молекулярный генетик, лауреат Нобелевской премии по физиологии или медицине за создание и развитие метода нокаута генов

К концу 1980-х годов генетический таргетинг уже широко использовался для редактирования ДНК не только в культивируемых клетках мыши и человека, но даже и в самих живых мышах. Основополагающая работа в лаборатории Мартина Эванса продемонстрировала, что таргетинг генов в эмбриональные стволовые клетки мыши и затем введение этих модифицированных клеток обратно в эмбрионы мышей позволяет создавать живых мышей с конструктивными изменениями.

Однако несмотря на потрясающие возможности, которые открылись учёным, обнаружившим, что гены всё-таки возможно видоизменять, в раннюю эпоху генной инженерии первые годы были потрачены на фундаментальные исследования в области редактирования генов, нежели на практическое применение генетического таргетинга в профилактических или лечебных целях. Для генетиков, изучающих гены млекопитающих и пытающихся найти различные пути для лучшего понимания функций генов, генетический таргетинг стал настоящей находкой, технологией, которая сулила выигрыш. Но исследователи в области медицины с огромной осторожностью экспериментировали с генетическим таргетингом на людях, поскольку, несмотря на его эффективность, когда дело доходило до его использования для лечения заболеваний, гомологичная рекомбинация оставляла желать лучшего.

Возможно, самым большим недостатком была проблема негомологичной (незаконной) рекомбинации, где ДНК случайным образом интегрируется в геном, а не поступает в него чётко последовательно. Но учёные выяснили, что на деле незаконная рекомбинация преобладает над гомологичной примерно в 100 раз. Было ясно, что медицинское использование генной терапии с целью лечения в таком случае было бы крайне затруднительным. Учёные разрабатывали элегантные пути, чтобы обойти проблему в клетках, и не теряли надежду на будущее применение новой технологии в медицине. Как отметил Капекки в начале 1990-х годов: «В конечном итоге, гомологичная рекомбинация для генной терапии человека – единственный путь!» Но на то время казалось, что редактирование генов просто недостаточно хорошо изучено для применения с пользой для людей.

В начале 80-х годов, когда многие были заняты размышлениями о генетическом таргетинге в клетках человека, Джек Шостак ломал голову над процессом деления дрожжевых клеток. Профессор Гарвардской медицинской школы решил основательно углубиться в проблему генетического таргетинга и гомологичной рекомбинации. Шостак хотел конкретнее понять, как две нити ДНК из одной хромосомы могут объединяться с двумя совпадающими нитями ДНК из второй хромосомы, обмениваться информацией находясь на промежуточной стадии слияния, а затем снова разделяться, чтобы заново сформировать отдельные хромосомы, после того как клетки разделятся.

В 1983 году Шостак решил, что нашел ответ. Основываясь на результатах генетических экспериментов с дрожжами, он и аспирант Терри Орр-Уивер вместе с профессорами Родни Ротштейном и Фрэнклином Сталем опубликовали провокационную модель, в которой рассматривали путь репарации двуцепочечных разрывов и которая толковала многие интересующие учёных детали об обмене генетической информацией. К 1986 году Шостак уже переключил свои исследования на роль молекул РНК в ранней эволюции жизни. Но в исследовательских кругах и лабораториях всё ещё активно обсуждалась модель, представленная Шостаком, – модель двуцепочных разрывов, о которой звучали как положительные мнения, так и откровенный скептицизм научного сообщества. Но со временем стало ясно, что эта модель разработана на основе обширных экспериментальных данных. Механизм репарации двухцепочечных разрывов имел смысл не только для гомологичной рекомбинации, которая происходила во время образования яйцеклеток и сперматозоидов, но также и для рекомбинации, которая происходила всякий раз, когда ДНК была повреждена.

Все клетки подвергаются воздействию ДНК-повреждающих агентов, таких как рентгеновское излучение и канцерогены, но клетки чрезвычайно эффективны в восстановлении этих разрывов без потери генетической информации. Согласно модели Шостака этот процесс восстановления зависел от способности хромосом к гомологичной рекомбинации. Получалось, что любое повреждение одной хромосомы можно было исправить, просто скопировав соответствующую последовательность на вторую хромосому.

В случае, если модель двуцепочечных разрывов была верной, а выводы, сделанные из исследований дрожжей актуальны и для млекопитающих, то существовала очевидная возможность повысить эффективность редактирования генов: разрезать геном именно в том месте, где нужно внести в него изменения. Если учёным нужно было заменить дефектный ген в геноме созданной в лаборатории исправленной копией, то сначала им требовалось выяснить, как разрезать дефектный ген на части, с локальным двухцепочечным разрывом ДНК, и затем внедрить исправленную копию гена. Столкнувшись с разрывом, клетка попыталась бы восстановить повреждение путем поиска подходящей хромосомы для копирования – и в этот момент она нашла бы синтетический ген, созданный учёными. По сути, учёные таким образом просто-напросто обманули бы клетку, заставив её «думать», что она была повреждена естественным образом, после чего начала репарироваться.

Специалисты лаборатории профессора Марии Ясин, исследователя из онкологического центра имени Слоуна-Кеттеринга, стали первыми играть в эту тонкую игру, решив провести эксперименты на клетках млекопитающих в 1994 году. Остальные учёные с интересом наблюдали за новаторской работой, построенной на модели двухцепочечного разрыва. Эксперимент по редактированию генов в лаборатории Ясин был весьма изобретательным. Ее стратегия заключалась в том, чтобы ввести такой фермент в клетки мыши, который разрезал геном на части, создавая двухцепочечный разрыв; в то же время она добавляла в клетки кусочек синтетической ДНК – шаблон для восстановления – который соответствовал вырезанной последовательности ДНК. Позже она проверяла, восстановили ли клетки мыши поврежденную ДНК, подключив внедрённый шаблон. Проведя один итот же эксперимент с добавленным ферментом и без него, Ясин смогла проверить свою гипотезу: искусственно созданный двухцепочечный разрыв повышает эффективность гомологичной рекомбинации.

Задача заключалась в том, чтобы придумать такой жизнеспособный фермент, который вырезал бы геном в одном конкретном месте из миллиардов возможных. Чтобы решить эту проблему, Ясин ловко украла молекулярный кусочек у дрожжей: эндонуклеазу I-Scel. Нуклеазы – это ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты; некоторые разрезают РНК, другие ДНК.

I-Scel, которую выбрала Мария Ясин, была одной из самых специфических эндонуклеаз, известных в то время, для которой требовалось идеальное совпадение 18 последовательных букв ДНК, чтобы разрезать конкретный сегмент цепи. Выбор именно этой эндонуклеазы был вполне обоснован: если бы Ясин выбрала случайный фермент, то он бы повсеместно разрезал геном, не только затрудняя интерпретацию результатов, но и нанося вред клетке-хозяину. Однако, учитывая специфичность линии из 18 букв подряд, I-Scel вырезал бы лишь одну последовательность ДНК из более чем 50 миллиардов возможных комбинаций (по иронии судьбы, у генома мыши даже не было соответствующей последовательности букв, поэтому перед попыткой эксперимента по редактированию генов Марии Ясин пришлось вставить копию последовательности в геном, чтобы фермент мог совершить расщепление в необходимом месте).

Результаты эксперимента Ясин оказались поразительны. Ей удалось заставить 10 процентов клеток точно восстановить мутировавший ген с помощью гомологичной рекомбинации. Возможно, сейчас этот показатель покажется низким, чтобы судить об успешности проведённого эксперимента, но на тот момент это был результат, в сотни раз превышающий достигнутые ранее. Это было самым многообещающим доказательством того, что процесс может позволить учёным переписать код генома без риска незаконной рекомбинации или случайного расщепления, как в случае с использованием переносчиков-ретровирусов. Всё, что требовалось от учёных, – ввести двухцепочечный разрыв в нужном месте, и клетки практически сделают всю работу за них.

С середины 1990-х годов исследователи бросились разрабатывать новые системы, которые, как I-Scel, могли бы точно нацеливаться на конкретные последовательности букв в ДНК. Учёные знали, что если они решат эту проблему, то смогут раскрыть весь потенциал редактирования генов. К системам редактирования генов следующего поколения предъявлялось три требования: они должны были способны распознавать определенную, желаемую последовательность ДНК; они должны были иметь возможность расщепить эту последовательность ДНК; и они должны были быть легко перепрограммируемы, чтобы отправлять их в отдельные участки для расщепления различных последовательностей ДНК. Соблюдение первых двух критериев было нужно для создания двухцепочечного разрыва, а третий необходим для широкого использования инструмента. I-Scel преуспел в первых двух, но с треском провалился на третьем. Чтобы создать программируемую систему разрезания ДНК, биоинженеры решили, что им нужно будет либо переоборудовать I-Scel для нацеливания и разрезания новых видов последовательностей, либо найти совершенно новый нуклеазный фермент, который уже эволюционировал до возможности расщепления различных последовательностей ДНК.

Усилия учёных по реорганизации I-Scel не увенчались успехом (что неудивительно, учитывая огромную молекулярную сложность белковых ферментов), и быстро стало очевидно, что поиск других нуклеазных ферментов будет гораздо более перспективным подходом. Фактически, после эксперимента Марии Ясин с I-Scel, учёные уже выделили десятки нуклеаз из широкого спектра организмов и определили точные последовательности ДНК, на которые они нацелены. Но была фундаментальная проблема: подавляющее большинство этих ферментов распознавало последовательности длиной всего шесть или восемь букв – слишком короткие для того, чтобы быть полезными. Эти последовательности встречались в человеческом мире десятки тысяч или даже сотни тысяч раз в человеческом геноме, что означает, что даже если бы нуклеаза могла стимулировать гомологичную рекомбинацию в одном гене, она уничтожила бы почти весь геном в процессе. Клетка будет уничтожена, прежде чем она сможет начать восстановление ДНК.

Исследователи не могли полагаться ни на одну из уже известных ранее нуклеаз, и было нецелесообразно искать новые ферменты для расщепления ДНК, такие, как I-Scel, всякий раз, когда возникала необходимость редактирования нового гена. Если редактирование генов в лечебных целях должно было стать действительным методом исправления мутаций, вызывающих заболевания, врачи не могли просто ждать, пока учёные придут к открытию той нуклеазы, которая будет целенаправленно рассекать конкретную область гена, в котором у пациента обнаруживалась вредоносная мутация.

В 1996 году было проведено исследование, меняющее парадигму, которое представило решение этой проблемы. В исследовательском университете Балтимора профессор Сринивасан Чандрасегаран понял, что вместо создания нуклеаз с нуля, поиска новых в природе или переделывания I-Scel он может использовать гибридный подход, выбирая части белков, которые существовали в природе, и комбинировать их. Он считал, что такие химерные нуклеазы будут отвечать первым двум требованиям нуклеазы, необходимой для редактирования генов: они смогут распознавать и вырезать определенную последовательность ДНК.

Чандрасегаран приступил к экспериментам с химерной нуклеазой, пытаясь адаптировать её для расщепления последовательности ДНК на определённых отрезках. Но как же внести двухцепочечный разрыв именно туда, куда нужно? Собственно задачу разрезания ДНК отлично выполняет нуклеаза Fold – белок, способный разрезать любую последовательность ДНК на некотором расстоянии от места распознавания. Именно его и применил профессор для своих экспериментов. Он использовал семейство встречающихся в природе белков, называемых белками цинковых пальцев, которые названы так, потому что они распознавали ДНК, используя удлинения, похожие на пальцы, удерживаемые вместе ионами цинка и расположенные рядом, как пальцы руки. Каждый цинковый палец, или ZFN (англ. – zinc-finger nucleases, ZFN), как правило, узнает три определенных нуклеотида.

Невероятно, но способ, открытый Чандрасегараном, работал. Его команда наглядно продемонстрировала, что, комбинируя разные цинковые пальцы, можно создать белок, который в клетке будет направленно привлекаться к определенной последовательности ДНК. Если прикрепить такой домен к нуклеазе, то полученный белок будет разрезать ДНК только в нужном месте! Вскоре Чандрасегаран стал сотрудничать с профессором Университета Юты Даной Кэрролл с целью научиться использовать эти цинксодержащие белки-нуклеазы. Вместе учёные продемонстрировали, что ZFN так же эффективны, если применить их к клеткам лягушек (популярная модельная система для биологов), и что ZFN-индуцированное разрезание ДНК стимулирует гомологичную рекомбинацию. Затем, проводя эксперименты на плодовых мушках, учёные из лаборатории Кэрролла запрограммировали новые ZFN для нацеливания на ген, участвующий в пигментации желтого тела, и показали, что эта стратегия может привести к точным генетическим изменениям в целом организме. Это стало очень важным событием для генного редактирования. Мало того, что ZFN были достаточно практичны для использования на животных, но, что было ещё более важным, они могли быть адаптированы для таргетинга на новые гены.

Более широкому научному сообществу, наблюдавшему за исследованиями учёных в области редактирования генов, достижение пришлось по нраву и возымело такой успех, что они тут же принялись разрабатывать ZFN для своих целей, пытаясь нацелить и на новые гены и работая над новыми моделями живых организмов. В 2003 году Мэтью Портеус и Дэвид Балтимор стали первыми, кто показал, что ген в клетках человека может быть точно отредактирован с помощью специально созданного ZFN. Вскоре после этого профессор генетики, геномики и эмбриологии Федор Урнов и его коллеги исправили мутацию, вызывающую Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит. Федор Урнов и его коллеги работали над человеческими Т-клетками с мутацией в гене, ответственном за Х-связанный тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID-X).

Они сконструировали ДНК-нуклеотиды с сильным сродством к мутации гена DICS-X. В присутствии двухцепочечной ДНК, называемой донором, введенной с плазмидой и несущей здоровую версию гена, эти нуклеазы вызывают расщепление ДНК, создавая благоприятные условия для гомологичных рекомбинаций между ДНК донора и ДНК клетки. Казалось, возможность использования стратегии редактирования генов для выявления генетических заболеваний никогда не была более реальной прежде!

Между тем ZFN были также приняты к использованию лабораториями, заинтересованными в редактировании генов для совершенно разных целей, таких как производство точно спроектированных сельскохозяйственных культур или моделей животных. В конце 2000-х годов эта технология была успешно применена к растениям табака и кукурузе, демонстрируя, что двухцепочечные разрывы ДНК способствовали высокоэффективной гомологичной рекомбинации во многих типах клеток, а не только в клетках млекопитающих. Одновременно стали появляться сообщения о том, что ZFN использовались для модификации генов у рыб, червей, крыс и мышей. Эта интригующая работа привлекала внимание всё большего числа различных специалистов благодаря захватывающему потенциалу.

Но несмотря на многообещающие эксперименты, ZFN никогда не были широко приняты вне кулуаров. Исследователи, которые использовали их, имели большой опыт в области белковой инженерии, сотрудничали с несколькими лабораториями, которые уже имели подобный опыт применения ZFN, либо же большие кошельки, чтобы платить за конструирование необходимой именно им нуклеазы. Проектирование ZFN оказалось простым – всё, что было нужно сделать учёным, – это просто объединить различные сегменты цинкового пальца таким образом, чтобы они распознавали последовательность ДНК, которую требовалось редактировать. Но применить данный маневр на практике было очень сложно. Большая часть недавно разработанных ZFN просто не распознавала последовательности ДНК, как ожидалось; другие же могли точно распознать участок ДНК для расщепления, но проблемы возникали в ходе последнего.