Текст книги "Состав: Как нас обманывают производители продуктов питания"

Сравним отпечатки: насколько натурален наш мед?

Итак, вот наша первая задача по криминалистике: определить, является ли мед в купленной нами баночке подлинным. Основной критерий, который используется при этом, – изучение «сахарного» отпечатка, то есть соотношения различных сахаров в составе продукта. Сахара не только составляют основную массу меда – их пропорция в нем более или менее постоянна независимо от места происхождения. Основной метод анализа смесей из органических веществ, в том числе сахаров, называется хроматографией. Вероятно, в школе вам приходилось проводить опыты по разделению разных цветов в составе чернил при помощи бумажного фильтра. Если нет, то сейчас мы вам быстро объясним. Бумажный фильтр, на который ученики нанесли чернила черного цвета, помещался в стакан, где содержалось ровно столько воды, сколько необходимо, чтобы намочить его нижний край. По мере намокания бумаги пигменты, оставленные черной ручкой, начинали растекаться. Пигменты разного цвета проходили разный путь, и таким образом чернила распадались на разные цвета, раскрашивая черную линию всеми цветами радуги. Так выглядит бумажная хроматография. Как и любой другой вид хроматографии, она основана на том, что анализируемая смесь распределяется между двумя фазами – подвижной (жидкой либо газообразной) и неподвижной (как правило, твердым веществом). Различные составляющие смеси перемещаются с различной скоростью и при переходе в неподвижную фазу оказываются в разных местах. Изучив расположение этих составляющих в твердой фазе, их можно сравнить с известными веществами и тем самым установить их принадлежность. Сахара, содержащиеся в меде, можно определить методом газовой хроматографии, но гораздо проще сделать это при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Этот метод основан на разделении сложных смесей посредством перевода их в жидкую подвижную фазу под высоким давлением, которое ускоряет процесс и позволяет применять метод к более широкому диапазону веществ. Благодаря высокой скорости и эффективности HPLC является одним из самых широко применяемых методов сепарации в аналитической химии.

Из рисунка 2.2 видно, что при помощи HPLC сахара, присутствующие в составе меда, разделяются на фруктозу, глюкозу и сахарозу, причем учитываются относительные пропорции содержания – именно этим определяется уникальный «сахарный» отпечаток меда. Натуральный мед практически всегда содержит указанные сахара в приведенном ниже соотношении:

• фруктоза: 31,2–42,4 %;

• глюкоза: 23,0–32,0 %;

• сахароза: 0–2,8 %.

Мед, в котором сахара содержатся в иных пропорциях, скорее всего, является поддельным.

{6}6
  ¹ Ng, C. M. & Reuter, W. M. 2015.Application Note: Analysis of sugars in honey using the PerkinElmer Altus HPLC system with RI detection;http://www.perkinelmer.co.uk/CMSResources/Images/44-171789APP_Analysis-of-Sugars-in-Honey-012101_01.pdf.


[Закрыть]

Низкое содержание сахарозы (знакомый нам тростниковый или свекольный сахар состоит именно из сахарозы) не оставляет мошенникам большой свободы действий, поскольку даже небольшая добавка сахарозы моментально обнаружится. Тем не менее случается и такое. Однако содержание фруктозы и глюкозы достаточно высоко и допускает разброс в показателях до 10 %. Это позволяет мошенникам добавлять в мед более дешевые виды этих сахаров или их смесей без всякого для себя риска, ведь метод HPLC не позволяет выявить эти примеси.

Наиболее сложно выявлять такой ингредиент, используемый при фальсификации меда, как высокофруктозный кукурузный сироп (HFCS). В США он используется в качестве сахарозаменителя и производится путем обработки кукурузного крахмала ферментами, которые преобразуют часть глюкозы во фруктозу. Производится множество вариаций HFCS, и один из них – HFCS55 – состоит из глюкозы и фруктозы, практически идентичных тем, что содержатся в натуральном меде. Таким образом, даже если результат анализа методом HPLC показывает, что перед вами настоящий мед, на деле это далеко не конец истории, особенно если имеются другие свидетельства вроде сомнительных документов, с которых и началось расследование.

Устойчивые изотопы спешат на помощь!

Каковы наши дальнейшие действия по установлению подлинности меда? Сахарный отпечаток утверждает, что перед нами натуральный продукт, однако подозрения развеяны не полностью. Теперь мы должны как-то выяснить, не был ли использован пресловутый HFCS – высокофруктозный кукурузный сироп. В попытках ответить на этот вопрос природа оказывается на нашей стороне. Все растения в мире делятся на две большие группы – С₃ и С₄ – в зависимости от того, каким путем они извлекают из атмосферы двуокись углерода (CO₂) в процессе фотосинтеза для изготовления собственных сахаров. Растения типа С₄ вынуждены были приспосабливаться к очень яркому освещению, высоким температурам и сухому климату, они экономнее расходуют воду. Для нас важно, что CO₂ существует в двух основных формах: ¹²CO₂ и ¹³CO₂. Они очень похожи и отличаются друг от друга только тем, что атом углерода (С) в ¹³CO₂ содержит один дополнительный нейтрон (и ¹²CO₂, и ¹³CO₂ являются устойчивыми изотопами углерода). Этот лишний нейтрон в целом никак не проявляет себя, так что ¹²CO₂ и ¹³CO₂ ведут себя примерно одинаково и встречаются одинаково часто. Тем не менее лишний нейтрон делает ¹³CO₂ несколько более тяжелым, чем ¹²CO₂. Чаще всего это не играет никакой роли, однако ферменты, участвующие в уловлении CO₂ в процессе фотосинтеза у всех без исключения растений, чувствительны к этой небольшой разнице в массе. В результате в сахарах, полученных растениями при помощи фотосинтеза, ¹³C содержится в меньшей пропорции, нежели в атмосфере. И далее (мы приближаемся к главному), растения типа С₃ содержат меньше ¹³C, чем растения типа С₄, именно за счет разницы в способе уловления CO₂. И мы можем использовать этот факт против мошенников!

К счастью для ученых, подавляющее большинство меда производится в регионах, в экосистемах которых доминируют растения типа С₃. Если исходить из принципа «Ты есть то, что ты ешь» (а в данном случае – «то, что собирают и срыгивают пчелы»), получается, что произведенный пчелами мед должен оставлять отпечаток, характерный для растений типа С₃. А вот кукуруза относится к растениям типа С₄, то есть при добавлении в мед HFCS мошенники неизбежно оставляют след в виде отпечатка растений этого типа. Смешивая высокофруктозный кукурузный сироп с медом, они изменяют в нем соотношение атомов углерода ¹²C и ¹³C в сторону увеличения доли последних. А это очень легко выявить при помощи спектрометра изотопных масс (IRMS), который представляет собой очень чувствительные весы, способные в точности определить долю ¹³C и ¹²C в биологических материалах, включая продукты питания. Впрочем, имеется одна загвоздка: пчеловоды часто подкармливают пчел сахаром, особенно в холодное время года, когда те не вылетают из ульев. Сахарный тростник тоже относится к растениям типа С₄, так что анализ любого добропорядочного меда, произведенного таким способом, будет давать те же результаты, что и анализ меда, разбавленного HFCS. Таким образом, результаты теста могут опорочить честное имя пчеловода, который пытается поддержать жизнь своего улья вполне законными методами. Именно поэтому ученым, тестирующим продукты питания, так важно досконально знать все нюансы производства.

С учетом описанной проблемы была разработана новая версия теста на устойчивые изотопы. Нелегальную добавку HFCS можно отследить, сопоставив соотношение ¹³C/¹²C в сахарах и белках, входящих в состав меда. Это соотношение в натуральном меде примерно одинаково, что прослеживается практически во всех видах натурального меда. Когда пчел подкармливают тростниковым сахаром, соответствующие изотопы оказываются включены в состав как сахаров, так и белков. Если же в мед добавляли HFCS, то соотношение изотопов углерода в сахарах изменится, а в белках – нет. Заметная разница в содержании изотопов углерода в сахарах и белках недвусмысленно указывает на фальсификацию, и таким путем можно отследить добавку HFCS начиная с 7 % от общего объема.

Если с умом использовать описанные методы, можно быть абсолютно уверенным в том, что мед, который мы намазываем на утренний тост, действительно натуральный. А как насчет остальных заявлений на этикетке?

Таинственный мед манука

Предположим, на нашей гипотетической баночке меда написано слово «манука», и это сразу заметно повышает ее цену. В одном британском супермаркете такой мед продается по £39,95 за 340 г. Мед манука производят пчелы, которые кормятся на особых деревьях манука, или Leptospermum scoparium, растущих в диких лесах Новой Зеландии и на юго-востоке Австралии. Согласно некоторым исследованиям, мед манука обладает целым рядом целебных свойств – в частности, беспрецедентным антибактериальным действием. Поскольку стоит это удовольствие недешево, мошенники слетаются на этот мед как мухи. Сообщалось, что бóльшая часть меда манука, который можно купить в супермаркетах и магазинах здорового питания по всему миру, – фальсификат.

По оценкам Новозеландской ассоциации производителей уникального меда манука (New Zealand Unique Manuka Factor Honey Association, UMFHA), в стране ежегодно производится около 1,5 т этого продукта. Примечательно, что при этом в мире ежегодно продается около 9,07 т меда, на этикетке которого значится слово «манука», то есть в шесть с лишним раз больше, чем производится. Только в Великобритании каждый год потребляют 1,8 т этого чудо-продукта. Здесь явно что-то не так.

Тестирование, которое проводилось в Великобритании Агентством по пищевым стандартам в 2011–2013 гг., выявило, что у большей части образцов меда, продаваемого под названием манука, просто нет заявленных антибактериальных свойств. Считается, что этими свойствами обладает только подлинный мед манука. И хотя доказано, что антибактериальные свойства меда с течением времени могут угасать, разброс в цифрах производимого и продаваемого продукта не может не наводить на подозрения. В ответ на это новозеландские СМИ в 2014 г. сообщили, что министерство добывающей промышленности (Ministry for Primary Industries) начало разработку нового регламента для меда манука. Также говорилось, что в целях поддержки этой инициативы Новозеландская ассоциация производителей уникального меда манука начала сбор образцов меда по всей стране. На основе этих образцов должен быть создан биохимический отпечаток меда манука, который впоследствии можно будет использовать как эталон при тестировании.

Но можно ли использовать описанные выше тесты, чтобы пойти еще на шаг дальше и однозначно подтвердить, что мед в нашей баночке – действительно манука? Это исключительно сложная проблема, над решением которой все еще бьются криминалисты в области пищевой индустрии. Традиционный подход заключается в анализе пыльцы, входящей в состав меда, на предмет ее происхождения. Пищевой стандарт меда манука допускает, что содержание пыльцы Leptospermum может составлять всего 70 %, однако анализ осложняется из-за родственного дерева канука (Kunzea ericoides), которое произрастает в тех же ареалах, что и манука, и имеет идентичную пыльцу. Кроме того, в Австралии имеется местный родственник дерева манука – тонкосемянник истодолистный (Leptospermum polygalifolium). Так что на сегодняшний день требуется разработать новый тест, который поможет отличить мед, получаемый от этих родственных растений, от меда манука, если уж нам так необходимо убедиться в его совершенной подлинности.

«Омики» и революция в тестировании продуктов

Чтобы разобраться с истинным происхождением меда манука, а также другими аспектами оценки подлинности меда, можно обратиться к так называемым постгеномным технологиям. «Омики» – это научный неологизм, служащий общим обозначением разделов современной биологии, которые заканчиваются на -омика: геномика, протеомика и метаболомика. Учитывая, что абсолютное большинство наших продуктов происходит из органического мира (по крайней мере, нам хотелось бы в это верить), применение этих дисциплин знаменует собой новую эпоху в выявлении многих видов пищевого мошенничества в XXI в. В общем, «омики» нацелены на выявление коллективных характеристик и количественную оценку биологических молекул, которые преобразуются в структуры, функции и динамику живых организмов. Сложно представить, как именно пресечение пищевого мошенничества соотносится с этим определением. Тем не менее первый вопрос, который встает при оценке подлинности продукта, – это происхождение вида, и именно в этом месте пересекаются интересы продовольственной инспекции и постгеномной науки.

Для начала скажем несколько слов об основных принципах, лежащих в основе «омик». Все организмы на нашей планете являются продуктом своей последовательности ДНК. Химические «кирпичики» ДНК называются нуклеотидами, а последовательность, в которой они располагаются, называется генетическим кодом. Геномика изучает структуру, функции и эволюцию этих последовательностей. Участки генетического кода – гены – содержат в себе схемы строения белков. Белки состоят из цепочек аминокислот и отличаются друг от друга главным образом последовательностью аминокислот в цепочках, их размером и формой. Как правило, белки ассоциируются у нас со строительным материалом, из которого состоят мышцы, однако помимо этого они являются катализатором метаболических реакций (ферментами), участвуют в репликации ДНК и переносят молекулы из одного места в другое (к примеру, гемоглобин – это белок крови, который переносит молекулы кислорода). Кроме того, белки служат чувствительными датчиками, отвечающими за восприятие разнообразных стимулов снаружи и изнутри нашего тела (так, гормональные рецепторы на поверхности клеток являются белками). Изучением структуры и функций белков занимается протеомика. И наконец, последний инструмент в наборе криминалиста, специализирующегося на пресечении пищевого мошенничества, – метаболомика. Как уже было сказано, геномика и протеомика основаны на анализе ДНК и белков соответственно. Метаболомика же занимается всеми остальными процессами, которые происходят в клетке. Возьмем, к примеру, токсикологический анализ. Моча, содержащая отходы клеточного метаболизма, может показать, какие изменения токсин вызвал в человеческом теле. Этот подход отличается от изолированного изучения органов с целью определения действия токсина. Мы очень скоро вернемся к метаболомике и геномике, но для того, чтобы убедиться в подлинности нашего меда манука, нам в первую очередь пригодится протеомика.

Потенциал протеомики

Мы уже упоминали, что состав устойчивых изотопов углерода в белках, входящих в состав меда, можно использовать для выявления примеси HFCS. Но белки – это не только состав устойчивых изотопов. В действительности протеомика является одной из передовых технологий в борьбе с пищевым мошенничеством. Последовательность аминокислот в белках может быть видоспецифической, а потому ее можно использовать для определения, к какому виду относится тот или иной неопознанный белок. Итак, почему же мы используем белки, а не ДНК для того, чтобы выяснить происхождение продукта? Во-первых, оборудование для анализа белков гораздо проще, тогда как ДНК-секвенсор далеко не всегда входит в стандартное оснащение аналитической лаборатории (впрочем, все меняется, и со временем анализ ДНК станет дешевле). Во-вторых, протеомика имеет фору при определении происхождения животных и растительных продуктов с высокой степенью переработки.

Протеомика как научный раздел биохимии существует уже более 20 лет. Метод протеомного анализа предполагает обработку неизвестного белка или смеси белков специальным ферментом под названием трипсин, который расщепляет белки на множество более мелких фрагментов, которые называются пептидами. Трипсин распознает определенные последовательности аминокислот и каждый раз расщепляет белок именно в этом месте, так что этот процесс предсказуем и воспроизводим. Получившаяся смесь фрагментов белков подвергается сепарации при помощи HPLC и дальнейшему анализу в масс-спектрометре, который распознает последовательности аминокислот в получившихся пептидах. Масс-спектрометр может очень точно определять вес отдельных пептидов, подвергать их дальнейшему расщеплению и замерять количество фрагментов каждого типа и порядок расположения в них аминокислот. Измеряя вес (молекулярную массу) и количество (концентрацию) каждого пептида, мы можем получить отпечатки высокой диагностической ценности. Их можно сравнивать с информацией, которая содержится в базах данных по последовательностям пептидов в известных белках из предыдущих образцов продукта. Таким образом, оценка происхождения продукта может достигать высокой степени точности. Позднее мы увидим, что этот подход особенно эффективен при определении фальсификации мяса, но как же он поможет нам удостовериться в подлинности происхождения нашего меда?

Пьер Джорджо Ригетти и его команда исследователей из Миланского технического университета предприняли попытку отделить белки меда, произведенного из нектара каштана, акации, подсолнуха, эвкалипта и апельсина{7}7
  Di Girolamo, F., D'Amato, A. & Righetti, P. G. 2012. Assessment of the floral origin of honey via proteomic tools. Journal of Proteomics 75(12): 3688–93.


[Закрыть]. К несчастью, концентрация белка в исследуемом меде оказалась гораздо ниже (во много раз), чем сообщалось ранее. Что еще печальнее, проведенный ими протеомный анализ показал, что все белки, которые им удалось обнаружить в образцах меда, за исключением одного, оказались продуктом жизнедеятельности пчел, а именно ферментами, содержащимися в пчелиной слюне. Попытки определить растение (при помощи пыльцы или нектара) по содержащимся в образцах белкам окончились неудачей, так что на данном этапе протеомика не дает ответа на вопрос о растении, послужившем источником для изготовления меда. Поэтому в поисках решения загадки меда манука мы обратимся к другим дисциплинам.

Магическая метаболомика

В ходе своей нормальной жизнедеятельности, например дыхания, питания, испражнения, все животные и растения производят биологический материал в виде различных соединений и смесей. В зависимости от географического происхождения и организма, который их произвел, эти соединения могут различаться по своему составу. Теоретически нам следовало бы применить сложные аналитические методы, чтобы получить высокоточный химический отпечаток этих соединений и определить, происходит ли наш мед манука от соответствующих деревьев, произрастающих в Новой Зеландии и Австралии.

Один из методов, который широко применяется в метаболомике, – ядерная магнитно-резонансная спектроскопия (ЯМР), о которой многие слышали в контексте медицинской диагностики. На самом деле этот метод был разработан в лабораториях аналитической химии, где его использовали для анализа строения органических молекул. Он основан на взаимодействии радиочастотного излучения с атомами молекул, помещенных в магнитное поле. В 2012 г. итальянские ученые продемонстрировали, что ЯМР-спектроскопию 600 МГц ¹H (где 600 МГц – рабочая частота, а ¹H – исследуемое ядро) можно использовать для определения ботанического происхождения различных видов меда{8}8
  Schievano, E., Stocchero, M., Morelato, E., Facchin, C. & Mammi, S. 2012. An NMR-based metabolomic approach to identify the botanical origin of honey. Metabolomics 8(4): 679–90.


[Закрыть]. В течение двух с лишним лет они собирали ЯМР-спектры 353 экстрактов монофлерного (акациевого, липового, апельсинового, эвкалиптового, каштанового) и падевого меда, произведенных в Италии, а также полифлерных видов меда. Им удалось определить специфические маркеры для каждого монофлерного меда, после чего они использовали метод метаболомического анализа на основе ЯМР в сочетании с многомерным статистическим анализом для определения различий между разными видами меда. Это не потребовало трудоемкой подготовки образцов: исследование было быстрым, воспроизводимым и, судя по всему, гораздо более объективным, чем анализ содержания пыльцы. Год спустя другая группа исследователей выделила 13 метаболитов в составе меда, у каждого из которых было как минимум одно явное совпадение с результатами анализа методом ¹H ЯМР. По итогам их работы стало возможно определять количественное содержание в меде различных соединений, в том числе углеводов и альдегидов, а также алифатических и ароматических органических кислот{9}9
  Ohmenhaeuser, M., Monakhova, Y. B., Kuballa, T. & Lachenmeier, D. W. 2013. Qualitative and quantitative control of honeys using NMR spectroscopy and chemometrics. ISRN Analytical Chemistry 2013: 825318.


[Закрыть]. Они использовали свой метод, чтобы определить количество различных соединений в меде манука, но не пытались с его помощью выявить различия этого и других видов меда.

Еще один подход в рамках метаболомики заключается в том, чтобы определить присутствующие в составе меда летучие органические соединения (органические соединения, испаряющиеся при комнатной температуре) с целью установить его географическое происхождение. Летучие соединения улавливаются из воздуха прямо над медом методом микроэкстракции твердой фазы (SPME). Для этого используется нить с полимерным покрытием, удерживающим летучие соединения. Затем эти соединения сепарируются при помощи различных техник хроматографии и подвергаются дальнейшему анализу в масс-спектрографе. Данные по летучим соединениям, полученным из различных видов меда, используются для создания модели, позволяющей определить географическое и ботаническое происхождение этих разновидностей меда. После этого модель может быть использована для анализа новых разновидностей и определения их происхождения.

В 2014 г. группа исследователей из Дрездена применила метод SPME для анализа летучих соединений меда манука, а также идентичного ему по составу пыльцы меда канука и близкородственного меда, полученного из тонкосемянника истодолистного{10}10
  Beitlich, N., Koelling-Speer, I., Oelschlaegel, S. & Speer, K. 2014. Differentiation of manuka honey from kanuka honey and from jelly bush honey using HS-SPME-GC/MS and UHPLC-PDA-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 62: 6435–44.


[Закрыть]. Ученые сопоставили результаты анализа летучих соединений с анализом нелетучих соединений методом HPLC и масс-спектрометрии. Были исследованы сложные химические отпечатки восьми образцов меда манука, семи образцов меда канука и одного образца меда тонкосемянника истодолистного. В результате применения хемометрического подхода, который подразумевает прогрессивные методы статистического анализа, ученым удалось определить характерную субстанцию каждого образца, что позволило разделить образцы на три группы. И хотя благодаря этой процедуре они смогли верно классифицировать каждый из проанализированных образцов, эта модель сработала лишь благодаря высокому качеству входных данных. Исследователи признали, что, несмотря на большой потенциал использованного метода, он пока не опробован на больших объемах. Для того чтобы с его помощью можно было определить подлинность любого меда, на этикетке которого значится слово «манука», необходимо собрать большую базу данных по образцам меда, произведенного в разные годы в разных частях Новой Зеландии. Тем не менее в деле установления подлинности меда метаболомику ждет большое будущее.