Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

4.5 Влияние различных факторов на жизнедеятельность МО

Хлор, йод, бром, фтор. Роль галогенов в жизни микробов и их биохимической деятельности неизвестна. Показано, что эти элементы входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола. Нередко хлор и бром выступают в качестве антагонистов в процессе биосинтеза названных антибиотиков.

Вода . Известно, что вода играет чрезвычайно важную роль во всех жизненных процессах, хотя сама по себе она не является питательным веществом или источником энергии. Она входит в живую клетку как важнейшая ее часть и составляет единую систему с элементами клетки. Вода – растворитель, способствующий проникновению в клетку необходимых веществ и выводу из клетки продуктов обмена. В клетках вода находится не только в виде чистого растворителя, но также в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органических молекул – важнейший этап в превращении химических компонентов протоплазмы.

Поступление воды в бактериальную клетку регулируется цитоплазматической мембраной.

Неизвестно, какую роль в метаболизме микроорганизмов имеют связанная вода, тяжелая вода и различные полимеры воды (Н₂О; (Н₂О)₂; (Н₂О)₃ и т. д.). В литературе имеются данные о том, что связанная вода влияет на устойчивость бактериальных спор к действию неблагоприятных условий. Установлено, что скорость роста Е. coli более низкая в среде, приготовленной на свежей дистиллированной воде (преимущественно моно– и дигидрол), чем в среде, приготовленной на воде свежерастопленного льда (преимущественно тригидрол).

Высокополимеризированные молекулы воды являются весьма важными во многих физиологических процессах. Этим самым, по мнению некоторых авторов, объясняется богатство микрофлоры в Северном океане.

Сведения о влиянии воды различных форм на процесс антибиотикообразования у микроорганизмов отсутствуют.

Влияние рН среды. Активная кислотность (рН) среды оказывает существенное влияние на развитие микроорганизмов, на характер их обмена и, следовательно, на процесс образования антибиотиков. Влияние рН может проявляться как непосредственное воздействие ионов водорода или гидроксильных ионов на клетку или как косвенное действие через изменение степени диссоциации веществ субстрата. Изменения рН среды заметно сказываются на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.д. Таким образом, изменение активной кислотности среды оказывает значительное влияние на выход конечных продуктов метаболизма микроорганизмов.

Перед посевом микроорганизма, в первую очередь необходимо проверить значение рН среды.

Многие бактериальные организмы, образующие антибиотики, развиваются лучше при нейтральном значении исходной активной кислотности среды (рН около 7,0). Хотя некоторые бактерии, например молочнокислые стрептококки, синтезирующие низин, развиваются в среде при рН, равном от 5,5до 6,0.

Большинство актиномицетов-антагонистов хорошо развивается в тех случаях, когда начальное значение рН среды находится в пределах от 6,7 до 7,8. В подавляющем большинстве случаев актиномицеты не развиваются при уровне рН ниже 4.

В последние годы выделены ацидофильные стрептомицеты, оптимум рН развития которых лежит в пределах от 3,5 до 6,5.

Грибы, как правило, могут развиваться при слабокислой начальной реакции среды (рН равно от 4,5 до 5).

В ходе развития организмов происходит изменение рН среды, которое зависит как от состава субстрата, так и от физиологических особенностей самого организма.

Иногда можно заранее сказать, в какую сторону будет идти изменение рН субстрата при развитии на нем того или иного микроорганизма. Так, если в среде в качестве единственного источника азота присутствует физиологически кислая соль (например, аммоний сернокислый) и отсутствуют в достаточном количестве, например, ионы кальция, то при развитии любых организмов, использующих азот аммония, будет идти довольно сильное подкисление субстрата. И, наоборот, если в среде имеется в качестве единственного источника азота физиологически щелочная соль (например, KNO₃), то при использовании азота этого соединения будет идти подщелачивание субстрата. Среда, как правило, будет подщелачиваться и в том случае, если организм при развитии в качестве источников углерода активно использует соли органических кислот.

Следует отметить, что как сильное подкисление, так и значительное подщелачивание субстрата может приостановить развитие организма, прекратить процесс образования антибиотика.

Следовательно, составлять среды надо с таким расчетом, чтобы при развитии организмов в них рН среды по возможности остался в пределах нормы, необходимой для развития микроба и биосинтеза антибиотического вещества.

Температура. Для нормального развития микроорганизмов и образования ими антибиотических веществ необходима определенная температура.

Различные группы микроорганизмов для своего развития с образованием антибиотиков нуждаются в различных оптимальных температурах. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в границах от 30 °C до 37 °C. Для B. brevis – продуцента грамицидина С – оптимальной температурой для развития и биосинтеза антибиотика является 40 °C. Хотя этот же организм может нормально развиваться и синтезировать антибиотик и при температуре 28 °C, при этом лишь максимум накопления грамицидина запаздывает примерно на 24 часа. Актиномицеты – продуценты антибиотиков, как правило, культивируются при температуре от 26 °C до 30 °C, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных температурах (от 0 °C до 18 °C), так и при повышенных (от 55 °C до 60 °C). Для большинства плесневых грибов оптимальной признана температура от 25 °C до 28 °C. Для термофильных микроорганизмов температурный оптимум лежит в пределах от 50 °C до 65 °C.

Отклонение температуры развития в ту или другую сторону обычно вызывает замедление роста микроорганизма и снижение выхода антибиотика. Обусловлено это тем, что температура оказывает существенное влияние на активность ферментов продуцентов антибиотиков, активность транспортных систем и на другие важные физиолого-биохимические функции микробной клетки. Так, транспорт нейтральных аминокислот в клетки актиномицетов осуществляется стереоспецифической транспортной системой, единой для всех этих аминокислот. Поступление в клетки актиномицета L-валина – основного компонента биосинтеза остатков L-метил-L-валина и D-валина в полипептидных цепях актиномицинов – происходит с помощью системы активного транспорта. Активность этой системы заметно изменяется в зависимости от температуры, проявляя максимум в пределах от 18 °C до 23 °C.

Аэрация – один из существенных факторов условий культивирования, определяющих характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность.

Большинство изученных продуцентов антибиотиков – аэробы, а потому для их оптимального развития необходима определенная степень аэрации среды. Известно, что степень аэрации служит одним из обычных способов изменения окислительно-восстановительных условий, которые являются основным средством изменения процессов обмена веществ у микроорганизмов, в том числе и процессов, связанных с образованием антибиотиков.

Аэрирование культур осуществляется в основном тремя способами:

а) путем продувания определенного объема воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием или без него;

б) путем встряхивания культуральной жидкости, находящейся в колбах, на специальных аппаратах;

в) путем выращивания микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды.

Наиболее совершенным методом аэрации следует признать метод продувания воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием. В этом случае степень аэрации культуры можно учитывать количественно.

Степенью аэрации культуры, равной единице, является такая аэрация, при которой через определенный объем среды за одну минуту продувается такой же объем воздуха. Иными словами, степень аэрации равна единице, если через 100 л культуральной среды пропускается за одну минуту 100 л воздуха. Если степень аэрации равна 0,5, то это означает, что через 100 л культуральной жидкости пропускается в минуту 50 л воздуха.

Установлено, что если степень аэрации близка к единице, происходит максимальное накопление ряда антибиотиков (пенициллина, стрептомицина и др.). Уменьшение степени аэрации среды или ее чрезмерное увеличение приводит к уменьшению выхода антибиотика.

Интенсивность аэрации определяется скоростью поступления в реакцию кислорода, растворенного в единице объема среды. Для количественных результатов определения растворенного в среде кислорода часто используют специальные датчики. Наиболее удобны платиновые электроды, защищенные от окружающей среды газопроницаемой пленкой.

Применение сульфитного метода при определении интенсивности аэрации позволяет получить лишь сравнительную оценку, но не дает данных по количественному содержанию кислорода в субстрате.

Насыщение культуральной среды кислородом зависит не только от количества воздуха, пропускаемого через единицу объема среды, но и от способа перемешивания, скорости работы мешалок, состава среды и концентрации растворенных в ней веществ, а также от температуры культивирования.

Перемешивание культуральной жидкости способствует равномерному распределению питательных веществ и перемещению их к клеткам микроорганизма. Перемешивание обеспечивает также удаление с поверхности клеток продуктов обмена и лизиса клеток, более равномерное распределение кислорода в культуральной жидкости. Все это улучшает условия развития микроорганизмов и повышает их физиолого-биологическую активность, связанную с биосинтезом антибиотиков.

При культивировании микроорганизмов в колбах на качалках степень аэрации среды зависит от числа оборотов качалки в минуту и объема культуральной жидкости: чем меньше объем среды в колбе, тем выше ее аэрация. Поглощение кислорода средой увеличивается, если вместо обычных конических колб применяются колбы с отбойниками.

Степень аэрации культур, выращиваемых в виде пленки на поверхности жидкой среды, можно регулировать изменением площади развития организма и толщины слоя жидкости. С увеличением площади развития организма и уменьшением слоя жидкости аэрация культуры будет большей.

Интенсивность аэрации культуры продуцента того или иного антибиотика должна коррелировать с составом среды. С повышением концентрации компонентов среды для развития продуцентов ряда антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, новобиоцина, хлортетрациклина, окситетрациклина и др.) интенсивность аэрации культуры необходимо повышать.

Изменения условий аэрации приводит не только к изменению процесса обеспечения продуцента антибиотика кислородом, удалению из среды углекислого газа и других летучих продуктов метаболизма, но и к изменению характера обмена веществ организма. Так, например, в условиях ухудшения аэрации среды для развития S. aureofaciens в культуральной жидкости повышается содержание летучих органических кислот и снижается биосинтез тетрациклина.

Следовательно, только при учете всех особенностей культивирования организма, при изучении влияния различных компонентов субстрата, физикохимических и физических факторов среды можно определить способность микроорганизма образовывать антибиотическое вещество. Создавая организму разнообразные условия культивирования, мы тем самым определяя, какие из них наиболее благоприятны для выявления потенциальных возможностей биосинтеза антибиотиков.

Вопросы для самоконтроля по разделу «Образование антибиотиков»

1. Генетические методы получения активных продуцентов АБ

2. Среды для культивирования микроорганизмов

3. Качественная характеристика компонентов питательной среды

4. Источники минерального питания и их роль в развитии МО

5. Макроэлементы и их значение в жизнедеятельности МО

6. Микроэлементы и их физиологическая роль

7. Влияние различных факторов на жизнедеятельность МО

5 Классификация антибиотиков

Антибактериальные препараты (АБП) получают в ходе промышленного производства и для них характерна общность с антибиотиками механизмов и типов воздействия на микробную клетку (при отсутствии негативного воздействия на макроорганизм).

В настоящее время различают несколько видов классификации АБП:

1) по механизму действия на бактериальную клетку (воздействие АБП на отдельные компоненты бактериальной клетки);

2) по спектру действия

а) препараты, действующие преимущественно на грамположительные и грамотрицательные кокки, некоторые грамположительные микроорганизмы. К ним относятся бензилпенициллин, бициллины, феноксиметилпенициллин, пенициллиназоустойчивые пенициллины, цефалоспорины 1-го поколения, макролиды, ванкомицин;

б) антибиотики широкого спектра действия, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных палочек: хлорамфеникол, тетрациклины, аминогликозиды, полусинтетические пенициллины широкого спектра действия (ампициллин, азлоциллин и др.) и цефалоспорины 2-го поколения;

в) антибиотики с преимущественной активностью в отношении грамотрицательных палочек (полимиксины, цефалоспорины 3-го поколения);

г) противотуберкулезные антибиотики (стрептомицин, рифампицин); д) противогрибковые антибиотики (нистатин, леворин, гризеофульвин, амфотерицин В, кетоконазол, анкотил, дифлюкан и др.);

3) по происхождению классифицируются в зависимости от продуцента АБП, а также в зависимости от условий биосинтеза (происхождения) все АБП подразделяются на: природные – продукты жизнедеятельности микроорганизмов, получаемые в ходе биосинтеза; полусинтетические – результат химической трансформации молекулы природного АБ; синтетические – несуществующие в природе вещества, полученные в ходе полного химического синтеза;

4) по химическому строению классифицируются на основании общих признаков в химическом составе АБП;

5) по типу воздействия на микробную клетку выделяют следующие группы АБ: бактерицидные – способные вызывать лизис клетки, и бактериостатические – приостанавливающие размножение.

Бактерицидные АБП – пенициллины, фторхинолоны и хинолоны, ванкомицин, ко-тримоксазол, нитроимидазолы, рифампицин, полимиксины, фосфомицин, диоксидин. Бактерицидные препараты обычно более предпочтительны для лечения тяжелых инфекционных заболеваний (эндокардита, менингита, сепсиса, остеомиелита, инфекций у больных с иммунодефицитами).

Бактериостатические АБП – тетрациклины, хлорамфеникол (левомицетин) и другие фениколы, макролиды, линкосамиды, сульфаниламиды, нитрофураны. Некоторые бактериостатические АБ (новые макролиды, особенно – азитромицин, нитрофураны, клиндамицин, хлорамфеникол) в высоких концентрациях способны проявлять бактерицидное действие в отношении определенных бактерий. Один и тот же АБП может проявлять различное действие на различные бактерии: хлорамфеникол (левомицетин) действует на гемофильную палочку и пневмококк бактерицидно, а для энтеробактерий он является бактериостатическим препаратом.

5.1 Классификация антибиотиков по механизму действия

Мишени действия АБП в различны и находятся либо в клеточной мембране, либо внутри клетки (рисунки 14, 15).

По механизму антимикробного действия антибиотики можно разделить на следующие группы:

• ингибиторы синтеза клеточной стенки (муреина);

• вызывающие повреждение цитоплазматической мембраны;

• подавляющие белковый синтез;

• ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот.

Рисунок 14 – Основные механизмы действия антибактериальных препаратов (Michele German-Fattal, 1999 г.)

Рисунок 15 – Механизмы действия антибиотиков

Механизмы действия различных групп β-лактамных антибиотиков.

Общим фрагментом в химической структуре БЛА является β-лактамное кольцо, именно с его наличием связана микробиологическая активность этих препаратов.

Мишенью действия БЛА в микробной клетке являются ферменты транси карбоксипептидазы, участвующие в синтезе основного компонента наружной мембраны как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов – пептидогликана.

Благодаря способности связываться с пенициллином (и другими БЛА) эти ферменты получили второе название – пенициллинсвязывающие белки (ПСБ). Молекулы ПСБ жестко связаны с цитоплазматической мембраной микробной клетки, они осуществляют образование поперечных сшивок.

Связывание БЛА с ПСБ ведет к инактивации последних, прекращению роста и последующей гибели микробной клетки. Таким образом, уровень активности конкретных БЛА в отношении отдельных микроорганизмов в первую очередь определяется их аффинностью (сродством) к ПСБ. Для практики важно то, что чем ниже аффинность взаимодействующих молекул, тем более высокие концентрации антибиотика требуются для подавления функции фермента.

Однако для взаимодействия с ПСБ антибиотику необходимо проникнуть из внешней среды через наружные структуры микроорганизма. У грамположительных микроорганизмов капсула и пептидогликан не являются существенной преградой для диффузии БЛА. Практически непреодолимой преградой для диффузии БЛА является липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий. Единственным путем для диффузии БЛА служат пориновые каналы внешней мембраны, которые представляют собой воронкообразные структуры белковой природы, и являются основным путем транспорта питательных веществ внутрь бактериальной клетки.

Механизм действия препаратов группы пенициллинов и цефалоспоринов. Пенициллины (и все другие β-лактамы) обладают бактерицидным эффектом. Мишень их действия – пенициллиносвязывающие белки (ПСБ) бактерий, которые выполняют роль ферментов на завершающем этапе синтеза пептидогликана – биополимера, являющегося основным компонентом клеточной стенки бактерий. Блокирование синтеза пептидогликана приводит к гибели бактерии.

Поскольку пептидогликан и пенициллиносвязывающие белки отсутствуют у млекопитающих, специфическая токсичность в отношении макроорганизма для β-лактамов нехарактерна.

Механизм действия препаратов группы карбопенемы. Карбапенемы оказывают мощное бактерицидное действие, обусловленное нарушением образования клеточной стенки бактерий. По сравнению с другими β-лактамами карбапенемы способны быстрее проникать через наружную мембрану грамотрицательных бактерий и, кроме того, оказывать в отношении них выраженный постантибиотический эффект (ПАЭ).

Механизм действия препаратов группы монобактамы . Азтреонам обладает бактерицидным эффектом, который связан с нарушением образования клеточной стенки бактерий.

Группа аминогликозидов. Аминогликозиды оказывают бактерицидное действие, которое связано с нарушением синтеза белка рибосомами. Степень антибактериальной активности аминогликозидов зависит от их максимальной (пиковой) концентрации в сыворотке крови. При совместном использовании с пенициллинами или цефалоспоринами наблюдается синергизм в отношении некоторых грамотрицательных и грамположительных аэробных микроорганизмов.

Группа тетрациклинов. Тетрациклины обладают бактериостатическим эффектом, который связан с нарушением синтеза белка в микробной клетке.

Группа макролидов. Антимикробное действие макролидов обусловлено нарушением синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных микроорганизмов. Молекула антибиотика способна обратимо связываться с каталитическим пептидил-трансферазным центром (P-site) рибосомальной 50Sсубъединицы и вызывать отщепление комплекса пептидил-тРНК (представляющего собой растущую пептидную цепь) от рибосомы. При этом нарушается цикличность последовательного присоединения пептидной цепи к пептидилтрансферазному центру (P-site) и акцепторному аминоацил-тРНК-центру (Asite) 50S-субъединицы, то есть ингибируются реакции транслокации и транспептидации (рисунок 16).

M – точка приложения действия макролидов

Рисунок 16 – Механизм синтеза белка в рибосоме бактериальной клетки. (по P. Vanuffel, C. Cocito (1996))

В результате приостанавливается процесс формирования и наращивания пептидной цепи. Связывание макролидов с 50S-субъединицей возможно на любой стадии рибосомального цикла. Выявлено, что 14– и 16-членные макролиды отличаются по особенностям связывания с различными доменами пептидилтрансферазного центра (рисунок 17).

Связывание с 50S-субъединицами рибосом характерно также для антибиотиков других групп: линкосамиды, стрептограмины. Наиболее перспективным является комбинированный препарат хинупристин/дальфопристин, обладающий in vitro высокой активностью против множественнорезистентных штаммов стафилококков и ванкомицинрезистентных E. faecium) и хлорамфеникол. Несмотря на то, что по особенностям связывания с доменами пептидилтрансферазного центра данные антибиотики отличаются от макролидов, при одновременном назначении между ними возможна конкуренция и ослабление антимикробного эффекта.

ВИР-S – виргиниамицин-S; ЭРИТ – эритромицин; ВИР-М – виргиниамицин-М; СПИР – спирамицин; ЛИН – линкомицин.

Рисунок 17 – Участки связывания различных антибиотиков с 50Sсубъединицей рибосомы (по M. Di Giambattista и соавт. (1987))

Группа линкозамидов. Линкозамиды оказывают бактериостатическое действие, которое обусловлено ингибированием синтеза белка рибосомами. В высоких концентрациях в отношении высокочувствительных микроорганизмов могут проявлять бактерицидный эффект.

Группа левомицетина. Левомицетин оказывает бактериостатическое действие, которое связано с нарушением синтеза белка рибосомами. В высоких концентрациях обладает бактерицидным эффектом в отношении пневмококка, менингококка и H. influenzae.

Группа полимиксинов. Полимиксины оказывают бактерицидное действие, которое связано с нарушением целостности цитоплазматической мембраны микробной клетки.

Группа гликопептидов. Гликопептиды нарушают синтез клеточной стенки бактерий. Оказывают бактерицидное действие, однако в отношении энтерококков, некоторых стрептококков и КНС действуют бактериостатически.

Группа хинолонов/фторхинолонов. Хинолоны оказывают бактерицидный эффект. Ингибируя два жизненно важных фермента микробной клетки – ДНК-гиразу и топоизомеразу IV, нарушают синтез ДНК.

Группа оксазолидинонов. Линезолид оказывает преимущественно бактериостатическое действие за счет нарушения синтеза белка. В отношении пневмококка, B. fragilis и C. perfringens действует бактерицидно. Перекрестной резистентности с другими классами АМП не отмечено.

Группа сульфаниламидов. Сульфаниламиды обладают бактериостатическим эффектом. Являясь по химической структуре аналогами ПАБК, они конкурентно ингибируют бактериальный фермент, ответственный за синтез дигидрофолиевой кислоты – предшественника фолиевой кислоты, которая является важнейшим фактором жизнедеятельности микроорганизмов. В средах, содержащих большое количество ПАБК, таких как гной или продукты распада тканей, антимикробное действие сульфаниламидов значительно ослабляется.

Некоторые препараты сульфаниламидов для местного применения содержат серебро. В результате диссоциации ионы серебра медленно высвобождаются, оказывая бактерицидное действие (за счет связывания с ДНК), которое не зависит от концентрации ПАБК в месте применения.

Ко-тримоксазол. Сульфаметоксазол конкурентно замещает ПАБК и препятствует образованию дигидрофолиевой кислоты. Триметоприм, в свою очередь, блокирует следующий этап метаболизма фолиевой кислоты, нарушая образование тетрагидрофолиевой кислоты. Ко-тримоксазол оказывает бактерицидное действие.

Группа нитроимидазолов. Нитроимидазолы оказывают избирательный бактерицидный эффект в отношении тех микроорганизмов, ферментные системы которых способны восстанавливать нитрогруппу. Активные восстановленные формы препаратов нарушают репликацию ДНК и синтез белка в микробной клетке, ингибируют тканевое дыхание.

Группа нитрофуранов. Являясь акцепторами кислорода, нитрофураны нарушают процесс клеточного дыхания бактерий, ингибируют биосинтез нуклеиновых кислот. В зависимости от концентрации оказывают бактериостатический или бактерицидный эффект. К нитрофуранам редко развивается лекарственная резистентность микроорганизмов.

Препараты других групп представлены в таблице 8.

Таблица 8 – Механизм действия антибактериальных препаратов других групп

Противотуберкулезные химиопрепараты представлены в таблице 9.

Таблица 9 – Механизм действия противотуберкулезных химиопрепаратов

Противогрибковые химиопрепараты представлены в таблице 10.

Таблица 10 – Механизм действия противогрибковых химиопрепаратов

Противовирусные химиопрепараты представлены в таблице 11.

Таблица 11 – Механизм действия противовирусных химиопрепаратов

Противопротозойные химиопрепараты Класс противопротозойных препаратов включает различные по химической структуре соединения (таблица 12), применяющиеся при инфекциях, вызванных одноклеточными простейшими: малярийными плазмодиями, лямблиями и др. Возрастание интереса к противопротозойным препаратам, отмечаемое в последние годы, связано, прежде всего с усилившейся миграцией населения и, в частности, с участившимися поездками в регионы, эндемичные по различным протозойным инфекциям.

Таблица 12 – Механизм действия противопротозойных химиопрепаратов

Противогельминтные химиопрепараты представлены в таблице 13.

Таблица 13 – Механизм действия противогельминтных химиопрепаратов