Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

3.3 Методы идентификации микроорганизмов продуцентов антибиотических веществ

После того как микроорганизм, обладающий ценными антибиотическими свойствами, тем или иным способом выделен из субстрата, необходимо определить принадлежность этого организма к определенному виду. Следовательно, исследователи должны владеть методами идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков. Известно, что определение видовой принадлежности микроорганизмов задача нелегкая, требующая больших навыков и умения.

При определении вида микроорганизма-продуцента антибиотического вещества используется большой комплекс признаков. В первую очередь используются признаки, легко наблюдаемые при культивировании организмов визуально или с помощью микроскопа, такие как морфологические (форма колоний на твердых средах, форма и размеры клеток, спор и спороносцев, характер спорообразования, наличие жгутиков, капсул или слизи вокруг клеток и другие признаки) и культуральные (характер роста организма на различных средах, наличие или отсутствие окраски субстрата и самих клеток, развитие в аэробных или анаэробных условиях, температурный оптимум развития и т.д.) признаки.

Однако установлено, что морфологических и культуральных признаков микроорганизмов часто бывает недостаточно для определения вида микроорганизма. Тем более это трудно сделать в группах микробов, близко стоящих друг к другу в родовом отношении.

Поэтому наряду с морфологическими и культуральными признаками для идентификации выделенных микроорганизмов используют и другие признаки. К их числу относятся физиологические и биохимические особенности организмов.

Под физиологическими свойствами микроорганизмов необходимо иметь в виду биохимическую сущность и биологическое значение тех процессов, которые совершаются в культуре, а не простую констатацию явлений (например, разжижение желатины, пептонизация молока и т.п.), которые иногда обнаруживаются на случайно взятых и часто неизвестных по составу средах.

К биохимическим особенностям микроорганизма относятся характер и пути превращения компонентов субстрата с образованием типичных для данного вида продуктов обмена (кислот, спиртов, пигментов, витаминов, антибиотиков, аминокислот и др.), типичные реакции метаболизма, характеризующие биосинтетические процессы в клетке, последовательность оснований нуклеиновых кислот, специфичная для разных видов организмов, а также другие признаки.

В последнее время все чаще и чаще для определения видов используют серологические реакции, которые весьма специфичны и позволяют дифференцировать виды, близко стоящие друг к другу. Реакции агглютинации и преципитации находят применение для идентификации не только бактериальных организмов, но и актиномицетов.

Для дифференциации видов бактерий и актиномицетов с успехом используют бактериофаги и актинофаги. Для распознавания видов актиномицетов лучшими признаны актинофаги, выделенные из лизогенных культур актиномицетов. Обычно такие фаги оказываются более специфичными по характеру и спектру их действия.

Однако при использовании актинофагов для дифференцирования видов следует иметь в виду и те трудности, которые обнаруживаются при этом. Необходимо помнить, что среди актиномицетов нередко встречаются штаммы, устойчивые к фагам, а среди актинофагов имеются и полифаги, лизирующие клетки многих видов актиномицетов. Все это свидетельствует о том, что использование фагов для идентификации видов может иметь лишь вспомогательное значение, т.е. служить дополнительным признаком.

Определенное значение при идентификации видов актиномицетовантагонистов, принадлежащих к одной группе, имеет метод, основанный на специфическом действии микробов-антагонистов. Специфичность действия микробов-антагонистов состоит в том, что, например, продуценты стрептомицина, выделенные из различных районов земного шара, не подавляют развитие друг друга. Такая закономерность характерна и для других видов актиномицетов.

Исходя из этого, предложено для идентификации внешне сходных культур актиномицетов применять метод так называемого перекрестного антагонизма.

Перекрестный антагонизм. Метода основан на том, что агаровые блочки с одним видом выращенного актиномицета помещают на поверхность агаровой пластинки, засеянной другим видом актиномицета. В качестве тесткультуры используется тот же штамм организма. При этом обнаруживается, что один вид актиномицета-антагониста подавляет рост других видов актиномицетов и не подавляет развитие своего вида (таблице 1).

Таблица 1 – Перекрестный антагонизм у некоторых видов актиномицетов (по Красильникову, 1951)

Метод специфики межвидового антагонизма может быть использован лишь при идентификации внешне очень близких видов актиномицетов и, повидимому, не может оказать существенной помощи при систематике далеко стоящих видов. Однако необходимо иметь в виду, что при перекрестном антагонизме изучаемый штамм актиномицета иногда не подавляет роста других известных видов, но он может не принадлежать ни к одному из этих видов. Так, Str.griseus не подавляет роста Str.rimosus, хотя это совершенно различные виды. Или в присутствии Sir.lavendulae не происходит подавления развития Sir.griseus (таблица 2).

Таблица 2 – Явление перекрестного антагонизма между отдельными видами актиномицетов (по Teillon, 1951)

При использовании метода перекрестного антагонизма следует иметь в виду также возможность самоугнетения, которое иногда имеет место среди некоторых штаммов актиномицетов. Культура Str.lavendulae штамм 2335 выделяет вещества, вызывающие самоугнетение, напоминающее действие лизинов. Вокруг агаровых блочков этой культуры образуются зоны отсутствия роста Str.lavendulae. Природа этих веществ пока неизвестна.

Оценивая все случаи, которые могут иметь место при использовании метода перекрестного антагонизма, следует заметить, что данный метод не помогает решению вопроса идентификации видов, но может оказать большую помощь при подразделении на виды культур внутри отдельных групп актиномицетов. Широкое применение при идентификации микроорганизмовпродуцентов антибиотиков нашли и другие методы.

Использование форм организмов, устойчивых к определенному антибиотическому веществу. В основу этого метода положены два основных признака, связанных с образованием и действием антибиотиков.

1. Каждый антибиотик образуется одним или несколькими определенными видами микробов.

2. Микроорганизмы, устойчивые к определенному антибиотику, устойчивы также к антибиотическим веществам, близким по химическому строению и биологическим свойствам к первому антибиотику. Вместе с тем они могут обладать чувствительностью к антибиотикам, имеющим другую химическую природу и, следовательно, другое биологическое действие.

Определение антибиотика, образуемого неизвестным организмом, может быть проведено путем испытания его биологического действия на ряд микроорганизмов, чувствительных и устойчивых к известным антибиотикам. Таким путем можно выяснить сходство или различие биологического действия изучаемого вещества и известных антибиотиков и тем самым решить вопрос о химическом сходстве или различии этих веществ.

Для исследования этого явления изучаемый организм высевают на поверхность питательного агара в виде штриха или в виде отдельной макроколонии в центре чашки Петри. Образуемое организмом антибиологическое вещество диффундирует в окружающий агар и создает определенную зону. Пересекая эту зону чувствительными и устойчивыми к определенному антибиотику микроорганизмами, можно выяснить сходство биологического действия изучаемого препарата с известным антибиотиком. Установив сходство биологического действия исследуемого вещества с известным антибиотиком, можно предположить, что изучаемое соединение относится к определенной группе антибиотических веществ и образуется соответствующими организмами.

Однако следует иметь в виду, что оценка принадлежности изучаемого организма к тому или иному виду продуцентов может быть лишь ориентировочной. Так, было известно, что b-лактамные антибиотики образуются только плесневыми грибами, но последующие исследования показали, что антибиотические вещества этой природы образуют некоторые виды стрептомицетов и собственно бактерий.

Метод хроматографии Хорошим методом для идентификации антибиотиков и их продуцентов является метод хроматографии, открытый выдающимся русским ученым Цветом еще в 1903 г. и теперь очень широко используемый в лабораторной практике. Метод широко применяется при идентификации антибиотиков на ранних стадиях исследования, что имеет весьма важное значение. Определение антибиотика на ранних стадиях работы может значительно сократить время его изучения. Иногда метод хроматографии бывает необходимо дополнить данными методов электрофореза, которые помогают выяснить прежде всего ионный характер антибиотика.

Метод бумажной хроматографии антибиотиков состоит в следующем. На полоски хроматографической бумаги длиной 20-30 см и шириной в 1 см наносится испытуемый антибиотик. Подсушенные на воздухе полоски хроматографической бумаги с нанесенным антибиотиком помещают затем в хроматографический бак или цилиндр с соответствующим растворителем на 10-20 ч. Время выбирается в зависимости от скорости прохождения растворителя и от высоты используемого сосуда для хроматографии.

Для обнаружения антибиотиков па хроматограммах могут применяться биологические, химические и физические методы.

Наиболее распространенным методом обнаружения антибиотиков на хроматограммах является биоавтографический метод. С этой целью высушенные в вытяжном шкафу полоски бумаги накладываются на агаровую пластинку, предварительно засеянную культурой тест-организма, чувствительной к изучаемому антибиотику. Кюветы с полосками бумаги помещают в термостат на 18-20 ч при температуре, оптимальной для роста тест-организма. По зонам отсутствия роста тест-микроба, образующимся вокруг тех мест на хроматограмме, где находится пятно антибиотика, судят, во-первых, об однородности антибиотика; во-вторых, сравнивают полученные хроматограммы с хроматограммами известных антибиотических веществ (рисунок 1).

а – стандартный раствор пенициллина G; б, в – хроматограмма производственных образцов 1950 г. За пятном пенициллина G (вверху) следуют пенициллин F, дигидро F и самая нижняя зона – пенициллин К; г – хроматограмма конечного препарата калиевой соли (1950).

Рисунок 1 – Использование метода бумажной хроматографии для разделения пенициллинов, образуемых штаммом Q-176 на кукурузной среде с лактозой

Химические методы обнаружения антибиотиков на хроматограммах основаны на реакциях, в результате которых образуются соединения, выявляемые по соответствующей окраске или обесцвечиванию реактива в месте расположения пятна антибиотика.

Физические методы обнаружения антибиотиков включают в себя способы, связанные:

а) с выявлением люминесценции антибиотического пятна в ультрафиолетовом (УФ) возбуждении;

б) с поглощением УФ излучения;

в) с определением радиоактивной метки антибиотика.

Для целей бумажной хроматографии антибиотиков с успехом можно использовать и круговые хроматограммы.

Важное значение при оценке результатов хроматографии имеет положение пятен исследуемых веществ, характеризуемое коэффициентом R_f. Коэффициент R_f определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества от линии старта за определенное время, к расстоянию фронта растворителя, прошедшего от линии старта:

где Sp – расстояние, пройденное пятном изучаемого вещества;

Sf – расстояние фронта растворителя, пройденное от старта.

Воспроизводимость значении R_f зависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.

При использовании метода хроматографии па бумаге для идентификации антибиотиков было показано, что значение R_f зависит также и от системы растворителей, от степени очистки изучаемого антибиотика и от состава культуральной жидкости.

По спектру значении R_f или, как его иногда называют, по хроматографическому спектру можно четко различать группы химически родственных антибиотиков и до некоторой степени отличать также антибиотики внутри групп.

Существенное значение при использовании бумажной хроматографии для идентификации антибиотиков имеет разработка методов, позволяющих проводить эти исследования на ранних этапах изучения антибиотических веществ, т.е. на стадии культуральных жидкостей. Однако при этом встречаются большие затруднения в разгонке антибиотиков, так как факторы, оказывающие влияние на значение R_f, часто встречаются при использовании культуральных жидкостей.

Преодолеть эти затруднения удалось с помощью методов лиофилизации фильтратов культуральных жидкостей и экстрагирования их соответствующими растворителями. Сущность схемы хроматографической идентификации антибиотиков из культур на стадии малоактивных культуральных жидкостей состоит в следующем. Культуральную жидкость, обладающую антибиотическими свойствами, фильтруют и измеряют рН. Точно взятый объем фильтрата подвергают лиофильной сушке, затем лиофилизат взвешивают и разделяют на две части, одну из которых растворяют в воде, а другую экстрагируют безводным этанолом при встряхивании в течение часа. Растворители берут в таком количестве, которое, как правило, позволяет получить 5-10-кратные концентрации по сравнению с исходной культуральной жидкостью. Антибиотическую активность водного раствора и спиртового экстракта определяют методом бумажных дисков.

В случае если спиртовой экстракт обладает антибиотической активностью, схожей с активностью водного раствора лиофилизата, то проводят хроматографирование в соответствующей системе. Хроматограммы проявляют биоавтографически на чашках с Bacillus subtilis. Одновременно производят электрофорез в ацетатном и фосфатном буферах.

Если для изучаемого антибиотика во всех системах 1-го типа значение R_f будет около 0,8 и выше, то спиртовой экстракт хроматографируют в другой системе. При помощи набора этой системы можно наиболее уверенно отличить антибиотики типа эритромицина и олеандомицина, типа карбомицина, типа актиномицина и хлорамфеникола.

Полученные данные позволяют в определенной степени идентифицировать антибиотик или включить его в определенную группу химически близких веществ, или, наконец, определить его как новый антибиотик.

Пути выделения продуцентов антибиотических веществ из естественных мест их обитания и их первичной идентификации представлено на схеме (рисунок 2).

Рисунок 2 – Схема выделения актиномицетов – продуцентов антибиотиков (по Коневу, 1981)

Если в результате проведенной работы по идентификации выделенного микроорганизма установлено, что он является новым видом, и антибиотическое вещество, образуемое им, не принадлежит к уже описанным соединениям, то и организм и антибиотик должны быть подвергнуты детальному исследованию. С этой целью, прежде всего, изучаются условия культивирования микроба, обеспечивающие максимальное образование антибиотика.

При подборе сред необходимо иметь в виду, что чем сложнее среда, тем труднее производить выделение и очистку антибиотика, поэтому среда для культивирования должна быть по возможности простой по составу и обеспечивать максимальное образование антибиотического вещества.

3.4 Методы выделения и очистки антибиотиков

Выделение антибиотиков и их очистка осуществляются разными способами, выбор которых зависит от химической природы антибиотика, характера сопутствующих антибиотику продуктов жизнедеятельности организма (органические кислоты, аминокислоты, пигменты и другие соединения), неиспользованных компонентов среды (углеводы, масла, азотсодержащие вещества, неорганические соли и др.), а также от того, где накапливается это вещество – в культуральной жидкости или в клетках продуцента. Основная задача первых этапов выделения антибиотического вещества – концентрирование биологически активного соединения и очистка от сопутствующих балластных веществ.

Основными методами выделения антибиотиков из нативных растворов (культуральная жидкость, освобожденная от биологической массы продуцента) можно назвать следующие: осаждение антибиотика, методы экстракции антибиотиков органическими растворителями, сорбционные методы с использованием поверхностно-активных веществ (активированный уголь, активированный оксид алюминия и др.) или ионообменных материалов (ионообменные смолы). При применении сорбционных методов выделения антибиотиков наиболее трудной задачей является десорбция (элюирование) препарата.

Антибиотик, выделенный одним из указанных способов, представляет собой лишь технически чистый препарат, который не может еще использоваться в медицинской практике. Дальнейшая очистка препарата осуществляется или путем повторной сорбции, перекристаллизации, растворением антибиотика в органических растворителях, или иными методами.

После того как антибиотическое вещество с помощью того или иного метода выделено и хорошо очищено, проверяют его биологическую активность по отношению к широкому ряду микроорганизмов (проверяют широкий антимикробный спектр). Кроме того, антибиотик исследуют на стерильность, токсичность, пирогенность, испытывают в отношении действия на лейкоциты крови и определяют другие показатели.

Выяснение стерильности готового препарата необходимо для установление отсутствия в нем спор микроорганизмов, прежде всего патогенных. Для этого необходимо, если это возможно, инактивировать антибиотические вещества, а затем произвести посев его на разнообразные по составу питательные среды (мясопептонный бульон, печеночный бульон, кровяной агар и т.п.).

Инактивацию пенициллина осуществляют с помощью фермента пенициллиназы (пенициллин-b-лактамазы), или солянокислым гидроксиламином.

Стрептомицин инактивируют при помощи гидроксиламина или цистеина. Многие антибиотики не удается инактивировать, поэтому их стерильность определяют лишь в отношении форм микроорганизмов, устойчивых к этим антибиотикам.

Токсичность антибиотика определяют на экспериментальных животных, которым в течение определенного периода времени внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или иными путями вводят различные дозы изучаемого антибиотика. За такими животными ведут тщательные наблюдения. При отсутствии внешних изменений в поведении животных в течение 12-15 суток считают, что испытуемый антибиотик не обладает заметными токсическими свойствами. Это, разумеется, первый и предварительный этап в изучении токсичности антибиотика.

При более глубоком исследовании этого вопроса выясняется влияние препарата на отдельные ткани и органы животных. Некоторые антибиотики обладают кумулятивной токсичностью, проявляющейся в том, что его токсические свойства при введении в организм изо дня в день накапливаются, не обнаруживая каких-либо внешних проявлений, но в итоге приводят организм к гибели. Это скрытая токсичность, которая противоположна острой, вполне четкой токсичности препарата, проявляющейся сразу же после первого введения антибиотика.

Отсутствие местной и общей токсичности антибиотика, отсутствие пирогенности и угнетения деятельности лейкоцитов, сохранение антибиотической активности препарата в присутствии сыворотки крови, гноя и других веществ, необходимый спектр антимикробного действия дают основание проводить дальнейшие испытания изучаемого препарата как лечебного вещества.

Вместе с этим необходимо определить характер биологического действия антибиотика, иными словами, выяснить, является ли антибиотик бактериостатическим или бактерицидным. Знание характера действия препарата может создать определенное представление о механизме его антибактериальных свойств.

Следующий этап изучения антибиотика это определение его фармакологических и терапевтических свойств. Лечебные свойства антибиотиков проверяют на экспериментальных животных, зараженных соответствующей дозой определенного вида патогенного микроба. Обычно используют дозы инфекции с таким расчетом, чтобы вызвать гибель 50 % животных (LD50) и гибель 100 % животных (LDl00).

LD50 – минимальная смертельная доза. Животных делят на 3 группы. Одной группе животных антибиотик вводят сразу же после заражения; вторая группа животных подвергается обработке антибиотиком через некоторое время после заражения (через 5 ч или позже). Во всех случаях применяют такие максимальные дозы антибиотика, которые переносятся животными. Третья группа подопытных животных не подвергается обработке антибиотиком – это контроль.

По количеству выживших, особенно в опытных группах, судят о терапевтической ценности изучаемого антибиотического вещества. Минимальное количество антибиотика, способствующее предохранению животного от смертельной дозы инфекции, составляет минимальную терапевтическую дозу.

Отдельные антибиотические вещества, имеющие лечебные свойства, проявляют вместе с тем в определенных концентрациях токсичность по отношению к макроорганизму. Если лечебная доза антибиотика ниже токсичной, то такой препарат может быть использован в медицинской практике. Если терапевтическая доза равна токсичной или приближается к ней, то широкое применение такого антибиотика в лечебной практике не разрешается. Часто изучаемый антибиотик по тем или иным причинам не может быть использован в медицинской практике, тогда его следует испытать в сельскохозяйственном производстве или в отдельных отраслях пищевой и консервной промышленности.

Только после всестороннего и глубокого изучения антибиотика можно говорить о перспективности или, наоборот, о непригодности его для практических целей.