Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

При определении антибиотических свойств микроорганизмов, культивируемых в жидких средах, необходимо иметь в виду, что некоторые антибиотики в процессе развития микробов накапливаются внутри клеток продуцента, практически не выделяясь в окружающую среду. Поэтому определение антибиотических свойств организмов следует проводить как в культуральной жидкости, так и в экстрактах. Обычно для экстракции антибиотика из клеток продуцента применяют органические растворители (этиловый спирт, подкисленный этиловый спирт, ацетон и другие вещества).

Для оценки антибиотических свойств микроорганизмов, выросших в жидких средах, можно использовать метод последовательных разведении и метод бумажных дисков.

Метод бумажных дисков . На агаровую пластинку в чашке Петри высевают соответствующий тест-организм. Затем чашки с засеянным тест-микробом подсушивают в термостате при 37 °C в течение 20 мин. На одной чашке, т.е. в отношении одного тест-организма, может быть испытано одновременно 7 культуральных жидкостей.

Диски из фильтровальной бумаги диаметром 8 мм заготавливают впрок, стерилизуют в автоклаве под давлением выше нормального на одну атмосферу в течение 30 мин.

Стерильный диск фильтровальной бумаги захватывают стерильным пинцетом и смачивают в испытуемой культуральной жидкости, затем накладывают на поверхность питательного агара, засеянного тест-микробом. Чашку с тесторганизмом и бумажными дисками помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма, на 24 ч, если это бактериальные формы тест-микроба, и на промежуток времени от 48 до 72 ч для грибных или дрожжеподобных форм.

При наличии антибиотического вещества в испытуемой культуральной жидкости вокруг диска образуется зона задержки роста тест-микроба.

Приведенные методы пригодны для определения антибиотической активности микроорганизмов только в отношении бактерии, актиномицетов, дрожжевых и дрожжеподобных организмов и грибов. Для выяснения антивирусного или антиопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы, описанные в 3.7.3, 3.7.4.

Вирусы – внутриклеточные паразиты и поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство и заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов.

Метод тканевых культур . Существует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживающих кусочков хорион-аллантоисной ткани куриного эмбриона в модификации Тама, Фалкерса и Хорсфолла (1953).

Из верхней части куриного яйца с 10-11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с прилегающей к ней тканью хорион-аллантоисной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы и промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с 1 мл среды следующего состава, в процентах (%): NaCl – 0,68, KCl – 0,04, CaCl₂ – 0,02, MgSO₄ – 0,01, NaH₂PO₄ – 0,0125, NaHCO₃ – 0,22, глюкоза – 1,0.

Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин (100 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан.

Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирки, содержащие культуральную жидкость (при рН 7,0) исследуемого организма. Пробирки помещают в барабан на 48 ч.

Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титрования на эритроцитах.

Метод оценки антивирусных свойств культуральных жидкостей различных микроорганизмов прост, удобен и позволяет сравнительно быстро получить необходимый ответ при массовых испытаниях.

Метод с использованием листьев растений разработан для выяснения антивирусного действия антибиотиков по отношению к вирусу табачной мозаики.

Микроорганизм выращивают на агаровой пластинке в чашке Петри. После достаточно хорошего развития микроба из агара вырезают блочки, которые затем прикрепляют с помощью расплавленной желатины к листьям дурмана, предварительно зараженным вирусом табачной мозаики. Для предохранения от инфекции к желатину добавляют пенициллин. Листья дурмана с агаровыми блочками помещают на несколько дней во влажные камеры. В течение этого периода поверхность листа дурмана покрывается очагами некроза. Но если находящееся в агаровом блочке антибиотическое вещество, образуемое изучаемым организмом, подавляет развитие вируса, то вокруг такого блочка не будет некротических образований, т.е. поверхность листа в зоне действия антибиотиков будет свободной от поражения вирусом табачной мозаики (рисунок 9).

1 – очаги некроза, вызванные вирусом табачной мозаики; 2 – наличие противовирусного действия; 3 – отсутствие действия на вирусы.

Рисунок 9 – Использование листьев дурмана для определения антивирусного действия антибиотиков (по Шорину и др., 1956)

Для окончательной оценки противовирусного действия антибиотических препаратов необходимо использовать животных (чаще всего мышей) или куриные эмбрионы, зараженные вирусами.

Бактерио– и актинофаги – это вирусы микроорганизмов, обладающие рядом свойств, общих с вирусами растений и животных. Определение противофаговой активности микроорганизмов основано на тех же принципах, что и определение противобактериальных свойств организмов.

Культуру, изучаемую на антифаговые свойства, высевают на агаровую или в жидкую среду, благоприятную для образования антибиотического вещества. В качестве тест-объекта используют смесь бактерий и специфического для этой бактерии фага.

При использовании одного из диффузионных методов (метода агаровых блочков, лунок в толще агаровой пластинки, штрихов и т. д.) наблюдается следующая картина. Если антибиотическое вещество подавляет рост фага, то в зоне диффузии антибиотика будет происходить рост используемой бактерии, на остальной же поверхности агаровой пластинки под действием развивающегося фага бактерии будут лизироваться, и поверхность пластинки останется чистой.

Если же под действием изучаемого биологически активного вещества не произойдет развития бактерий и в зоне его диффузии, то это может означать, что используемый в опытах организм не образует противофагового вещества или же образуемое антибиотическое вещество подавляет развитие, как фага, так и бактерии. Последнее легко проверить, если в качестве тест-организма взять только бактерию. Противовирусным действием обладает ряд антибиотических веществ, таких как эрлихин, луридин, фумагиллин, гелиомицин, вирусин и др.

Не всегда антираковое действие препарата совпадает с антибактериальным или антигрибным действием. Поэтому для определения противораковой активности культуральных жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют непосредственно раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободноплавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцитные клетки), окончательная оценка антиопухолевого действия испытуемого вещества проводится в опытах на животных.

Методы с использованием экспериментальных животных . В качестве тест-объекта используются клетки асцитного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитической жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивается с равным объемом изучаемого антибиотического препарата и смесь помещается в рефрижератор при 4 °C на четыре часа, после чего ее подкожно прививают мышам.

Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используется физиологический раствор. Через 10 дней мышей убивают и определяют наличие опухолей и их размеры. Если изучаемый препарат убивает асцитные раковые клетки, то они, естественно, не дадут образования опухолей.

Тест-объектом могут служить не только клетки асцитного рака Эрлиха, но и других опухолей, полученных экспериментальным путем у мышей и крыс. Использование клеток различных опухолей связано с необходимостью более широкого изучения противоопухолевого действия исследуемых препаратов, для более точного определения значения изучаемой культуральной жидкости или антибиотика в отношении их действия на раковые клетки.

Прежде чем использовать опухоль в качестве тест-материала, необходимо из опухолевых тканей получить тонкую взвесь. С этой целью в стерильных условиях вылущивают опухоль, тщательно, очищают от некротических участков и несколько раз промывают стерильным физиологическим раствором. После этого отобранные в чашки Петри кусочки опухоли измельчают ножницами до получения гомогенной кашицы и разводят примерно в 2 раза стерильным физиологическим раствором. После тщательного размешивания взвесь фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Затем определяют количество опухолевых частиц, содержащихся в 1 мм взвеси (подсчет проводят в камере Горяева). Если при подсчете оказывается, что количество частиц в 1 мм3 незначительно, то полученную взвесь концентрируют методом центрифугирования. Надосадочную жидкость отсасывают, а опухолевые клетки, осевшие на дно пробирки, разводят нужным объемом стерильного физиологического раствора.

В дальнейшем постановка опыта со взвесью опухолевых клеток, приготовленной из опухоли животных, такая же, как и с клетками асцитного рака Эрлиха. Различие лишь в некотором удлинении срока наблюдения (до 12 дней).

Чашечный метод . Данный метод служит для определения действия изучаемых антибиотических препаратов на раковые клетки. Тест-объектом служат клетки асцитного рака, которые смешиваются с теплой агаровой средой (пептон, глюкоза, плазма крови) и разливаются в чашки Петри. На застывшую агаровую пластинку, содержащую клетки асцитного рака, накладывают агаровые блочки с выросшей культурой микроорганизма или диски фильтровальной бумаги, предварительно смоченные культуральной жидкостью или раствором очищенного препарата. Чашки помещают в холодильник на несколько часов для диффузии изучаемых веществ в толщу агара, содержащего асцитные раковые клетки. После этого чашки помещают в термостат при 37 °C на несколько часов и затем, вынув их из термостата, освобождают от агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги. Поверхность агаровых пластинок заливают 0,05 %-ным раствором метиленового синего. Чашки покрывают стеклянными пластинками, помещают в термостат на несколько часов. Если изучаемые препараты убивают клетки асцитного рака, то на месте агаровых блочков или дисков фильтровальной бумаги появятся голубые зоны. Свойство обесцвечивать метиленовый синий, т.е. превращать его в лейкосоединение, связано с выделением живыми асцитными клетками ферментов дегидраз. При отсутствии действия антибиотика на раковые клетки асцитного рака вся поверхность агаровой пластинки будет бесцветной так как убитые клетки не выделяют дегидразы и метиловый синий не обесцвечивается.

Способностью восстанавливать метиленовый синий обладают взвеси клеток различных опухолей животных и человека. Однако в случае использования взвеси клеток солидных опухолей их количество в 1 мл взвеси, необходимое для восстановления метиленового синего, различно (таблица 5).

Приведенные данные показывают, что пользуясь чашечным методом вполне возможно вести отбор противораковых веществ на раковых клетках человека, так как взвеси последних, как и. клетки асцитного рака, восстанавливают метиленовый синий.

Следует отметить, что дегидразная активность раковых клеток может обнаруживаться не только с помощью метиленового синего, но и с помощью ряда других веществ, например 2,6-дихлорфе-нолиндофенола, солей тетразола.

Препараты, подавляющие или тормозящие рост опухоли, обычно подавляют и дегидразную активность соответствующей опухоли.

Таблица 5 – Количество клеток различных опухолей животных и человека, необходимое для восстановления метиленового синего (по Талызиной, 1960)

Пробирочный метод . В качестве определенной модификации чашечного метода является метод испытания противораковой активности антибиотиков в пробирках. Метод состоит в том, что в стандартные пробирки вносят по 0,5 мл испытуемой культуральной жидкости и взвеси клеток асцитного рака Эрлиха (конечная концентрация клеток в 1 мл 500000), затем добавляют 2 мл расплавленной агаровой среды, содержащей метиленовый синий. В контрольные пробирки вместо испытуемой культуральной жидкости добавляют 0,5 мл среды, на которой выращивается изучаемый организм. После перемешивания пробирки помещают на 3-4 ч в термостат при 36-37 °С.

Если содержимое пробирок окрашивается метиленовым синим, то это указывает на то, что испытуемый препарат подавляет дегидразную активность клеток асцитного рака.

Преимущество пробирочного метода по сравнению с чашечным в том, что при этом происходит непосредственный контакт антибиотика с асцитными клетками Эрлиха независимо от степени диффузии изучаемого препарата в агар.

Использование микроорганизмов при изыскании противораковых антибиотиков. Обмен веществ в опухолевых клетках отличается от обмена нормальных клеток; различие, в частности, определяется интенсивностью дыхания, так в опухолевых клетках оно значительно снижено. Исходя из этого, высказано предположение о возможности использования мутантов микроорганизмов, имеющих пониженный коэффициент дыхания, в качестве тест-объектов для поисков противораковых антибиотиков.

В результате ультрафиолетового облучения и действия уретана удалось получить мутанты стафилококков, бактерий кишечной группы и других организмов с пониженным коэффициентом окисления. Поглощение кислорода у таких микроорганизмов может составлять от 20 % до 80 % по сравнению с дыханием исходных родительских культур. В качестве тест-организмов для определения антиопухолевого действия культуральных жидкостей микроорганизмов можно также применять мутанты дрожжевых организмов с пониженным коэффициентом дыхания.

Сравнивая чувствительность метода с использованием асцитных клеток Эрлиха и метода с биохимическими мутантами микроорганизмов, следует заключить, что биохимические мутанты – более чувствительные тесты при определении противоопухолевого действия микроорганизмов.

Использование опухолевых клеток, выращенных in vitro, для отбора организмов, образующих противоопухолевые антибиотики. В последнее время оказалось возможным культивировать некоторые опухолевые клетки в искусственных условиях (in vitro) подобно тому, как это осуществляется в отношении микроорганизмов. Лейкемические клетки мышей могут расти и размножаться в среде, содержащей пептон, диализированную лошадиную сыворотку и фолиевую кислоту (10 мкг/мл). Это позволяет использовать перевиваемые штаммы клеток рака человека для изучения противоопухолевого действия некоторых антибиотиков. С этой целью клетки перевиваемых штаммов выращивают в матрацах на специальной среде с добавлением 10 % телячьей сыворотки. Культивирование проводят при 36 °С. Через 6-7 суток среду удаляют и слой клеток снимают с поверхности стекла 0,02 %-ным раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Через 15-20 мин инкубации в термостате клетки переходят в суспензию.

Способность некоторых опухолевых клеток размножаться в пробирках позволяет применять их в качестве тест-объекта при поиске, выделении и очистке новых антибиотических веществ, обладающих противоопухолевой активностью.

С этой целью можно использовать опухолевые клетки лимфолимы. Для получения асцита клеток лимфолимы белым мышам вводят внутрибрюшинно по 0,3 мл взвеси асцитных клеток. Через 10-12 дней асцит стерильно отбирается и сразу же вносится в пробирки с вышеназванной средой для выращивания клеток в пробирках. Количество среды в каждой пробирке равняется 2 мл. При этих условиях через 48 ч инкубации при 36,5 °C в пробирках без перемешивания происходит увеличение числа клеток в 1,5-2 раза. Размножение клеток в культуре учитывается подсчетом в камере Горяева.

Если исследуемый препарат тормозит развитие и размножение клеток асцита, то это указывает на его антиопухолевое действие.

Применение этого метода позволяет производить первичный отбор противоопухолевых антибиотиков на стадии культуральной жидкости, осуществлять выделение и химическую очистку отобранных антибиотиков. Причем удается обнаружить и выделить противоопухолевые антибиотики, не обладающие подавляющим действием в отношении обычных тест-организмов, биохимического мутанта стафилококка и не действующие на дегидразную активность опухолевых клеток лимфолимы.

3.8 Методы количественного определения антибиотиков

Количественное определение антибиотиков в культуральных жидкостях, готовых препаратах или в разнообразных растворах осуществляют различными методами: биологическими, химическими и физико-химическими. Наиболее распространены биологические методы, не требующие специального дорогостоящего оборудования и дающие довольно точные результаты.

Данные методы нашли широкое применение на практике. Они основаны на непосредственном биологическом действии антибиотика на используемый тест-организм, чувствительный к данному препарату, а поэтому считаются наиболее объективными.

Омелянский еще в 1906 г. указывал на преимущества биологических методов при количественном учете разных веществ. Он писал: «В лице бактерий химия приобретает новый и поистине неисчерпаемый источник разнообразнейших реактивов, во много раз более точных и более специализированных, чем те, какими располагала эта наука до сих пор».

Однако биологические методы определения антибиотиков имеют и недостатки: длительность проведения анализов, зависимость точности результатов от многих внешних факторов и т. п. Точность биологических методов обычно составляет ± 10 %.

Наиболее широкое распространение среди биологических методов количественного определения антибиотиков получили метод последовательных разведений, диффузионный и турбидиметрический методы.

Данный метод используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Для работы подготавливают питательный бульон, пригодный для развития выбранного тесторганизма. Непременное условие – бульон должен быть прозрачным. Одновременно с этим подготавливают и культуру тест-организма. Стерильный питательный бульон разливают в чистые стерильные пробирки; количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика.

В тех случаях, когда антибиотик обладает высокой биологической активностью и в испытуемом растворе содержится в большом количестве, необходимо подготовить ряд пробирок с питательным бульоном таким образом, чтобы обеспечивалось получение относительно большого разведения. Например, в две пробирки вносят по 9 мл бульона. В первую пробирку вносят 1 мл испытуемого раствора антибиотика (разведение 1:10), тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку (разведение 1:100). Затем 1 мл раствора разведения 1:100 смешивают с 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 мл бульона в результате получая разведения 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, 1:600; 1:700 и 1:800. Для дальнейшего увеличения разведения испытуемого антибиотика, последовательно отличающегося на 100, берут 0,5 мл раствора с разведением 1:100, смешивают с 4, 4,5, 5 и 5,5 мл бульона и получают разведения 1:900, 1:1000, 1:1100 и 1:1200. При желании можно данный ряд разведения увеличить до необходимого значения. Иногда используют и другие ряды разведении, например 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т. д. или 1:2, 1:4, 1:8, 1:16; 1:32 и т.д.

В полученном ряду разведений антибиотического вещества в каждую пробирку вносят определенное количество клеток тест-микроба. Затем пробирки помещают в термостат на 20-24 ч при температуре, оптимальной для роста тест-микроба. После этого в пробирках определяется наличие или отсутствие роста тест-организма.

Допустим, что в нашем случае развитие организма начинается при разведении 1:1100 и далее, а во всех предыдущих разведениях, кончая 1:1000, рост тест-микроба отсутствует. Это означает, что в испытуемом растворе содержится 1000 ед. разведения антибиотика. Или для более точного расчета берут среднее значение максимального разведения, при котором отсутствует развитие тест-организма, и минимальное разведение, при котором начинается его развитие.

Методом последовательных разведений можно определить количество антибиотика не только в условных единицах разведения, но и в весовых или стандартных единицах. Для этой цели титрование (разведение) должно проводиться стандартным раствором данного антибиотика, имеющего известную активность, выраженную в мкг/мг или в ед/мг препарата.

Например, необходимо определить концентрацию стрептомицина, содержащуюся в культуральной жидкости Str.griseus. Делают ряд разведений культуральной жидкости, освобожденной от мицелия, а параллельно таким же способом делают разведение стандартного раствора стрептомицина, содержащего, например, 10 мкг/мл.

Разведение испытуемой жидкости и разведение стандартного раствора антибиотика необходимо проводить в бульоне с фосфатным буфером при рН 7,8-8,0.

Пример расчета приведен в таблице 6.

Таблица 6 – Определение концентрации стрептомицина методом последовательных разведений

В данном случае (таблице 6) 10 мкг/мл стрептомицина подавляют развитие тест-культуры в наибольшем разведении, соответствующем 5-й пробирке. Следовательно, 5 мкг/мл вызвали бы подавление роста микроба только в 4-й пробирке, но не в 5-й, а 20 мкг/мл задержат рост в 6-й пробирке, 40 мкг/мл – в 7-й; 80 мкг/мл – в 8-й; 160 мкг/мл – в 9-й; 320 мкг/мл – в 10-й пробирке и т.д.

Сравнивая эти величины, устанавливают, что испытуемый раствор, задерживающий развитие тест-организма в 10-й пробирке (разведение 1:1024), содержит 320 мкг/мл стрептомицина.

Расчет антибиотической активности испытуемого раствора при работе по методу последовательных разведений при наличии стандарта можно производить по следующей формуле

Х = Ри / Рс × С, (2)

где Ри – максимальная степень разведения испытуемого раствора, при которой отсутствует рост тест-организма;

Рс – максимальная степень разведения стандартного раствора, обеспечивающая отсутствие роста тест-микроба;

С – исходная концентрация стандартного раствора антибиотика;

Х – искомая концентрация антибиотика в исследуемом растворе.

В нашем примере Ри=1024, Рс=32, С=10 мкг/мл; искомая концентрации антибиотика

X = 1024: 32 × 10 = 320 мкг/мл.

Метод последовательных разведений может дать сопоставимые результаты лишь при соблюдении определенных условий, а именно:

1) тщательная стерильность проведения анализов;

2) использование постоянных сред для разведения одного итого же антибиотика;

3) внесение определенного количества клеток или спор тест-организма;

4) определенная длительность инкубации пробирок, засеянных тесткультурой;

Иногда под действием испытуемого антибиотика возникают устойчивые к нему формы тест-микроба. Появление даже единичных резистентных клеток, которые могут дать затем развитие, приведет к ошибочным результатам при определении биологической активности препарата.

Чтобы избежать подобного явления для разведений используют не бульон, а агаризованные среды, разлитые в пробирки. После проведения процесса разведения пробирки размещают в наклонном положении, с тем, чтобы получить косячки застывшего агара. На поверхность скошенного агара микробиологической петлей высевают суспензию тест-микроба. После этого пробирки помещают в термостат на 24 ч при температуре, оптимальной для развития тесторганизма. Расчет активности ведут тем же способом, что и при разведении антибиотика (культуральной жидкости) в жидкой среде. Появление одиночных колоний, образовавшихся из резистентных форм, в расчет не принимается.

Определение антибиотической активности методом серийных разведений можно производить и на чашках Петри. В пробирки, содержащие по 9 мл расплавленного питательного агара, вносят по 1 мл определенного разведения изучаемого антибиотика или культуральной жидкости. После тщательного перемешивания содержимое пробирки выливают в чашку Петри и дают агару застыть. Затем по поверхности пластинки штрихами производят посев тесторганизмов. Чашки выдерживают в термостате при оптимальной для используемых тест-организмов температуре в течение времени от 20 до 21 ч.

Преимущество этого метода по сравнению с пробирочным методом разведений состоит в том, что в данном случае каждое разведение изучаемого препарата может быть использовано для многих тест-организмов.