Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

Количественное определение антибиотиков диффузионными методами основано на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются используемые тесторганизмы.

Величина зоны диффузии антибиотика зависит, прежде всего, от химической природы антибиотического вещества и его концентрации, состава агаровой среды, ее рН, температуры и других факторов, которые необходимо учитывать при проведении анализа.

Антибиотики-полипептиды, обладающие большой и сложной молекулой, диффундируют гораздо медленнее, чем, например, антибиотики ациклического строения или антибиотики тетрациклиновой природы и гетероциклического строения. Поэтому для количественного определения антибиотиков, трудно диффундирующих в агаризованных средах, необходимо подбирать условия, обеспечивающие лучшую их диффузию. К таким условиям можно отнести добавление к среде отдельных веществ, повышающих диффузию антибиотиков. Так, СаСl₂ способствует повышению диффузии грамицидина С. Иногда чашки с агаром, тест-культурой и антибиотиком помещают на 20-24 ч в холодильник (4 °C); тест-организм в это время не развивается, а антибиотик диффундирует. Используя этот метод, можно примерно в два раза увеличить скорость диффузии антибиотика при нормальном периоде роста тест-организма.

Концентрации испытуемых антибиотиков не должны быть слишком высокими, так как установлено, что диаметр зоны задержки роста тест-организма есть линейная функция логарифмов концентрации антибиотика, но лишь в определенных пределах концентрации. Так, увеличение концентрации неомицина выше 5 % по существу не сказывается на величине зоны задержки роста тестмикроба.

Величина зоны задержки роста тест-организма зависит в определенной степени от длительности контакта антибиотика со средой (таблица 7).

Таблица 7 – Величина зон угнетения роста Str.aureofaciens в зависимости от времени контакта антибиотика (на бумажном диске с агаром) (по Teillon, 1953)

Анализы необходимо проводить через определенный интервал времени, так как между моментом посева тест-организма и началом его прорастания проходит какой-то промежуток времени, в течение которого антибиотик продолжает диффундировать в агар и оказывать биологическое действие.

Состав агаровой среды и ее рН также существенно влияют на величину образования зон задержки и рост тест-микроба. Стрептомицин, стрептотрицин, неомицин проявляют антибиотические свойства более сильно в щелочной среде (рН 7,5-8,0), тетрациклиновые антибиотики наиболее активны в слабокислой зоне (рН среды 6,3-6,4).

Наличие в среде ароматических аминокислот снимает биологическую активность антибиотика азасерина по отношению к Е.coli.

Плотность используемой культуры тест-организма должна быть постоянной для каждой серии опытов, ибо с повышением плотности клеток тесткультуры уменьшается величина зоны задержки ее роста, бактерии заметно влияют на процесс диффузии антибиотика ввиду того, что антибиотические вещества в определенной мере связываются этими организмами.

Применение в опытах постоянной плотности вегетативных микробных клеток и спор тест-организма в агаровой среде дает возможность получать зоны угнетения роста используемой тест-культуры соответствующей величины с резко очерченными краями.

Чаще всего для определения плотности микробных клеток и спор бактерий используют фотоэлектрокалориметр или стеклянный оптический стандарт, выпускаемый Государственным контрольным институтом им. Л.А. Тарасевича (ГКИ); стандарты соответствуют 5, 9, 10 и 11 единицам мутности. В качестве единицы мутности условно принята мутность взвеси тифозных бактерий, содержащая 100 млн. микробных тел в 1 мл. Однако при определении биологической активности антибиотиков в качестве тест-организмов чаще всего используют другие микробы, величина числового эквивалента мутности которых обычно не соответствует величине числового эквивалента мутности тифозных бактерий.

Разработаны соответствующие поправки, которые необходимо вносить при использовании взвеси спор тест-организмов в процессе определения биологической активности антибиотиков. Поправки по отношению к числовому эквиваленту мутности для взвесей тифозных бактерий следующие:

Споры L2 (типа B.subtilis) …1/12

Споры В.mycoides .....1/6

Споры В.mycoides (гладкий вариант) …1/5

Зная эти поправки, можно рассчитать число спор в 1 мл суспензии.

Так допустим, что плотность взвеси спор Вас. subtilis соответствует 5 единицам мутности стандарта ГКИ. Зная, что числовой эквивалент указанной мутности для взвесей тифозных бактерий составляет 100 млн/мл × 5 = 500 млн/мл и что соответствующий эквивалент для взвесей спор В.subtilis в 12 раз меньше, находим, что концентрация спор в исследуемой суспензии равна 500 млн/мл / 12 = 42 млн/мл.

Соблюдение указанных основных правил постановки опыта при определении биологической активности антибиотиков методом диффузии в агар позволяет получить вполне сравнимые результаты.

Среди диффузионных методов определения биологической активности наиболее широкое применение нашли три метода, рассматриваемые ниже.

Метод с использованием металлических цилиндриков . На поверхность питательного агара в чашках Петри или в специальных кюветах расставляют металлические цилиндрики (с внешним диаметром 8 мм, внутренним диаметром 6 мм и высотой 10 мм) из алюминия или нержавеющей стали. Как правило, питательный агар используют двухслойный: 1-й слой агара наливают из расчета 15 мл на одну чашку Петри (диаметр 9 см); 2-й слой агара, содержащий определенную плотность суспензии тест-организма, разливают на застывшую поверхность первого слоя агара по 5 мл на чашку. На застывшую поверхность второго слоя агара по специальному трафарету расставляют предварительно простерилизованные металлические цилиндрики (5-6 цилиндриков на чашку).

В одни цилиндрики вносят испытуемый раствор антибиотика, в другие – стандартный раствор того же антибиотика с известным числом мкг или единиц активности в 1 мл раствора. Обычно цилиндрики с испытуемым и стандартным растворами чередуют. Затем чашки или кюветы помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма на 20-24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба (рисунок 10). Расчет количества антибиотика в 1 мл раствора ведут или по стандартной кривой, полученной на полулогарифмической сетке, или по таблицам Дмитриевой (1958).

Рисунок 10 – Определение биологической активности антибиотиков диффузионным методом с использованием металлических цилиндриков

Метод с применением лунок в толще агара . В толще агаровой пластинки делают лунки диаметром 8 мм. используя пробочное сверло соответствующего диаметра или специально сделанное приспособление, состоящее из резиновой груши, в которую вставляют заостренную с одного конца металлическую трубочку с внешним диаметром 8 мм.

Блочки, надрезанные пробочным сверлом на всю глубину агаровой пластинки, удаляют с помощью стерильного скальпеля или специального крючка. В одни лунки вносят раствор испытуемого антибиотика, а в другие – стандартный раствор антибиотика (рисунок 11).

Метод лунок имеет некоторые преимущества по сравнению с первым методом (нет необходимости в очистке и стерилизации цилиндриков). При использовании цилиндриков, сделанных из алюминия, иногда может происходить взаимодействие кислых антибиотиков с металлом, что приводит к частичной или полной инактивации препарата. При работе с лунками это полностью исключено.

Рисунок 11 – Определение антибиотической активности препаратов в кюветах с использованием лунок в толще агара

При работе с цилиндриками возможно (особенно у начинающих исследователей) подтекание раствора антибиотика из-под неправильно поставленных цилиндриков, что приводит к образованию расплывчатых зон неправильной формы. Метод лунок не дает подобных эффектов.

Метод использования дисков фильтровальной бумаги . На поверхность питательного агара, засеянного тест-организмом, помещают диски фильтровальной бумаги, пропитанные испытуемым раствором антибиотика. В качестве стандарта используют диски, смоченные раствором антибиотика известной концентрации, или специально приготовленные диски, содержащие уже известное количество антибиотиков. Дальнейшие операции проводят так же, как и при работе с применением лунок в толще агара.

В некоторых случаях при использовании бумажных дисков получаются зоны неправильной формы. Это связано с тем, что в данном случае диск фильтровальной бумаги оказывается хроматограммой изучаемого антибиотика и препарат концентрируется в одном участке диска.

Широкое распространение в практике количественного определения антибиотиков нашли турбидиметрические методы, в основу которых положена логарифмическая зависимость степени угнетения роста тест-организма от концентрации антибиотика. Метод основан на измерении концентрации клеток тест-микроба, образующих определенную оптическую плотность среды (мутность) в результате роста в присутствии небольших количеств антибиотика. В присутствии небольших количеств антибиотика не происходит полного подавления роста тест-микроба, а лишь задержка темпа их роста, что и сказывается на оптической плотности бульона.

Турбидиметрические методы определения антибиотиков обычно неприемлемы для плотно окрашенных растворов. Но, учитывая высокую чувствительность этих методов, применяются довольно большие разведения исследуемых жидкостей, что приводит к значительному снижению концентрации пигментных веществ, мешающих проведению анализа; в ряде случаев можно использовать турбидиметрический метод и для окрашенных растворов. Оптическую плотность жидкостей определяют с помощью фотоэлектро-калориметра или обычного турбидиметра.

Эти методы пригодны для количественного определения любых антибиотиков при условии наличия стандартного раствора изучаемого препарата.

При подборе быстрорастущих организмов, используемых в качестве тестобъектов, турбидиметрический метод можно использовать как экспресс-метод – ответ получают через 3,5-4 ч.

Химические и физико-химические методы определения различных групп антибиотиков все шире и шире используются в лабораторной практике. Их преимущество по сравнению с биологическими методами состоит в быстром проведении анализов и, следовательно, в быстром получении ответа. В ряде случаев химические и физико-химические методы несколько уступают по точности биологическим методам. Однако их основное свойство – высокая скорость определения – способствует широкому практическому использованию.

К химическим и физико-химическим методам относят колориметрические и спектрофотометрические методы, основанные на образовании различных соединений или использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, исчезновение характерных полос в ультрафиолетовой или инфракрасной частях спектра под действием различных веществ (кислот, щелочей и др.).

Чисто химические методы определения количества антибиотиков применяются очень редко. Описано несколько модификаций определения пенициллинов, в основу которых положено поглощение йода продуктами гидролиза этого вещества. Определение пенициллина можно также производить ацидометрическим способом. При расщеплении молекулы пенициллина с помощью пенициллинацилазы или щелочи с образованием пенициллановой кислоты происходит освобождение одной карбоксильной группы, которую можно учесть титрованием.

Чаще применяют колориметрические и спектрофотометрические методы определения концентрации антибиотиков. В основу колориметрических методов положен принцип превращения препарата или его отдельных группировок в окрашенные соединения. Спектрофотометрические методы основаны на свойстве многих антибиотиков давать характерный спектр поглощения в видимом свете или в ультрафиолетовой области.

Определение стрептомицина основано на характерных реакциях различных функциональных групп молекулы антибиотика. Чаще всего применяется мальтольный метод, который состоит в том, что при щелочном гидролизе стрептомицина из стрептозной части молекулы образуется мальтол, который с солями трехвалентного железа дает окрашенное соединение. Этим методом можно определять стрептомицин в растворах товарных препаратов и в культуральных жидкостях после соответствующей их очистки.

Для получения вполне воспроизводимых результатов при работе указанным методом рекомендуется использовать следующую методику: к 10 мл стрептомицина (концентрация 100-300 мкг/мл) добавить 2 мл 0,2 н. гидроксида натрия, опустить сосуд в кипящую водяную баню на 4 мин, затем охладить в водопроводной воде в течение 3 мин, добавить 8 мл 1%-ного раствора железоаммиачных квасцов в 0,55 н. серной кислоте и точно через 3 мин после этого измерить удельную экстинкцию (оптическую плотность, или поглощение).

Для определения маннозидострептомицина, который обычно образуется в определенном количестве вместе со стрептомицином, применяют антрон – вещество, обладающее способностью давать с углеводами в крепких растворах серной кислоты соединение интенсивно зеленого цвета. Определение оптической плотности этого окрашенного соединения обычно проводят на фотоэлектроколориметре.

Определение тетрациклиновых антибиотиков физико-химическими методами также основано на образовании окрашиваемых соединений при взаимодействии этих антибиотиков с хлористым железом, солями меди, азотной или серной кислотами. Тетрациклиновые антибиотики количественно могут определяться спектрофотометрическим методом. Метод основан на исчезновении одного из характерных максимумов поглощения раствора антибиотика после щелочного гидролиза.

Описано несколько физико-химических методов определения эритромицина, из которых наиболее широко распространенными являются колориметрический и спектрофотометрический методы.

Колориметрический метод определения эритромицина основан на изменении оптической плотности раствора антибиотика после реакции его с серной кислотой (27 н.). При взаимодействии эритромицина с серной кислотой образуются продукты, окрашенные в желтый цвет.

Замечено, что оптическая плотность испытуемого раствора антибиотика и серной кислоты зависит от температуры сливаемых растворов. Чтобы исключить это влияние, необходимо измерять оптическую плотность раствора антибиотика после нагревания его с 18 н. H₂S0₄ при 100 °C.

Физико-химический метод нашел широкое практическое применение при определении циклосерина. Метод основан на реакции циклосерина с нитропруссидным реагентом в кислой среде. В результате реакции образуется комплексное соединение голубого цвета, концентрацию которого легко измерить колориметрически.

Нитропруссидный реагент представляет собой смесь равных объемов 4 %-ного раствора нитропруссида натрия и 4 н. раствора NaOH. Реагент можно готовить за 16-24 ч до начала определения и хранить в холодильнике, лучше же готовить реагент перед началом определения.

Метод определения циклосерина состоит в следующем: к 1 мл раствора циклосерина (концентрация от 50 до 200 мкг/мл) добавляют 3 мл 1 н. раствора уксусной кислоты и 1 мл нитропруссидного реагента. После перемешивания раствор оставляют при комнатной температуре в течение 10 мин и измеряют величину оптической плотности.

Вопросы для самоконтроля по разделу «Выделение продуцентов антибиотических веществ и методы определения их биологического действия»

1 Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки.

2 Метод обогащения почвы.

3 Метод замораживания – оттаивания почвы.

4 Применение питательных сред, содержащих антибиотики.

5 Методы идентификации микроорганизмов продуцентов антибиотических веществ.

6 Перекрестный антагонизм.

7 Метод хроматографии.

8 Биоавтографический метод.

9 Химические и физические методы обнаружения антибиотиков.

10 Пути выделения продуцентов антибиотических веществ из естественных мест их обитания и первичной идентификации антибиотиков.

11 Методами выделения антибиотиков из нативных растворов.

12 Антимикробный спектр и токсичность.

13 Определение его фармакологических и терапевтических свойств.

14 Лабораторный регламент.

15 Селекция наиболее активных форм продуцентов антибиотиков.

16 Методы выделения наиболее активных форм микроорганизмов продуцентов антибиотиков.

17 Условия культивирования выделенных штаммов микроорганизмовпродуцентов антибиотиков.

18 Сохранение штаммов продуцентов антибиотиков в активном состоянии.

19 Определение антибиотической активности микроорганизмов.

20 Методы определения антибиотической активности микроорганизмов, выросших на твердых питательных средах.

21 Метод агаровых блочков.

22 Метод перпендикулярных штрихов.

23 Определение антибиотической активности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах.

24 Метод бумажных дисков.

25 Определение антивирусного действия антибиотиков.

26 Определение противофаговой активности.

27 Определение противоракового действия антибиотиков.

28 Методы определения противоракового действия антибиотиков с использованием экспериментальных животных.

29 Чашечный метод определения противоракового действия антибиотиков с использованием экспериментальных животных.

30 Пробирочный метод определения противоракового действия антибиотиков с использованием экспериментальных животных.

31 Методы количественного определения антибиотиков.

32 Метод последовательных разведений для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или в экстрактах.

33 Количественное определение антибиотиков диффузионными методами.

34 Диффузионный метод определения биологической активности антибиотических веществ с использованием металлических цилиндриков.

35 Диффузионный метод определения биологической активности антибиотических веществ с применением лунок в толще агара.

36 Диффузионный метод определения биологической активности антибиотических веществ с использованием дисков фильтровальной бумаги.

37 Турбидиметрические методы количественного определения антибиотиков.

38 Химические и физико-химические методы определения различных групп антибиотиков.

4 Образование антибиотиков

Большинство антибиотиков, поступающих в продажу в виде природных соединений или используемых в качестве исходного сырья для получения полусинтетических препаратов, образуются при ферментации в небольшом количестве. Поэтому оптимизация ферментационного процесса, направленная на увеличение образования антибиотика продуцентом, крайне необходима.

Антибиотики представляют собой небольшие молекулы, однако для их синтеза необходимо множество ферментов, объединенных в ферментные системы, как функционально (образование конечного продукта), так и единством регуляции их синтеза. Это важно для понимания физиологии организмапродуцента в особенности при максимализации образования антибиотика в процессе ферментации.

Вторичные метаболиты. Антибиотики являются типичными вторичными метаболитами. Они, вероятно, не играют центральной роли в процессах роста и катаболизма организма и, как правило, образуются после завершения роста популяции. В настоящее время не существует единого мнения о значении вторичных метаболитов для жизнедеятельности микроорганизмов. Однако вряд ли вторичные метаболиты являются «отходами» обмена веществ. Об этом свидетельствует, например, значение нейтральных продуктов, образующихся при брожении, а также достаточно вероятная роль антибиотиков как инструментов антагонизма или веществ, связанных с процессами дифференцировки микроорганизмов.

Первичные метаболиты образуются в период активного роста микроорганизмов и их образование тесно связано с ростом. Таким образом, эффективное образование этих продуктов, как правило, достигается в условиях, оптимальных для роста культуры. Для их получения с успехом применяют непрерывное культивирование. В противоположность этому образование вторичных метаболитов регулируется сложным и не совсем понятным образом, и поэтому проектирование процедуры ферментации часто является достаточно сложным делом.

В большинстве случаев для получения вторичных метаболитов непрерывное культивирование не оптимально. Например, продуценты антибиотиков не образуют их до той поры, пока культура не вступает в стационарную фазу. Весьма примечательно, что классические продуценты антибиотиков почвенные микроорганизмы, такие как Streptomyces, Bacillus, миксобактерии и микромицеты, имеют сложный жизненный цикл и, как следствие, проходят различные стадии в процессе жизненного цикла. Последней стадией при периодическом культивировании является спорообразование, коррелирующее с образованием антибиотиков.

Катаболитная репрессия. У многих микроорганизмов, образующих антибиотики, снижается продуктивность в присутствии избытка углерода, в особенности в присутствии, легко утилизируемых соединений, таких как глюкоза. В некоторых исследованиях сообщалось, что уровень активности ферментов, участвующих в синтезе антибиотика, в этих условиях намного ниже. Это предполагает наличие системы регуляции активности ферментов биосинтеза, вероятно, на уровне транскрипции, а не на уровне уже имеющихся ферментов. Этот факт весьма напоминает феномен катаболитной репрессии, изученный на клетках E. coli. Известно, например, что в присутствии хорошо усваиваемого источника углерода, такого как глюкоза, в клетках E. coli подавляется синтез ферментов деградации менее предпочтительного источника углерода, например, лактозы. Таким образом, можно представить, что почвенный микроорганизм, продуцирующий антибиотик, нуждается в его образовании и убивает конкурента только при недостатке питательных веществ в окружающей среде, а катаболитная репрессия является весьма полезным приспособлением для этой цели. Поскольку феномен катаболитной репрессии существует и в процессе биотехнологического производства антибиотиков, его преодоление возможно при условии, что источник углерода добавляется в среду культивирования небольшими порциями, чтобы существенно не увеличивать его концентрацию в любой данный момент времени. В качестве альтернативы в борьбе с катаболитной репрессией весьма привлекательны попытки получения мутантов, у которых образование антибиотиков слабо зависит от присутствия избытка источника углерода.

Репрессия источниками азота и фосфатом. Во многих случаях присутствие соединений, являющихся источником азота и фосфора в ферментационной среде, несколько снижает образование антибиотиков. Экологическая выгода такой регуляции, вероятно, подобна выгоде от катаболитной репрессии. Фосфат ингибирует транскрипцию некоторых генов синтеза антибиотиков. В клетках микроорганизмов, чувствительных к регуляции азотом или фосфором, необходима или очень тщательная регуляция концентраций этих соединений в течение всей ферментации или необходимо пытаться получить мутанты, менее чувствительные к этим регуляторным процессам.

Регуляция синтеза при помощи обратной связи . Есть основания предполагать, что сами антибиотики как конечные продукты могут осуществлять регуляцию своего синтеза при помощи отрицательной обратной связи. Данные, подтверждающие это предположение, были получены в экспериментах, в которых пенициллин, добавленный к культуре сверхпродуцента пенициллинсинтезирующего гриба, ингибировал синтез антибиотика.

Регуляция синтеза антибиотика при помощи обратной связи дает возможность увеличить его образование стимуляцией экскреции антибиотика и таким образом снизить его внутриклеточную концентрацию. Многообещающие результаты были получены при стимуляции выхода антибиотика с помощью полиеновых антибиотиков, но при этом появилась новая проблема отделения синтезируемого продуцентом антибиотика от экзогенных полиенов. Возможно, метод увеличения проницаемости клеточной мембраны без добавления экзогенных препаратов, используемый в ряде других биотехнологий, например, при получении аминокислот, может быть использован и для увеличения образования антибиотиков.

Эффекты предшественников. Вторичные метаболиты синтезируются из первичных метаболитов. Для эффективного образования антибиотиков необходимо постоянное наличие их предшественников. Во многих случаях образование этих предшественников регулируется известными механизмами. В качестве примера того, как регулируется обеспечение предшественниками и как предшественники действуют на образование антибиотиков, можно привести влияние условий культивирования на образование ос-аминоадипиновой кислоты предшественника биосинтеза пенициллина. У грибов a-аминоадипиновая кислота – предшественник биосинтеза лизина. Поскольку лизин является конечным продуктом ферментной системы биосинтеза, высокий уровень лизина в среде подавляет биосинтез ретроингибированием первого фермента пути биосинтеза лизина, (по принципу обратной связи). Это сопровождается уменьшением количества всех промежуточных продуктов пути биосинтеза, включая осаминоадипиновую кислоту. Таким образом, избыток лизина сильно ингибирует образование пенициллина P. chrysogenum. Удивительной противоположностью является стимулирующее влияние избытка лизина на образование цефамицина С Streptomyces. Это происходит вследствие того, что ос-аминоадипиновая кислота синтезируется у прокариот совершенно отличным путем (рисунок 12), в котором лизин является ее предшественником, т.е. одни и те же вторичные метаболиты, используемые в качестве исходного материала, у разных организмов могут быть получены различными путями, которые регулируются различными регуляторными механизмами.

Наряду с a-аминоадипиновой кислотой пенициллин или цефалоспорин нуждаются в цистеине и валине. Путь биосинтеза цистеина различается у различных видов и даже у различных штаммов. У P. chrysogenum большая часть атомов серы включается в цистеин из неорганического сульфата среды.

У С. acremonium – продуцента цефалоспорина – источником большей части серы цистеина является метионин, образующийся при помощи реакции транссульфирования (рисунок 13).

В этом случае добавление метионина к среде сильно стимулирует образование цефалоспорина по меньшей мере частично за счет увеличения количества цистеина. При исследовании некоторых штаммов, образующих большие количества цефалоспорина С была обнаружена корреляция между уровнем цистатионин-g-лиазы – фермента, участвующего в образовании цистеина, и выходом антибиотика.

Рисунок 12 – Пути биосинтеза a-аминоадипиновой кислоты у грибов и прокариотов

Однако механизм действия метионина является более сложным, чем это принято считать. Добавление норлейцина, аналога метионина, также стимулирует синтез цефалоспорина С у C. acremonium, хотя норлейцин, очевидно, не является предшественником цистеина. Некоторые исследования наводят на мысль, что уровень ферментов синтеза b-лактамов повышается, когда клетки растут в присутствии метионина или норлейцина потому, что эти соединения могут действовать как общерегуляторные молекулы для механизма биосинтеза цефалоспорина.

Рисунок 13 – Пути биосинтеза цистеина, используемого в синтезе β-лактама. У С. acremonium цистеин образуется путем трансульфирования метионина через цистатионин (непрерывные стрелки), у P. chrysogenum – из сульфата (прерывистые стрелки)

Условия ферментации. Большинство процессов ферментации протекает в две стадии. Исходным материалом первой стадии являются споры определенного штамма, так как образование антибиотиков является нестабильным свойством культуры, которое может быть легко утеряно, если культуру сохраняют постоянно растущей путем серийных пересевов. Микроорганизмы культивируют глубинным способом в условиях достаточного аэрирования и источников питания так, что они достигают максимальной плотности в короткое время. На второй стадии, когда культура переходит в стационарную фазу или прекращает рост, начинается образование антибиотиков. Концентрация ключевых компонентов питания, таких как источники углерода, фосфата и азота должны внимательно контролироваться.