Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

а) взаимоотношения микроорганизмов, складывающиеся при совместном развитии разных видов, которые нуждаются в одних и тех же питательных веществах;

б) насильственный антагонизм. Антагонизм, обусловленный использованием разными организмами, развивающимися вместе, одних и тех же питательных веществ. При совместном развитии на одном и том же субстрате различных организмов, имеющих одинаковые потребности в питательных веществах, преимущественное положение в развитии будет у того микроорганизма, скорость роста которого выше скорости роста других организмов, его окружающих. Так, например, при одновременном высеве бактерий и актиномицетов на субстрат, вещества которого в равной степени необходимы для развития того и другого организма и при условии, что эти вещества находятся в ограниченном количестве, бактерии как организмы, имеющие наиболее высокий темп роста, овладевают быстрее субстратом и не дают возможности развиваться актиномицетам. Подобное явление можно наблюдать при одновременном высеве на МПА Е. coli или Pseudomonas fluorescens и некоторых видов актиномицетов. Однако угнетение роста актиномицета может иметь место лишь в том случае, если он не обладает способностью выделять специфические продукты жизнедеятельности, подавляющие развитие бактерий. Насильственный антагонизм. Ассистент И. И. Мечникова И. Шиллер еще в 1914 г. обратил внимание на то, что при совместном засеве в бульон ацидофильной палочки и стрептококка последний полностью погибает примерно через 18 ч культивирования (превращается в аморфную массу). Изучение этого явления показало, что ацидофильная палочка выделяет бактерицидные вещества, лизирующие стрептококки, причем выделение таких веществ происходит, только в присутствии стрептококка. Шиллеру удалось вызвать антагонизм у микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью (B. mesentericus, В. subtilis, В. anthracis) по отношению к бактериям, не имеющим этих ферментов. Если поместить, например, сенную (В. subtilis) или картофельную (В. mesentericus) палочку одновременно со стрептококком на водный агар или просто в воду, отмечает Шиллер (1952), то при этом произойдет размножение палочек с выделением специфических бактериолизинов и растворение стрептококка. Шиллеру удалось получить эти лизины в концентрированном виде путем упаривания при температуре 37 °C культуральной жидкости, в которой происходило, например, развитие В. mesentericus. При добавлении бактериального лизина, предварительно разбавленного водой, к свежим клеткам стрептококков, находящимся в полноценной питательной среде, происходит лизис стрептококков. Итак, если бактериям, которые в естественных условиях не проявляют никаких признаков антагонизма, создать условия недостатка в среде питательных веществ (азотных или углеродных), то одна из бактерий, обладающая протеолитическими ферментами, может использовать в качестве питательного материала клетки других бактерий, не имеющих этих ферментов. В этом состоит основное свойство насильственного антагонизма. Шиллер показал, что при насильственном антагонизме использование живых клеток в качестве питательного материала происходит тем же способом, каким бактерии используют нерастворимые белковые вещества, т.е. путем выделения в окружающую среду протеолитических ферментов. Количество лизинов, по его мнению, зависит от количества клеток, подлежащих литическому действию. Вероятно, что лизины, получающиеся при насильственном антагонизме, являются теми продуктами жизнедеятельности бактериальной клетки, которые, нарушая обмен и вызывая гибель бактерий другого вида, растворяют ее. По функции убивать живые клетки микроорганизмов другого вида эти лизины по существу являются антибиотическими веществами, а по функции растворения предварительно убитой специфическим веществом обмена и превращенную таким образом в субстрат клетку лизины выступают как адаптивные протеолитические энзимы. Явление насильственного антагонизма наблюдали Надсон и Жолкевич (1922) при совместном выращивании гриба Spiaria purpurogenes и дрожжей. При таком культивировании дрожжи погибают в результате образования антагонистом пигмента, обладающего литическими свойствами.

Используя метод насильственного антагонизма актиномицета Streptomyces aureofaciens и дрожжей (производственный штамм «Шампанские»), Шурыгин (1972) получил новое антибиотическое вещество бализ. В группу «активного» антагонизма микроорганизмов следует включить взаимоотношения, обусловленные:

а) образованием микробами органических кислот, спиртов или других продуктов обмена, происходящим в результате использования отдельных компонентов субстрата;

б) образованием и выделением в окружающую среду антибиотических веществ. К этой группе следует отнести явления паразитизма и хищничества, о которых говорилось выше. Антагонизм, связанный с образованием органических кислот, спиртов или других продуктов обмена в результате использования отдельных компонентов среды. У ряда микроорганизмов способность образовывать те или иные продукты жизнедеятельности в процессе эволюционного развития сопровождалась параллельной адаптацией их к относительно высоким концентрациям этих веществ. В результате различные по свойствам и химической природе продукты, образующиеся в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, служили им орудием в борьбе за существование, подавляя или тормозя рост конкурентных организмов. Многие микроорганизмы (бактерии, плесневые грибы и др.) образуют в процессе развития из углеродсодержащих компонентов субстрата органические кислоты, которые резко изменяют активную кислотность среды и тем самым препятствуют развитию организмов других видов.

Такое явление может наблюдаться, например, в процессе смены микрофлоры свежего молока. В свежевыдоенном коровьем молоке содержатся как молочнокислые, так и гнилостные бактерии. При этом соотношение их при хранении молока меняется по данным Войткевич (1940) в определенной последовательности: вначале в молоке все бактериальные группы развиваются как бы независимо одна от другой, причем группа гнилостных бактерий преобладает над остальными микроорганизмами. Затем в результате развития молочнокислых бактерий происходит накопление молочной кислоты и среда (в данном случае молоко) значительно подкисляется. В этих условиях наблюдается угнетение развития гнилостных бактерий, а затем их полная гибель. Преобладающее место в молоке начинают занимать молочнокислые бактерии. Отношение различных видов молочнокислых бактерий к подкислению субстрата также не одинаково. В первый период развития молочнокислых бактерий, когда значение рН молока еще не очень низкое, в большой степени развиваются стрептококки. Достигнув максимального развития, стрептококки подавляются палочковидными молочнокислыми бактериями, приспособленными к более высоким концентрациям молочной кислоты и, следовательно, к более низкому рН субстрата. Образование лимонной кислоты грибами, как отмечал в 1947 г. В. Н. Шапошников, имеет двоякое значение. С одной стороны, образование кислоты является специфическим приспособлением к созданию среды, наиболее благоприятной для развития гриба. С другой – резкий сдвиг рН субстрата в кислую зону является средством устранения конкурентной микрофлоры, главным образом бактериальной, в большинстве случаев не способной развиваться в кислой среде. Приведенные примеры показывают, что образование бактериями и плесневыми грибами органических кислот обеспечивает этим организмам преимущественные условия в острой конкурентной борьбе с другими микробами. Борьба с конкурентной микрофлорой может также осуществляться путем резкого подщелачивания среды. Некоторые виды бактерий благодаря специфическому использованию отдельных компонентов субстрата так подщелачивают среду, в которой они размножаются, что она становится неблагоприятной для развития других видов микробов. Например, при развитии уробактерий на мясо-пептонном агаре (МПА), содержащем от 1 % до 5 % мочевины, происходит дезаминирование последней. При этом выделяется аммиак в таком количестве, которого достаточно для того, чтобы затормозить развитие других микроорганизмов. Отсутствие роста других микробов объясняется тем, что выделенный аммиак сильно (до рН 9,3) подщелачивает субстрат. Уробактерии в этих условиях растут очень хорошо. При совместном культивировании уробактерий с Sarcina aurantica или Е. coli на МПА или даже в почве происходит полное отмирание сарцин и кишечной палочки.

Таким образом, как при лабораторном культивировании, так и в естественных условиях развития уробактерий в присутствии мочевины происходит значительное подщелачивание среды в «результате образования аммиака. Это приводит к подавлению некоторых видов окружающей микрофлоры и вместе с тем не оказывает отрицательного влияния на развитие самих уробактерий. Иногда наряду с кислыми продуктами обмена некоторые микроорганизмы (ацетоноэтиловые, ацетонобутиловые бактерии, дрожжи и др.) образуют нейтральные продукты обмена, например спирты, которые также могут тормозить развитие некоторых видов микробов. Итак, значительное снижение активной кислотности (рН) среды в результате образования органических кислот или резкое подщелачивание субстрата при использовании мочевины и других веществ, или, наконец, образование нейтральных продуктов обмена приводит к подавлению роста некоторых видов микроорганизмов и в определенных границах не препятствует развитию тех организмов, которые образуют эти вещества. Антагонизм, обусловленный образованием антибиотических веществ. Наиболее существенной и наиболее яркой формой антагонизма, широко распространенной в мире микроорганизмов, является образование специфических продуктов обмена, угнетающих или полностью подавляющих развитие организмов других видов. Такие вещества получили название антибиотиков. Явление антагонизма в мире микроорганизмов может быть широко использовано в практике здравоохранения и сельского хозяйства, здесь для этого имеются большие перспективы. Живые микробы-антагонисты находят применение в медицинской практике для борьбы с дисбактериозами и кандидомикозами, возникающими иногда при применении антибиотиков широкого спектра действия, для терапии и профилактики различных инфекционных заболеваний. Антагонизм между микроорганизмами привлекает внимание ученых и практиков сельского хозяйства для использования его в борьбе с фитопатогенными организмами, причиняющими немалый вред сельскохозяйственному производству.

3 Выделение продуцентов антибиотических веществ и методы определения их биологического действия

Выделение продуцентов антибиотиков может производиться из самых разнообразных субстратов: почвы, гниющих растительных и животных остатков, илов, воды озер и рек, воздуха и других источников. Наиболее же богата микроорганизмами, продуцирующими антибиотики, почва. Из нее большей частью и выделяют организмы-продуценты антибиотических веществ.

Перед чем начинать поиски продуцентов антибиотических веществ, перед тем, как приступать к выделению микробов-антагонистов, образующих антибиотики, из естественных мест их обитания, перед исследователем должна быть поставлена ясная цель. При этом возможны две основные задачи: во-первых, поиск продуцентов уже известных, описанных в литературе и используемых на практике антибиотиков, во-вторых, поиск новых антибиотиков, способных проявлять биологическое действие по отношению к конкретным организмам.

В зависимости от поставленной цели должны быть использованы и соответствующие методы поисков организмов-продуцентов тех или иных антибиотических веществ.

Итак, если перед исследователем стоит задача выделить микроорганизм, образующий уже известный антибиотик, то при этом необходимо руководствоваться следующими основными принципами:

1) каждый антибиотик образуется одним или несколькими определенными видами организмов.

2) каждый микроорганизм образует один или несколько вполне конкретных антибиотиков.

Образование антибиотиков – есть видовая специфика или, если говорить точнее то, особенность отдельных штаммов микроорганизмов.

Так, для поиска продуцента грамицидина С изучают не все бактериальные штаммы, а лишь штаммы спорообразующих бактерий, принадлежащие к Bacillus brevis; для выделения продуцента стрептомицина надо искать актиномнцеты, относящиеся к Streptomyces griseus; если надо выделить продуцент фумагиллина, необходимо найти плесневые грибы, принадлежащие к Aspergillus fitmigatus.и т.д.

Следовательно, при поиске продуцентов известных антибиотиков нет надобности выделять все организмы и изучать их антибиотические особенности. Достаточно при этом выделить микроорганизмы, принадлежащие к определенному виду (или видам). Надо иметь в виду, что некоторые антибиотики, например, относящиеся к b-лактамам (пенициллины, цефалоспорины и др.), могут образовываться как плесневыми грибами, так и некоторыми видами стрептомицетов и собственно бактерий. Однако этот пример не противоречит вышесказанному, а, наоборот, подтверждает положение о том, что известные антибиотики образуются вполне определенными видами (или штаммами) организмов, которые могут принадлежать к различным систематическим группам.

Иной подход должен быть при решении второй задачи – поисков продуцентов новых антибиотиков, активных в отношении определенных организмов. В данном случае продуценты антибиотических веществ следует пытаться выделить из всех групп организмов.

Изолированные штаммы изучаются в отношении их антибиотического действия к тем тест-организмам, для которых необходимо найти антибиотик.

При необходимости поиска среди микроорганизмов штамма, подавляющего развитие, например дрожжеподобного организма Candida albicans, в качестве тест-микроба используют С.albicatis или другой организм, близкий к нему по физиологическим свойствам.

Выделяя микроб-антагонист, активный по отношению к какому-либо возбудителю болезней растений, в качестве тест-организма необходимо использовать данный фитопатогенный организм. В этих случаях испытывают все выделяемые штаммы микроорганизмов, с тем, чтобы не пропустить организм, необходимый для решения поставленной задачи.

Гораздо сложнее обстоит дело с поиском продуцентов антибиотиков, активных в отношении вирусов и злокачественных новообразований. Так если бактерии, актиномицеты, грибы или протозоа – возбудители тех или иных заболеваний – могут быть непосредственно использованы в опытах как тесторганизмы при культивировании их на обычных лабораторных средах, то вирусы как внутриклеточные паразиты не могут культивироваться на таких средах. Для их развития нужны живые клетки, живые ткани. Аналогичные трудности возникают и при поисках противораковых антибиотиков. Рассмотрению этих вопросов посвящены последующие разделы.

Итак, первая задача исследователей при поиске продуцентов антибиотиков – выделение их из природных источников. Для этих целей широко применяется метод изменения генома выделенного продуцента антибиотика путем мутагенеза и генной инженерии. Наконец, для получения наиболее эффективного по биологическому действию антибиотика используют метод химической или биологической трансформации природных соединений.

3.1 Выделение микроорганизмов-антогонистов

Для выделения микроорганизмов – продуцентов антибиотиков из естественных мест их обитания применяется большое число разнообразных методов. В этом разделе мы остановимся лишь на самой общей характеристике этих методов.

В основу большинства приемов положен принцип выделения чистой культуры микроба и непосредственного испытания его по отношению к используемым тест-организмам. Однако существенное значение при образовании антибиотических веществ имеют и смешанные культуры. Это обстоятельство также необходимо помнить при поиске продуцентов антибиотических веществ.

Важное значение при выделении микроба-антагониста из той или иной группы организмов имеет специфичность условий его культивирования. Выделение микробов-продуцентов антибиотических веществ производят из субстратов, где обильно развиваются разнообразные формы микроорганизмов (бактерии, актиномицеты, дрожжи, грибы), поэтому очень важно знать и учитывать специфику условий развития тех организмов, которые необходимо выделить.

Например, большинство сапрофитных бактерий хорошо развивается на богатых по составу натуральных средах (мясопептонный агар, картофельный агар, сусло-агар и др.) при рН около 7,0 и температуре в пределах от + 30 °C до 37 °C. При этих условиях развиваются также актиномицеты и некоторые грибы, но для них такие условия менее благоприятны, чем для бактерий.

При выделении актиномицетов или грибов следует также учитывать особенности их развития. Актиномицеты растут медленнее, чем бактерии, они могут использовать такие источники питания, которые не очень хорошо используются бактериями.

Учитывая особенности развития актиномицетов, для выделения их из естественных субстратов рекомендуются следующие среды:

При этом рН сред устанавливается в пределах 6,8-7,1 после их стерилизации.

Для выделения термофильных актиномицетов удобно использовать среду следующего состава: агар – 15 г, пептон – 5 г, кукурузный экстракт – 5 мл, глюкоза – 10 г, NaCI – 5 г, СаСl₂ – 0,5 г, вода водопроводная – до 1 л. Выращивание термофильных культур следует производить при температуре от 55 °С до 60 °C.

Однако поиски продуцентов новых антибиотиков из группы актиномицетов требуют выделения из природных источников новых форм этих микроорганизмов, обладающих иными физиолого-биохимическими свойствами. Применяя новые не стандартные методы выделения актиномицетов, используя необычные субстраты и образцы почв, отобранные в разнообразных экологических условиях и географических зонах, в последнее время удалось показать, что действительно в природе имеются формы актиномицетов, о которых ранее не было известно. Изолированы, например, актиномицеты, способные развиваться при пониженных температурах. Среди этих форм обнаружены продуценты антибиотиков, например, криомицина.

В природе существуют ацидофильные актиномицеты, которые лучше растут в условиях кислой среды (рН 3,5-6,5). Ацидофильные актиномицеты образуют антибиотические вещества, обладающие противогрибковым действием. Выделены новые формы актиномицетов, предпочитающие для своего развития щелочные условия, это так называемые алкалофильные организмы.

Среди новых форм актиномицетов встречаются и галофильные виды, способные расти лишь в средах, содержащих высокие концентрации минеральных солей (например, не менее 10 % NaCl).

Микроскопические грибы предпочтительнее развиваются на средах с несколько пониженным значением рН (4,5-5,0), на которых плохо растут многие бактерии и актиномицеты. Выделение грибов можно производить как на синтетических (например, среда Чапека), так и на сложных по составу натуральных (например, сусло-агар) средах с начальным рН 4,5-5,0.

Среды, пригодные для выделения микроорганизмов, не всегда благоприятны для образования ими антибиотических веществ. Так, многие актиномицеты хорошо растут на простых синтетических средах, но не все штаммы синтезируют на этих средах антибиотические вещества. Иногда для образования антибиотика необходимо организм культивировать на натуральных средах, таких как бульон Хоттингера, картофельный отвар и т.п. Аналогичное явление может иметь место в отношении некоторых видов бактерий и плесневых грибов. Например, для выяснения антибиотического действия актиномицетов рекомендуется среды рН которых следует поддерживать на уровне 6,8. При выделении продуцентов новых антибиотиков для культивирования микроорганизмов следует шире применять различные селективные среды, в том числе и среды, содержащие антибиотики.

Приведенные примеры значительно расширяют имеющиеся представления о физиолого-биохимических особенностях группы актиномицетов. Исследователи, занимающиеся поисками продуцентов новых антибиотических веществ, должны иметь в виду эти особенности, с тем, чтобы обеспечить максимально возможные условия для развития всех имеющихся в природе форм актиномицетов. Выделение новых форм микроорганизмов позволяет надеяться на получение новых антибиотических веществ с ценными свойствами.

3.2 Основные методы выделения микроорганизмов-продуцентов антибиотиков

Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки . Определенная навеска почвы, тщательно растертая в ступке с небольшим объемом воды, количественно переносится в колбу со стерильной водой. Содержимое колбы встряхивается в течение 5 мин, а затем из водной суспензии делается ряд последовательных разведений, которые высеваются на соответствующую агаризованную среду.

Для получения в дальнейшем чистых культур отдельные колонии после инкубации в термостате при нужной температуре пересеваются в пробирки со скошенным питательным агаром. Каждая чистая культура микроорганизма пересевается на различные по составу среды и после достаточно хорошего развития проверяются ее антибиотические свойства. Высев почвы на питательный агар, предварительно засеянный тест-организмом. Поверхность питательного агара засевается тест-культурой необходимого организма, после чего на агаровую пластинку раскладывают небольшие, не более просяного зерна, комочки почвы или же почву наносят в виде пыли, распределяя ее по всей поверхности пластинки. Затем чашки помещают в термостат и через определенный промежуток времени (24-48 ч, а иногда и более) просматривают кусочки почвы или отдельные ее участки, вокруг которых образовались зоны задержки роста тесторганизма. Из этих участков выделяют чистые культуры организмов и подвергают их дальнейшему изучению.

Метод обогащения почвы . Почву, из которой предполагают выделить антагонистов, обогащают организмами тех видов, по отношению к которым хотят получить антагонист. С этой целью к образцам почвы, помещенным в стеклянные сосуды, систематически добавляют отмытую суспензию нужных микроорганизмов. Затем через определенные промежутки времени такая почва высевается в виде отдельных комочков на агаровые пластинки в чашках Петри, предварительно засеянные тем же самым организмом, который использовался для обогащения почвы.

Метод центрифугирования почвенной суспензии . Для выделения актиномицетов из почв, особенно из почв в весеннее время, когда в ней развивается большое число грибов и бактерий, применяется метод центрифугирования почвенной взвеси. Метод основан на различии скорости оседания отдельных видов микроорганизмов в центробежном поле. При 3000 об/мин в течение 20 мин частицы, соответствующие по размерам спорам плесеней или клеткам бактерий типа В.mesentericus, В.mycoides, В.subtilis, осаждаются на дно пробирки. Частицы же, соответствующие по размерам спорам актиномицетов, оказываются при данной скорости центрифугирования в поверхностном слое жидкости.

Высевая надосадочную жидкость, удается в большинстве случаев (до 92 %) получить на пластинках агара только колонии актиномицетов.

Метод замораживания – оттаивания почвы . Известно, что микроорганизмы в почве находятся в адсорбированном на почвенных частицах состоянии. Для полноты десорбции микроорганизмов с почвенных частиц применяются различные методы: химические, при которых почвенные образцы обрабатывают различными детергентами, физические, в основе которых лежит метод механического растирания образцов почвы.

Для лучшей десорбции микроорганизмов с почвенных частиц рекомендуется использовать метод замораживания – оттаивания почвы. Данный метод позволяет обнаружить в них в 1,2-3,6 раза больше актиномицетов, чем в тех же образцах без замораживания. Это, по-видимому, связано с повышением десорбции актиномицетов с поверхности почвенных частиц.

Применение питательных сред, содержащих антибиотики . При высеве почвенной суспензии на агаровые пластинки создаются трудности для развития редко встречающихся видов актиномицетов в результате быстрого развития бактерий и широко распространенных в почвах видов актиномицетов. Поэтому для целей направленного выделения определенных групп микроорганизмов в среды для высева почвенной суспензии добавляют различные антибиотики. При добавлении антибиотиков к среде для культивирования микроорганизмов происходит подавление обычной микрофлоры, создаются условия для развития устойчивых к этим антибиотикам форм микробов; последние могут оказаться новыми или редкими видами, способными образовывать и новые антибиотики. Для этих целей часто используют антибактериальные и противогрибные препараты.

Для выделения актиномицетов применяют среды, содержащие в своем составе такие антибиотики, как тетрациклины, неомицин, нистатин, стрептомицин, хлорамфеникол, пенициллин и др. При выделении продуцентов новых антибиотических веществ используют среды, содержащие стрептомицин в концентрациях от 25 до 100 мкг/мл и рубомицин – от 5 до 20 мкг/мл.

В случае добавления к среде стрептомицина наблюдается значительное подавление роста наиболее часто встречающихся видов – Str.griseovariabilis, Str.flavochromogenes, Str.griseolis, Str.aureofaciens, Str.griseus и др. – и выделение культур актиномицетов, которые не обнаруживались на той же среде без стрептомицина. С повышением концентрации стрептомицина в среде общее количество выделяемых актиномицетов уменьшается, однако при этом происходит выделение новых культур актиномицетов.

Рубомицин внесенный в среду для высева почвенной суспензии в значительной степени подавляет рост культур актиномицетов. Довольно устойчивыми к этому антибиотику оказались представители секций Roseus, Helvolo-Flavus и Albus. В указанных условиях в значительном числе вырастают культуры актиномицетов, не образующие воздушный мицелий.

В последнее время показано, что продуценты, например, аминогликозидных антибиотиков, могут быть найдены, в основном, только среди стрептомицетов, устойчивых к действию этих антибиотиков.

Известны и другие методы выделения микробов-антагонистов из естественных мест их обитания. По мнению некоторых микробиологов, к настоящему времени выделено и изучено не более 10 % всех имеющихся в природе микроорганизмов. Поэтому необходимо изучать и разрабатывать новые приемы выделения микробов, которые бы способствовали максимальному обнаружению их в природе.