Текст книги "Антибиотики и химиотерапевтические препараты"

4.3 Качественная характеристика компонентов питательной среды

При использовании тех или иных сред для культивирования организмов с целью выяснения их антибиотических свойств важное значение имеет качественная характеристика отдельных компонентов среды. Под качественной характеристикой входящих в среду компонентов имеют в виду форму основных соединений, в которой они используются.

Источники углерода также могут быть различными: органические кислоты, спирты, сахара и полисахариды, сочетания различных углеродсодержащих соединений и т. д.

Присутствие в среде той или другой формы источника азота или источника углерода или другого компонента провоцирует организм, естественно, поразному на них реагировать в зависимости от наличия у микроба тех или иных ферментативных систем и их активности и как результат определенно направлять реакции обмена веществ. Это может способствовать выявлению потенциальных антибиотических свойств микроорганизмов или, наоборот, тормозить их образование.

Подбирая среды нужного состава, следует учитывать специфику культивируемого организма. Это необходимо для создания оптимальных условий (с учетом специфики организма), которые бы способствовали наилучшему росту микроба и биосинтезу необходимых продуктов жизнедеятельности. Например, если организм не может синтезировать некоторые существенные для его жизнедеятельности соединения (как например, аминокислоты или витамины) из простых веществ субстрата, то для его развития следует в состав среды ввести готовые аминокислоты или витамины. К таким «требовательным» организмам относятся некоторые виды бактерий (молочнокислые и др.). Актиномицеты и преимущественно почвенные плесневые грибы, как правило, строят вещества своего тела и довольно сложные по химическому составу конечные продукты обмена из соединений, образуемых из простых компонентов субстрата.

Источники азота. Источники азота оказывают важное влияние на образование антибиотических веществ микроорганизмами. На средах с одними источниками азота организмы могут хорошо развиваться, но не осуществляют в данных условиях биосинтеза антибиотика. Например, продуцент антиопухолевого антибиотика аурантина S. auranticus прекрасно развивается на среде, содержащей в качестве единственного источника азота пептон, но при этом не образует антибиотика. Биосинтез аурантина идет на среде с нитратом в качестве источника азота. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов в качестве источника азота используют соли азотной, реже соли азотистой кислот, аммонийные соли органических или неорганических кислот, или аминокислоты, белки и продукты их гидролиза (пептоны, гидролизаты). В этих источниках азот находится в окисленной или в восстановленной форме.

В натуральных средах неопределенного состава, содержащих соевую муку, кукурузный экстракт и другие подобные компоненты, азот содержится главным образом в форме белков, питательная ценность которых зависит от наличия у микроорганизмов соответствующих протеаз, расщепляющих эти белки, и определяется тем. насколько легко в процессе ферментативного гидролиза из белков освобождается азот в виде аминокислот и несложных полипептидов, а в конечном счете в форме – NH₂.

Для многих организмов наиболее легко усвояемыми формами азота являются аммонийные соли и аминокислоты, в которых азот находится в восстановленной форме. Так, S. griseus хорошо развивается на средах, содержащих аммонийные источники азота, но не может использовать нитраты в качестве единственного источника азота.

Аминокислоты играют существенную роль в метаболизме микроорганизмов. Это объясняется, во-первых, тем, что аминокислоты непосредственно участвуют в синтезе белка (структурного и ферментов) и различных полипептидов; во-вторых, они могут принимать участие в образовании антибиотиков, в том числе и небелковой природы.

Аминокислоты могут оказывать заметное влияние на активность ферментов (индуцировать их образование или репрессировать, подавлять активность). Присутствие в среде одних аминокислот может приводить к образованию других.

Однако многие микроорганизмы с успехом могут использовать и окисленные формы азота, некоторые из них для биосинтеза антибиотика нуждаются именно в нитратном источнике азота (S. auranticus, S. subtropicus и некоторые другие). По всей вероятности, процесс использования нитратов идет через следующие этапы:

Процесс восстановления нитрата до нитрита идет при участии молибденсодержащего фермента нитратредуктазы. По-видимому, процесс превращения NO₂ в NH₃ происходит через образование азотноватистой кислоты (H₂N₂O₂), гидроксиламина (NH₂OH) и гидрозина (NH₂ – NH₂).

Для ряда актиномицетов нитраты как источники азота иногда усваиваются лучше, чем аммонийные соли. Даже нитриты, если их вносят в среду в небольших количествах, могут использоваться актиномицетами в качестве источников азота. Важно отметить, что использование нитритов тесно связано с источником углерода в среде. Например, в присутствии глицерина нитриты используются гораздо лучше по сравнению с тем, когда в среде присутствует глюкоза.

Доступность того или иного источника азота зависит в основном от химической природы используемого углерода. Так, при развитии S. coelicolor на среде с глюкозой происходит образование органических кислот, в силу чего нитрит, образующийся при восстановлении нитрата, оказывается особенно ядовитым. Если же в среде присутствует аспарагиновая кислота, то ее аминогруппа связывает нитриты и они не оказывают токсического действия.

Использование аммония и некоторых органических источников азота плесневыми грибами в большой степени зависит от наличия в среде органических кислот. Небольшие количества (0,1-0,2 %) дикарбоновых кислот с четырьмя углеродными атомами (например, янтарная, фумаровая) способствуют лучшему усвоению азота. Это, по всей вероятности, связано с тем, что в данном случае легче образуются кетокислоты, которые, в свою очередь, связывают аммиак. В этом виде значительно упрощается включение аммиака в метаболизм грибов.

Определенную роль в развитии организмов и образовании антибиотиков играют также катионы и анионы солей используемых источников азота Например, при одной и той же форме азота могут получиться разные результаты, как в развитии организма, так и в образовании антибиотика. Зависит это от тех особенностей солей, в которых находится данная форма азота, а также от имеющихся в них катионов.

Все эти факторы необходимо учитывать при изучении развития микроорганизмов и возможностей образования ими антибиотиков.

В зависимости от источника азота и формы, в которой он присутствует в среде, микроорганизм будет в состоянии синтезировать антибиотическое вещество или он будет лишен этой способности.

Так, продуцент стрептомицина не образует антибиотика при развитии на средах с нитратами или нитритами в тех случаях, когда они являются единственными источниками азота. Образование стрептомицина происходит на средах с аммонийными источниками азота. То же самое можно сказать и в отношении продуцента хлортетрациклина – S. aureofaciens.

Биосинтез пенициллина идет более энергично, если в среде наряду с аммонийным источником азота имеется нитратный источник азота.

Альбомицин, выделяемый из культуры S. subtropicus, образуется на среде, содержащей в качестве единственного источника азота KNО₃.

Источники углерода. Благодаря различной химической природе, благодаря неодинаковой степени окисленности, источники углерода сами по себе также оказывают существенное влияние на развитие микроорганизмов и, следовательно, на образование ими антибиотических веществ.

Иногда на одних источниках углерода развитие организма и биосинтез антибиотика происходят хорошо, на других – организм или совсем не развивается, или развивается, но без биосинтеза антибиотика.

Например, B. tnesentericus, выделенный из ризосферы кукурузы, лучше развивается в жидкой синтетической среде при единственном источнике углерода – глюкозе. Щавелевая, яблочная, лимонная и уксусная кислоты непригодны для развития В. tnesentericus и образования антибиотика. При этом наилучшим источником углерода в среде является комбинация двух веществ: глюкозы и аспарагиновой кислоты или глюкозы и молочной кислоты. При раздельном использовании глюкозы, аспарагиновой кислоты или молочной кислоты антибиотическая активность этой культуры значительно ниже.

При развитии P. chrysogenum – продуцента пенициллина – лактоза используется организмом медленнее, чем глюкоза, и это сказывается на выходе антибиотика. Если в среде в качестве источника углерода присутствует только глюкоза, то все обменные процессы, осуществляемые грибом, ускоряются. В этих условиях максимум образования пенициллина происходит приблизительно через 50 часов развития культуры, вследствие чего уровень биосинтеза антибиотика остается низким. В присутствии же лактозы максимум образования антибиотика происходит через 150-160 часов и это способствует повышению выхода пенициллина. Поэтому на практике для получения пенициллина обычно используют одновременно и глюкозу и лактозу, что обеспечивает хорошее развитие гриба и высокий уровень биосинтеза пенициллина.

4.4 Источники минерального питания и их роль в развитии МО

Жизнь микроорганизмов и их биохимическая деятельность во многом зависит от наличия в протоплазме клеток и в окружающей среде неорганических соединений, содержащих такие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марганец, цинк, медь, молибден и др.

Макро– и микроэлементы играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Многие из них входят в состав протоплазмы микробной клетки в качестве составных частей некоторых ферментов, другие элементы выступают в качестве компонентов, регулирующих осмотическое давление или изменяющих гидрофильность протоплазмы клеток.

В золе микроорганизмов обнаруживаются фосфор, калий, магний, кальций, натрий, сера, железо, марганец, медь, цинк, бор, висмут и некоторые другие элементы.

Однако присутствие того или иного элемента в сухом остатке микроорганизма не всегда указывает на то, что этот элемент действительно необходим микроорганизму так как некоторые элементы могут адсорбироваться на его поверхности или аккумулироваться в нутрии клетки в процессе жизнедеятельности. При этом большинству из указанных элементов принадлежит активная роль в биохимической деятельности микроорганизма.

Макроэлементы (фосфор, сера, калий, кальций и магний) входят в состав клетки как структурные элементы или же являются частью ферментных систем. И в том и в другом случае они выполняют важнейшие физиологические функции клетки: регулируют проницаемость клеточной мембраны, участвуют в переносе энергии, выполняют роль активаторов ряда ферментов и т.д.

Фосфор. Фосфор необходим для жизнедеятельности всех организмов, так как он входит в состав важнейших соединений клетки: нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипидов, а также обнаруживается в некоторых промежуточных продуктах обмена. Помимо этого соединения фосфора играют определенную роль в различных химических превращениях и, в особенности в углеводном обмене и в переносе энергии.

Большинство микроорганизмов легко использует в качестве источников фосфора неорганические ортофосфаты. Отдельные виды могут наряду с использованием фосфатов потреблять и фитаты (соли инозитфосфорных кислот). К числу таких организмов относятся некоторые грибы, например Penicillium chrysogenum.

Недостаток фосфора в среде приводит к резкому изменению у актиномицетов обмена веществ, связанного с нарушением потребления и усвоения углеводов и азота. В свою очередь избыток фосфора в среде также резко влияет на метаболизм организмов.

При избытке минерального источника фосфора в среде происходит изменение в биохимическом составе протоплазмы мицелия актиномицетов, нарушаются физиологические функции клетки; иногда это резко сказывается на процессе образования антибиотиков.

Продуцент стрептомицина Streptomyces griseus весьма чутко реагирует на изменение концентрации фосфора в среде; изменяется содержание в цитоплазме РНК и ДНК в ядерном веществе, что приводит к смещениям в жизненном цикле актиномицета.

Оптимальное содержание фосфора в среде, в зависимости от ее состава, от 14 до 140 мкг/мл обеспечивает хорошее развитие актиномицета и образование стрептомицина. При повышении концентрации фосфора происходит резкое снижение выхода антибиотика.

Левитов и Бринберг в 1967 году условно разделили продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде на три группы: высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 10 % (продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина), продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет от 10 % до 15 % (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина) и малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет от 18 % до 20 % (продуценты ново-биоцина, грамицидина, олеандомицина).

Сера . Белок и простетические группы некоторых ферментов и коэнзима А содержат серу, без ее наличия в среде не происходит полноценного синтеза белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источниками серы в среде являются неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в органическую молекулу, входящую в состав белка или витаминов, сульфат должен быть восстановлен.

Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин, присутствующая главным образом в белках в виде аминокислотного остатка. Восстановление сульфата в цистеин в микробной клетке идет с участием ряда ферментов (сульфурилазы, пирофосфатазы, сульфитредуктазы) через образование сложных серосодержащих фосфорных соединений.

Соединения серы участвуют в энергетических процессах микроорганизмов, входят в состав многих физиологически активных соединений.

Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами (например, пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин), бактериями (бацитрацины, субтилины, низины), актиномицетами (эхиномицины, группа тиострептона), и в другие компоненты, такие, как тиомочевина, метилмеркаптан и др.

Характерной особенностью антибиотиков, относящихся к группе тиострептона (объединяет более 25 антибиотиков, в том числе тиострептон, сиомицин, тиопептин, актинотиоцин и др.), является то, что в составе их молекул содержится до 16 % серы. Сера входит в состав тиазольного цикла, образующегося путем конденсации и последующих превращений цистеиновых остатков.

Сера стимулирует образование протеолитических ферментов у Penicillium chrysogenum, что сопровождается параллельным биосинтезом пенициллина. При биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента антибиотика является тиосульфат натрия.

Изменение концентрации серы в среде приводит к изменению физиологического состояния мицелия P. chrysogenum и уровня биосинтеза пенициллина. Причем сера выступает в качестве своеобразного конкурента фосфора при воздействии их на мицелий гриба.

Калий. В организме калий выполняет, прежде всего, каталитическую роль. Недостаток калия способствует накоплению щавелевой кислоты у Aspergillus niger. Очень низкая концентрация калия в среде вызывает снижение потребления сахара этим грибом.

Калий выступает в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), он способствует увеличению гидратации протоплазмы клетки.

Кальций. Ионы кальция регулируют активную кислотность (рН) среды, а также выступают в качестве фактора, связывающего остатки фосфорной кислоты. Вместе с тем, не входя в состав простетической группы ферментов, ионы кальция активируют некоторые из них (липазы, аденозинтрифосфатазы и др.). Кальций может выступать в качестве ингибитора некоторых ферментов, активируемых магнием.

При наличии в среде ионов кальция наблюдается снижение лизиса некоторых бактериальных клеток.

Термоустойчивость бактериальных спор связана с наличием в спорах дипиколиновой (пиридин-2,6-дикарбоновой) кислоты, которая в процессе прорастания спор полностью из них исчезает. Также ионы Са играют каталитическую роль в синтезе дипиколиновой кислоты и, таким образом, определяют термостабильность спор.

Известно, что кальций оказывает существенное влияние на азотный, углеводный и фосфорный обмен микроорганизмов.

Магний . Основная функция магния – активация ферментов, необходимых для нормального обмена веществ и роста микроорганизмов.

Ведущая роль Mg²⁺ связана с гликолитическим циклом, где важное значение отводится переносу фосфатов. Довольно часто Mg²⁺ выступает как связующее звено между ферментом (энзимом) и субстратом. Он принимает участие в стабилизации двойной спирали ДНК. Ионы магния играют важную роль в процессе фосфорилирования. Оптимальный эффект действия магния зависит от концентрации источников углерода, от образования организмом оксикислот, от концентрации других ионов, в отношении которых магний является антагонистом. Магний принадлежит к числу весьма физиологически активных металлов. Поэтому его значению в процессе биосинтеза антибиотических веществ необходимо уделять особое внимание.

Микроэлементы (Fe, Cu, Zn, Mn, Мо, Со и др.) также играют существенную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Эти микроэлементы входят в состав ряда ферментов, участвующих в процессах метаболизма.

Названные элементы обладают высокой каталитической активностью в процессах внутриклеточного обмена. Их каталитическая активность возрастает в тысячи и миллионы раз в тех случаях, когда ионы металлов соединятся с молекулами органических веществ и образуют так называемые органоминеральные комплексы. Эти внутрикомплексные металлорганические соединения (хелаты) играют важную роль в реакциях фермент – субстрат.

У микроорганизмов в образовании хелатов принимают активное, участие дикарбоновые аминокислоты и белки.

Железо . Ионы железа играют в жизнедеятельности микроорганизмов главным образом каталитическую роль. Железо входит в состав ферментов – активаторов кислорода, первое место среди которых занимает система цитохромов. Недостаток или избыток железа в среде приводит к нарушению тех или иных сторон метаболизма.

Установлено, что существует конкуренция между железом и марганцем за положение в теме железосодержащих ферментов.

Железо наряду с другими металлами, входя в состав окислительновосстановительных ферментов, играет большую роль в окислительновосстановительных процессах.

Ионы железа входят в состав некоторых антибиотических веществ. Так, например, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при наличии в среде значительной концентрации железа, железо также входит в состав молекулы этого антибиотика.

Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков. Показано, что железо играет важную роль в процессе биосинтеза стрептомицина. Ионы железа наряду с ионами никеля и цинка подавляют активность фермента маннозидострептомициназы, способствующего в процессе развития актиномицета превращению малоактивного маннозидострептомицина в стрептомицин.

Однако ионы железа оказывают угнетающее действие на биосинтез хлортетрациклина вследствие образования комплекса (Fe-антибиотик), который вступает в связь с клетками мицелия актиномицета.

Влияние железа на биосинтез тетрациклина культурой S. aureofaciens зависит как от концентрации этого элемента в среде и ее состава, так и от особенностей штамма. Концентрация железа, равная от 25 до 35 мкг/мл, не меняется в течение всего процесса развития актиномицета. Добавление к среде магния стимулирует образование тетрациклина, а микроэлементы бор, кобальт, литий, цинк, молибден, вольфрам, алюминий, олово угнетают биосинтез этого антибиотика.

Известно также, что железо и медь угнетают процесс спорообразования у бактерий.

Медь. Наряду с железом существенную роль в метаболизме микроорганизмов играет медь. В сочетании со специфическими белками она образует ряд ферментных систем. Представителями этой группы ферментов являются полифенолоксидазы и аскарбиноксидазы, нитратредуктаза, альдегидоксидаза и др. Недостаток меди резко снижает активность названных медьсодержащих ферментов.

В процессе биосинтеза некоторых антибиотиков ионы железа и меди иногда выступают как антагонисты. Известно, что ионы железа необходимы для биосинтеза пенициллина. Однако добавление меди (CuSО₄) к среде тормозит процесс образования антибиотика, но не оказывает влияния на рост гриба.

Внесение в среду железа (Fe₂(SО₄)₃) снимает вредное для биосинтеза пенициллина действие меди.

Цинк . Как и другие элементы минерального питания, цинк играет важную роль в биохимической деятельности микроорганизмов. Он участвует в построении некоторых ферментных систем (фосфатаз, энолаз, полипептидаз). Известно, что ионы цинка оказывают влияние на углеводный, азотный и фосфорный обмены ряда организмов и участвуют в окислительно-восстановительных процессах.

Ионы цинка выполняют каталитическую функцию в РНК-полимеразах микроорганизмов. Поэтому при недостатке ионов цинка в среде может происходить непосредственное нарушение информационной РНК при синтезе белков, в том числе и ферментных систем, что в свою очередь, может приводить к изменению синтеза антибиотиков.

Цинк оказывает влияние на процесс накопления грибами органических кислот, в частности лимонной кислоты. Этот элемент способствует биосинтезу ряда антибиотических веществ (хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др.). Например, недостаток цинка в среде для развития продуцента стрептомицина приводит к значительному замедлению роста актиномицета. Отсутствие в среде ионов цинка резко снижает образование неомицина.

Марганец. Элемент входит в состав многих ферментных систем и, в первую очередь, в состав карбоксилаз. Он принимает участие в синтезе протеиназ. Марганец входит также в состав фосфорилаз, которые участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата.

Установлено, что марганец способствует сохранению внутриклеточных энзимов, участвующих в синтетических процессах при образовании спор некоторыми аэробными бактериями. Таким образом, в присутствии ионов марганца происходит стимулирование процесса спорообразования у бактерий.

Кобальт. Определенное влияние на различные стороны метаболизма микроорганизмов, в том числе на процессы биосинтеза некоторых антибиотиков, оказывает кобальт. Установлено, например, что ионы кобальта повышают биосинтез таких антибиотиков, как гентамицин, курамицин А, фосфономицин. Недостаток кобальта в среде снижает процесс образования антибиотика, а его избыток подавляет биосинтез гентамицина.