Текст книги "Вирусы: Скорее друзья, чем враги"

Странные смерти

Много лет назад мама прислала мне письмо, которое я храню до сих пор. В него была вложена вырезка из газеты, речь в ней шла о неожиданных смертях среди довольно молодых ученых в Париже, которые работали с онкогенным вирусом. Я работала в Институте молекулярной генетики Общества Макса Планка (Берлин), где занималась изучением онкогенов вирусов (их было довольно много, в частности Myc, Myb, Mil/Raf, Src, Ets и еще Erb-B2). В одном парижском институте умерло несколько ученых. «С тобой может произойти подобное?» – спрашивала меня мама, и совершенно небезосновательно. Специальный парижский комитет пришел к выводу, что все опухоли были разного вида, поэтому вряд ли существовал общий фактор. Не было доказано наличие причинно-следственной связи этих смертей с исследованиями животного онкогенного вируса SV40, поскольку опухоли были разными. Раковый антиген (T-антиген SV40) не рассматривался в качестве причины развития рака. Может быть, напрасно? Это произошло 40 лет назад. Роль кофакторов многообразна. У одного это может быть курение, у другого – работа с радиоактивными или ядовитыми веществами, в частности с бромидом этидия, который обычно используется в лабораториях, у третьего – генетические мутации генома – в комбинации с Т-антигеном кофакторы могут обусловить развитие различных видов опухолей. Мне известно несколько случаев, когда, как я подозреваю, в развитии рака, приведшего к преждевременной смерти моих коллег, важную роль сыграл Т-антиген. Я всегда просила своих студентов, работая с SV40 и Т-антигеном, проявлять осторожность, даже если вирус редко вызывает рак у человека или такого вообще не происходило. Однако дозы, с которыми работают в лабораторных условиях, чрезвычайно высоки по сравнению с существующими в природе. Меня этот вопрос всегда волнует, и я считаю, что применяемые в лабораториях химические соединения являются потенциальными канцерогенами и могут провоцировать развитие рака. Возьмем, например, пипетирование ртом (что сегодня себе просто невозможно представить). У моего коллеги развилась опухоль ротовой полости. На протяжении ряда лет он работал с онкогенным вирусом SV40 и практиковал пипетирование ртом. Связано ли это с образованием у него опухоли? Есть записи в истории болезни, но нет убедительных доказательств такой взаимосвязи. Чтобы можно было отказаться от пипетирования ртом, разработали резиновую грушу, которая в силу ряда причин всегда красного цвета. В настоящее время выпускаются автоматические пипетки, поэтому пипетирование ртом запрещено.

Исследователь Ханс Аронсон, проводя исследования в берлинском исследовательском институте, использовал пипетирование ртом, в результате чего «пригубил» токсины дифтерии и умер. Жена Ханса Аронсона была совершенно потрясена его смертью и, убитая горем, учредила премию Фонда Аронсона. Мне рассказывали, что эта женщина носила обувь с бриллиантами, но оказалась не силах перенести смерть мужа, стала морить себя голодом и умерла. Ее племянница пережила еврейские погромы в Германии и в 1987 г. присутствовала на вручении мне премии Фонда Аронсона за исследование рака. На эти деньги я купила мини-орган с лабиальными трубами, двумя клавиатурами и полноценной педальной клавиатурой, поскольку эту премию я должна была потратить только на хобби, а не на исследования. Несколько десятков лет у меня совершенно не было времени музицировать – именно это мне предрек коллега, когда я только начинала работать в Цюрихском университете. Но сейчас, после ухода в отставку, можно попробовать еще раз!

История с Т-антигеном SV40 имела продолжение. Этот антиген вызывает развитие рака у животных, и поэтому он стал предметом исследований многих ученых, которые хотели получить более полное представление о раке. Речь шла об одном гене, но никто не ожидал, что выяснение его роли в развитии рака окажется очень сложным занятием. В 1971 г. президент США Никсон, воодушевленный успешной реализацией космической программы, «объявил войну раку» в рамках принятого Национального закона о раке. Просто он полагал, что благодаря техническому прогрессу удастся справиться с раком, так же как получилось полететь на Луну. Было положено начало исследованиям Т-антигена. Однако Никсон оказался неправ. Проводимые исследования до сих пор не позволяют понять, как один белок выполняет такое количество разнообразных функций – сотни функций. Он почти всемогущ. И что хуже всего – я полагаю, он опасен для работы в лаборатории.

Чему ретровирусы научили исследователей рака?

Ретровирусы показали исследователям направления, где искать онкогены. Благодаря этому примерно 50 лет назад начались молекулярные исследования рака. Моя группа тоже вела подобные исследования. Нам невероятно повезло, и мы одним махом «выудили» семь онкогенных белков – почти сказочная удача. А произошло это следующим образом: под эгидой Европейской организации по молекулярной биологии (ЕМБО) я организовала лабораторный учебно-практический курс по вирусам и онкогенам для 30 студентов практически со всей Европы и США. Наш американский гость Мэтте Стрэнд продемонстрировал новую для студентов и для нас технологию производства моноклональных антител. Мы осваивали эту технологию, одновременно познавая ее, – вот еще один интересный способ совершенствоваться.

Сейчас это уже стандартная технология. В университетских сервисных центрах даже бесплатно производят моноклональные антитела по спецификациям заказчиков. Принцип производства моноклональных антител заключается в слиянии двух клеток: одной из линии «бессмертных» раковых клеток, полученных из опухоли так называемой множественной миеломы или плазмацитомы, и клетки селезенки иммунизированных мышей, на базе которых получают антитела. Получившиеся в результате такого слияния клетки проходят селекцию, из них отбирают отдельные клетки, которые размножают. В результате получается единичный клон идентичных клеток, производящих очень специфичное антитело к специфическому антигену (эпитопу). Вот почему такие антитела называются моноклональными. Мышиные антитела можно «адаптировать» для человека и использовать в качестве основы для высокоспецифических противораковых терапий. Названия таких препаратов заканчиваются на «-мАб», что означает «моноклональное антитело», и это наиболее эффективные способы раковой терапии из имеющихся в настоящее время.

Мою коллегу так вдохновила эта новая технология, что она продолжила получение моноклональных антител (которые она практически раздаривала коллегам) к большинству необычных антигенов, в частности различных поверхностных белков трипаносомы, которая является причиной нарколепсии. Мы попробовали получить моноклональное антитело к одному онкопротеину – но у нас ничего не вышло. Полученное антитело распознавало «не ту часть» белка, не онкогенную (она оказалась слишком консервативной и не иммуногенной). И все же эта часть оказалась универсальной для десятка других онкогенов, и у нас оказалась «удочка» для их «ловли». Однажды жарким летом мы просидели весь день и всю ночь, описывая эти многочисленные онкогены, и не справились с объемом информации. В науке это редкий случай; ни с моими коллегами, ни со мной такого больше никогда не случалось.

Так мы «выловили» онкобелки Myc, Myb или Erb-B2, а также новую киназу Mil/Raf. Для этой цели мы нашли удачное контрольное антитело и включили фамилию его поставщика в список соавторов статьи, опубликованной в Nature в 1984 г. То, что он взял это антитело из морозильной камеры другого ученого, я узнала несколько лет спустя, когда мой коллега, изначально получивший это антитело, спросил меня, где я его взяла и почему не поблагодарила его. Разговор произошел в Колд-Спринг-Харбор, пока мы ждали лимузин, чтобы отправиться в аэропорт. Статья уже вышла, и мне не удалось внести фамилию этого человека в список соавторов и удалить фамилию другого. Новую открытую киназу признали не сразу: была ли она результатом контаминации клеточных культур? Нет, полученное нами моноклональное антитело позволило осуществить столь эффективную очистку, что мы оказались правы. (Позднее мы это доказали путем мутирования киназы, в результате чего она утратила свою функцию. А это всегда считается окончательным свидетельством.)

Обнаруженная киназа Raf работает по принципу каскада, в соответствии с которым одна киназа доставляет фосфатную группу другой и активирует ее. Это напоминает эстафетный бег, где в качестве бегунов выступают Ras, Raf, MEK, ERK. И наконец ERK, будучи заключительным спринтером, проходит через ядерную мембрану и доставляет фосфат к Myc (и т. д.), который затем, будучи транскрипционным фактором, включает и выключает гены клетки, а также соответствующие программы. Это универсальный путь, и он в зависимости от первого стимула может регулировать такие явления, как рост, старение, выработка гормонов, реакция на стресс и запах и даже смерть. Его можно сравнить с телевизионной антенной, которая транслирует ту или иную программу на телеприемник в гостиной, где мы выбираем канал с определенной «программой».

Четыре «бегуна», последовательно принимающих друг у друга «эстафетную палочку», обеспечивают более эффективную амплификацию, регуляцию, остановку и более надежную передачу сигнала, чем один «бегун». И, как это обычно бывает в биологии, результат зависит от входящей информации, контекста, дополнительных факторов или перекрестных помех. Тем не менее основным переключателем является киназа Raf, которая является мишенью для Ras. Она похожа на закрытую оболочку, способную активироваться и становиться более онкогенной с частично открытой оболочкой (сRaf превращается в B-Raf). Онкогенная версия белка активна при многих видах рака, при половине всех злокачественных меланом, при раке яичников, прямой кишки, пищевода и молочных желез. Только недавно было освоено промышленное производство ингибиторов Raf. В настоящее время их около пяти – и это через 30 лет после открытия рассматриваемой киназы. Ингибиторы Raf могли бы иметь практическое применение. Время выживания пациентов в среднем составляет несколько месяцев, что, конечно, неутешительно. Тройная терапия была бы более эффективной. На опыте ВИЧ мы поняли, как использовать несколько препаратов, и такую терапию также нужно применять при лечении рака. Недавно я встретила бывшего коллегу из своего института. Сейчас он профессор дерматологии и успешно лечит меланомы, используя ингибиторы Raf. «Я не знал, что вы ее открыли! Мы с ней работали, а вы мне ничего об этом не говорили!» Действительно, 30 лет – большой срок.

Еще один клинически важный онкогенный белок – это Ras (найден при саркоме у крыс), характеризующийся одноточечной мутацией в кодоне 12. До сих пор не существует ингибиторов Ras, несмотря на гигантские усилия ученых и его значительную роль в развитии 80 % случаев рака у человека. Несмотря на то, что у Ras так много мишеней, что приводит к развитию побочных реакций, стартовала новая программа исследований с серьезной финансовой поддержкой.

Рак молочной железы также зависит от активированных онкогенов, являющихся мишенью для соответствующих препаратов. HER-2/neu или Erb-B2 – рецептор тирозинкиназы, которая в 25 % случаев рака молочной железы вырабатывается в избыточном количестве и является онкогеном. Только в этих случаях назначается дорогой препарат герцептин. Врачи придерживаются индивидуализированного подхода и назначают этот препарат, только если его эффективность гарантирована, иначе его назначение нецелесообразно. Изначально этот онкоген был выявлен в вирусе эритробластоза у цыплят (AEV), который в настоящее время практически забыт. Вирус цыплят не имеет ничего общего с раком молочных желез – и это до сих пор для меня загадка.

Онкобелок Raf может индуцировать два прямо противоположных эффекта: активировать рост и блокировать его. Мы называем это «парадокс Raf». Мы объясняем столь неожиданный эффект «двуликого Януса» действием еще одной киназы (Akt) и других клеточных факторов. Журнал Science принял в печать нашу статью с полученными результатами. Но затем процесс затормозился – видимо, мой бывший коллега из Нью-Йорка представил в Science свою рукопись, что создало проблемы, и публикацию нашей работы отложили. До нас доходили слухи, что экс-коллега ведет переговоры с журналом, но у нас не было фактов. Я никогда не отваживалась на переговоры с журналами. Должно быть, информация о наших данных стала известна за океаном благодаря моему швейцарскому сотруднику. Он любил порассуждать о своих замечательных успехах задолго до того, как они воплотятся в жизнь, в том числе и в компании своего друга, с которым проживал в одном номере во время одного из мероприятий, проводившихся в США, а потом бесконечно долго разговаривал об этом же по телефону. У этой детективной истории оказался счастливый конец, поскольку в итоге обе статьи одна за другой были опубликованы в Science, причем во второй из них наши имена тоже были упомянуты. Я боролась за эту статью! И какой же урок из этого нужно извлечь? Необходимо рассказывать о своих результатах – и тогда у вас будет две статьи в Science… если повезет!

Еще один урок связан с пациентами: «парадокс Raf» имеет определенные последствия для терапии и предусматривает ингибирование роста. А как насчет ингибирования угнетения роста? Вопреки ожидаемому эффекту опухоль будет расти. Недавно ряд авторов описали опасное побочное действие новых препаратов у пациентов, как мы предрекали и показали это на клеточной культуре. Они не упоминали или не помнили ранее опубликованные статьи. В последнее время авторы статей стали практиковать такую хитрость: не цитировать источники в надежде, что рецензенты этого не заметят. Так повышается значимость и приоритет открытия. И действительно, рецензенты часто этого не замечают. Я, к своему удивлению, в пылу эмоций перед всей аудиторией стала рассказывать докладчику о «парадоксе Raf», ожидая, что это вызовет у него беспокойство. «Мы были друзьями», – начала я наступление на коллегу, которого знала 40 лет и которому сначала в личной беседе сказала, что он, кажется, «забыл» упомянуть две наши статьи в Science. «Чего же конкретно вы хотите?» – спросил меня председатель заседания. «Должных ссылок». Председатель заседания и докладчик расстроились, а другие участники заседания стали мне аплодировать и позже – уже на следующий день – поздравили меня и подарили шоколад за смелость. Да нет же, просто я была в ярости! И еще меня немного мучили угрызения совести. На следующий день несколько редакторов стали обсуждать этот хорошо известный случай «нарушения принятой в научном мире этики». Для корректной подготовки библиографии используют системы поиска литературных источников. Кажется, они применяются в фармацевтической отрасли, по крайней мере мне прислали всю информацию об используемых в исследовательских целях Raf-реагентах, которые мне после ухода в отставку более не нужны.

Белок Myc и аварии на реакторе

Еще один класс онкогенных белков относится к транскрипционным факторам, регулирующим клеточные программы на уровне ДНК транскрипции. Одним из самых примечательных из них является белок Myc – универсальный игрок на поле регуляции генов.

В каждой клетке человека присутствуют все гены, но активированным оказывается лишь их определенный набор. Именно так осуществляется специализация клеток, которых в нашем организме насчитывается 200 типов. Однако активация может принять нежелательный оборот: онкогенные транскрипционные факторы вирусов, вызывающих рак, могут запустить не те программы и индуцировать развитие рака. Рассмотрим показательный пример – белок Myc.

Для исследования этого белка нам нужно было вырастить вирус в перепелиных яйцах (мне так никто и не объяснил, почему нужны именно перепелиные, а не куриные яйца!). Перепелиные яйца постоянно исчезали из вивария – мне сказали, что они считаются еще более сильным афродизиаком, чем рог африканского носорога! Однажды мы поместили в инкубатор несколько сот перепелиных яиц, в результате вылупились птенцы перепелов, которых мы переправили в огромную вольеру на Павлиньем острове в Берлине, дабы привести в порядок территорию. Огромный ящик с птенцами мы перевезли на пароме на остров. После столь успешного эксперимента довольный фермер – единственный человек, имеющий право жить на острове, – дал нам несколько павлиньих яиц. Мы попытались вывести из них птенцов. Для этого потребовалось модернизировать инкубатор для крупных павлиньих яиц. Сотрудники мастерской при институте, разделив наш энтузиазм по поводу проведения «прикладного» эксперимента, сразу же это сделали, но, к сожалению, наши усилия не увенчались успехом. Возможно, яйца не были оплодотворены либо их содержимое высохло. В результате нам не удалось вывести птенцов павлинов, а жаль. Поэтому мы продолжили изучать Myc, используя перепелиные яйца.

Обычно белок Myc, клеточный c-Myc, регулирует примерно 15 % всех генов человека путем связывания c белком-усилителем (энхансером). Во многих опухолевых клетках наблюдается сверхэкспрессия Myc. Дерегуляция и несвоевременная экспрессия белка Myc, а также его генов-таргетов могут провоцировать рак. Myс – одна из многих конечных мишеней сигнальных путей, в частности пути Ras – Raf – MEK – ERK, который регулирует клеточные функции. Существует два тканеспецифических варианта белка: L-Myc специфичен к легким, а N-Myc – к нейробластоме, опухоли головного мозга, при которой сверхэкспрессия (может быть 10 000-кратной) коррелирует с очень агрессивным ростом опухоли. Неправильная доза и время действия делают опухолевые белки опасными. Это часто происходит после аварий на атомных реакторах и приводит к повреждению хромосом, обусловливает развитие рака крови, лейкемии и лимфомы. Клетки крови чинят поврежденные хромосомы за счет своих рекомбиназ, а также разрывы, приводящие к развитию аневризмы. Незакономерная комбинация хромосом 8 и 14 приводит к перепроизводству белка Myc и лейкемии, что наблюдалось после чернобыльской аварии. В случае транслокации используется сокращение «t», t(8, 14). Еще одна хромосомная транслокация t(9, 22) приводит к развитию хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ). В результате получается так называемая филадельфийская хромосома, в которой два белка – ингибитора роста становятся укороченными, а при их слиянии образуется онкогенный белок Bcr-Abl, потерявший обе ингибирующие функции, но с выраженной способностью стимулировать рост. Это также является следствием аварий на атомных электростанциях.

Для этого случая, к счастью, уже разработан ингибитор «Гливек» – орфанный препарат (назначаемый при заболеваниях, частота развития которых составляет менее 10 000 новых случаев в мире в год); этот препарат начала выпускать швейцарская компания, но потом прекратила. Однако один ее сотрудник, Ник Лайден, учредил в США новую компанию-преемника (Kinetix Pharmaceuticals), которая оказалась очень успешной, поскольку «Гливек», как это ни удивительно, продемонстрировал активность не только в отношении хронического миелоидного лейкоза, но и при раке желудка и прочих онкозаболеваниях. Затем материнская компания отказалась от выпуска данного препарата! В настоящее время, когда устойчивость к лекарственным препаратам повышается, нужно иметь больше препаратов!

Одно время предполагалось, что Myc – основной онкоген при лимфоме Беркита, но в данном случае он является лишь действующим кофактором. Около 30 лет назад я выступила на конгрессе по лимфоме, проходившем в Израиле и организованном Джорджем Кляйном из Каролинского института в Стокгольме. В своем докладе я рассказала о результатах наших исследований связывания ДНК и Myc, необходимого для генной регуляции. Для меня, немки, было большой честью получить приглашение на этот конгресс от человека, бежавшего из концентрационного лагеря. За исследования Myc меня удостоили награды, но эта история оказалась грустной, поскольку комитет по присуждению данной премии отказался включить в число награжденных моих коллег. Когда же я все равно разделила с ними полученные деньги, у них это не вызвало радости, поскольку деньги и признание коллег – разные вещи. Более того, директор одного исследовательского института в Сиэтле, с которым мы ехали на конгресс в одном такси, не скрывая досады, утверждал, что его коллеги первыми получили результат по Myc. Мы, не зная об их результатах, первыми опубликовали свои данные в Nature. Тем не менее этот расстроившийся коллега, будучи влиятельным человеком, на все оставшиеся годы отстранил меня от исследований Myc! Знаете, что мне сказал директор Общества Макса Планка в Берлине? «У вас всегда будут сложности со значимыми статьями – и никогда со скучными». Вся моя последующая исследовательская судьба подтвердила это. Между прочим, большинство статей скучны!

Даже при отсутствии гена Myc интегрированный в ДНК ретровирус может вызвать рак при помощи своего промотора через механизм «даунстрим-усиления», активации неизвестных клеточных генов. При этом рак у цыплят, который мы наблюдали, очень похож на Мyc-индуцированный рак, за исключением того, что в присутствии Мyc опухоль развивается очень быстро, при его отсутствии – гораздо медленнее. Однажды на фоне проведения генной терапии пациенту был введен данный промотор, что вместо излечения привело к развитию рака. Генная терапия оказалась эффективной у 10 детей, но у двоих наблюдалось развитие лейкемии, поскольку вирусный промотор «запустил» клеточный ген (транскрипционный фактор LMO2), индуцировав лейкемию, которую позднее удалось с успехом контролировать. Теоретически такая опасность всегда прогнозировалась, но шокирует тот факт, что это может происходить с такой частотой – два случая из десяти!

Для одного международного исследования лимфомы среди прочих веществ были использованы полученные нами моноклональные антитела (мАт) к белку Myc, чтобы протестировать их эффективность при диагностике лимфом в соответствии с «Кильской классификацией лимфом». В результате мне предложили должность профессора в Кильском университете. Однако министр (дама) по вопросам научных исследований, высказывавшаяся по поводу моей прелестной зелено-голубой сумочки (любимый цвет жителей побережья), никогда не находила средств на уничтожение инфекционных отходов, которые могли вызвать загрязнение Балтийского моря. Давайте внесем ясность в этот вопрос: я не стремилась попасть в Киль и оказаться в доме своего прадеда. Я хотела работать в Кильском институте. Улица Мёллинг не имеет ко мне никакого отношения, а названа в честь моего прадеда, который построил порт (Северо-Восточный канал – один из самых активно используемых судоходных путей) и пути для железнодорожного сообщения. Его именем можно было назвать улицу и получше.

Myc был опосредованно высоко оценен в 2012 г., когда Нобелевскую премию вручили за исследование стволовых клеток и регенерации тканей. Myc – один из четырех факторов, способствующих превращению взрослых клеток обратно в мультипотентные, активно делящиеся стволовые клетки. Однако именно в этом заключается их опасное сходство с опухолевыми клетками, которые характеризуются нерегулируемым ростом, на чем мы остановимся позднее. Myc может сделать клетки «жирными» – это новое свойство, которое корректирует рост клетки и увеличение ее объема. Приводит ли это к увеличению массы тела? Пока точно не известно.

Существуют ли препараты против Myc? Несколько десятилетий назад, будучи консультантом, я не поддерживала поиск препаратов против этого белка. Мой голландский коллега, помахивая билетами на самолет, пригласил меня в Филадельфию, чтобы встретиться с коллегами из компании Centocor (в настоящее время Johnson & Johnson). Это был Джо Хильгерс, имевший прозвище Летучий Голландец, которому он полностью соответствовал. Я должна была оценить целесообразность рассмотрения онкогенных белков в качестве мишени лекарственного препарата. Я посоветовала этого не делать, так как блокирование этих белков, играющих немало важных ролей в функционировании нормальных клеток, показалось мне слишком рискованным. Я оказалась права насчет Myc: он играет слишком важную роль в росте клеток, в том числе стволовых (как нам в настоящее время известно), чтобы стать мишенью для ингибиторов. Обсуждение этого вопроса началось недавно, при этом L-Myc считается «краткосрочной» мишенью для препаратов, показанных для лечения рака легких. Возможно проведение краткосрочной, временной терапии, небольшое терапевтическое окно, не сопровождающееся слишком большим количеством побочных явлений. Это новая концепция, и сейчас над ней работают многие. Однако мои рекомендации по киназе Raf оказались совершенно ошибочными. Я не могла себе представить, что одну из 1000 известных киназ можно ингибировать столь специфически, поэтому и не предлагала ее в качестве мишени при разработке лекарств. Никому в голову не пришла идея запатентовать Myc или киназу Raf в качестве раковых мишеней, и никто не стал искать ингибиторы к ним. Сегодня, более чем через 30 лет, есть потенциальные ингибиторы киназы Raf, особенно против онкогенной формы, преактивированной для развития рака (онкогенная B-Raf в комбинации с нормальной C-Raf имеет большое значение для развития рака, поскольку они осуществляют гетеродимеризацию и ингибиторы ведут себя непредсказуемо). Новые препараты считаются в настоящее время самыми эффективными противораковыми препаратами и уже применяются в клинических условиях. Некоторые другие ингибиторы киназы весьма эффективны при комбинированной терапии. Ингибиторов Myc пока еще не существует.

В любом случае срок действия патентов уже закончился бы, и чтобы внести ясность, добавлю: я нисколько не обогатилась, как полагают некоторые, да и не должна была, так как мои исследования финансировались государством. Мой вклад в изучение этого вопроса совершенно забыт или почти забыт, но я счастлива, что занималась исследованиями рака (практически) всю жизнь и внесла небольшой вклад в борьбу с онкологией.