Текст книги "Вирусы: Скорее друзья, чем враги"

РНКаза Н – молекулярные «ножницы»

Чаще всего цитируется моя работа, опубликованная не в самом известном журнале. Но это – нетипичный случай. Частота цитируемости является важным критерием качества статьи, что, очевидно, может быть и не совсем так. Я открыла «ножницы», рибонуклеазу Н, или РНКазу Н в ретровирусах животных, а потом еще и в ВИЧ. (Она играет важную роль в процессе репликации ретровирусов от РНК до двуспиральной ДНК: РНК нужно удалить из гибрида РНК – ДНК, для чего используют рибонуклеазу Н (РНКазу Н), обладающую специфичностью к гибриду.) В 1990-х мне позвонили и спросили: «Вы доказали, что данный фермент действительно необходим для репликации вируса?» Звонили из компании, которая была заинтересована в разработке ингибитора РНКазы. Они только собирались разрабатывать препарат против важного вирусного компонента, поскольку разработка лекарства требует серьезной работы и затрат. «Да, конечно, – сразу же ответила я. – В противном случае образование двуспиральной ДНК было бы невозможно – РНК нужно удалить, как только она скопируется в односпиральную ДНК». Однако я поспешила с ответом. «Этому есть формальные подтверждения?» – «Нет!» Мне никогда не приходило в голову, что их нет. Для этого следовало бы осуществить мутацию РНКазы Н (это означало бы уничтожение ее активности) и показать, что вирус более не способен реплицироваться. Это была бы мутация, приводящая к «утрате функциональности». Я не могла провести такой эксперимент, поскольку для этого необходима инфицированная копия ДНК (клон) ВИЧ, направленный мутагенез и тестирование инфицированного вируса-мутанта, что можно сделать только в лаборатории с высоким уровнем защиты (самым высоким, четвертым, уровнем биозащиты). Такую работу могла выполнить только группа компаний Wellcome Co. в Лондоне. Я позвонила им, и мы договорились о сотрудничестве. Для мутагенеза мы искали последовательности генов, которые были описаны в бактерии E. coli и были известны. Следовательно, было просто найти важные сайты для мутации, поскольку они были «консервативны». Такой подход сработал. Как это ни странно, меня тогда нисколько не удивляло, что РНКаза Н хорошо работает и с бактериями. Какая может быть взаимосвязь между бактерией и одним из ретровирусов человека? В те годы, в отличие от настоящего времени, я не рассматривала эволюционный аспект! (Принято считать, что для всех систем репликации ДНК необходим «стартер» – часть ДНК, который какое-то время сохраняется, а потом удаляется при помощи РНКазы Н.)

Я прилетела в Лондон, мы написали статью и представили в журнал для публикации. Ее не приняли, мы попытались еще раз, и ее опять вернули. Статью неоднократно отвергали, поскольку все научные журналы были твердо уверены – и я поначалу тоже, – что «ножницы» РНКазы Н играли важную роль, поэтому никто не считал нужным искать дополнительные доказательства. Это принималось как факт! И наконец нашу статью опубликовали в Journal of General Virology, который в те годы был не самым престижным журналом. Сейчас, когда эта статья считается важной и относится к наиболее часто цитируемым моим работам, хотя опубликована и не в самом известном журнале, есть о чем задуматься!

РНКаза Н очень распространена, что и объясняет отсутствие ее ингибиторов: они могли бы повлиять на слишком большое количество ферментов и обусловить развитие побочных действий. К этому семейству принадлежат даже интегразы. Они не только оказывают расщепляющее действие, как ножницы, но и заживляют разрезы. «Ножницы» действительно «разрезают» молекулярные связи. Все они содержат три консервативные неперекрывающиеся аминокислоты DDE, удерживающие магний, из 100 аминокислот, которые не консервативны, то есть возможна замена некоторых из них. Однажды я пробовала найти родственные белки, сравнивая последовательности, но не учла DDE и потерпела неудачу, и только кристаллическая структура подтвердила родство. Таким образом, можно сделать очень обобщенное заключение: последовательность генов не имеет значения, а фолдинг («сворачивание» белка) и структура – имеют, так же как в дизайне и изобразительном искусстве «функция определяет форму».

В Японии, перед тем как я была вынуждена уйти из Цюрихского университета, мне сделали прощальный подарок – залитую эпоксидной смолой модель кристаллической структуры РНКазы Н, основанной на последовательности, опубликованной в Nature. Эту модель сделал для меня Роберт Краух из Национального института здравоохранения (Бетесда, США), и красота подарка тронула меня. Сегодня такие изделия в виде двух соединенных сердец можно купить на рынке для близкого друга – и на таких сувенирах даже нет координат, опубликованных в Nature.

РНКаза Н и эмбрионы

Недавно в организме человека были обнаружены РНКазы Н, не связанные с ретровирусами. Эндрю Джексон и его коллега из Эдинбурга (Шотландия) проанализировали генетические заболевания у человека, в частности синдром Айкарди – Гутьереса (AGS), связанный с умственной отсталостью. К их немалому удивлению, виновником этого заболевания оказалась РНКаза Н. Ранее этот фермент не обнаруживали в организме человека. Белок состоит из трех субъединиц – РНКазы Н2А, В и С, и лишь одна из них активна. Кроме того, в митохондриях находится РНКаза Н1. Возникло подозрение, что она имеет бактериальное происхождение, поскольку бактерии являются предшественниками наших митохондрий. Клеточная РНКаза Н удаляет отдельные нуклеотиды РНК в наших ДНК-геномах, если некоторые из них случайно туда включаются. Наш геном содержит сотни таких ошибок включения, что, похоже, случается достаточно часто. «Ножницы» РНКазы Н очищают наш геном от этих неподходящих нуклеотидов, предотвращая генетическую нестабильность. Неудачные попытки такого очищения приводят к развитию заболеваний, в частности AGS. В настоящее время специалисты по генетической нестабильности вносят некоторую новизну в несколько старомодные встречи ученых по проблемам РНКазы, которые проводятся раз в два года.

Почему же одного типа РНКазы Н достаточно для ВИЧ, когда организму человека необходимо три? Существует следующий принцип: чем более высокоорганизован организм, тем он сложнее. Клеточной РНКазе Н в организме млекопитающих приходится выполнять дополнительные функции, которые распределяются на несколько белков. И невыполнение одной функции имеет фатальный исход, «эмбриональную смерть».

Часто приходится наблюдать, что мультибелковые комплексы у млекопитающих играют определенную роль в эмбриогенезе. У ВИЧ нет эмбрионов, и поэтому достаточно простой РНКазы Н. Однако РНКаза Н, называемая PIWI, играет чрезвычайно важную роль в сайленсинге (особенно в стволовых клетках), направленном на предотвращение «перепрыгивания» генов (так называемые двигающиеся ретротранспозоны). Таким образом, PIWI (вместе с некоторыми РНК) защищают наш геном и необходимы для обеспечения фертильности семенной жидкости.

РНКаза Н диверсифицирует свои функции путем комбинирования различных строительных блоков в модулирующем режиме. Слияние РНКазы с большим количеством различных доменов обусловливает появление новых функций. Все ферменты сами по себе обладают способностью к расщеплению, но где, когда и как эта способность проявляется, зависит от партнера по слиянию. Известно примерно 10 таких партнеров. И обратная транскриптаза – лишь один из них. Она тянет за собой РНКазу Н (которая выполняет функцию нуклеазы, расщепляющего фермента) вдоль РНК, и, когда обратная транскриптаза останавливается или «спотыкается», РНКаза, используя возникшую паузу, делает разрез (ее каталитическая активность медленнее, чем у обратной транскриптазы). Вызывает удивление существование большого количества РНКаз Н, выполняющих неожиданные функции. Я изучала вирусную РНКазу Н несколько десятилетий и, возможно, отношусь к этому вопросу очень предвзято. Многие другие функции были выявлены позднее благодаря новым технологиям секвенирования. Меня весьма удивило, что РНКаза встречается чаще всего и является самой древней структурой в мире белков, а по распространенности превосходит даже ОТ. Об этом свидетельствуют результаты недавно проведенного филогенетического анализа, основанного на последовательностях генов, определенных Густаво Каэтано-Аноллесом из Иллинойского университета (Урбана). Везде, где есть нуклеиновые кислоты, нужны и «ножницы», чтобы вырезать или «выключить» нуклеиновые кислоты. РНКазы имеют целый ряд обозначений, в частности Drosha, Argonaut, Cas9 и PIWI. РНКаза Н и обратная транскриптаза – одни из наиболее важных компонентов для развития и формирования целостности геномов – это относится и к нашему геному, и к геномам других видов. Я говорю это не только потому, что РНКаза Н и обратная транскриптаза – основная тема моих исследований. Это действительно правда!

Теломераза и вечная жизнь

Можно ли жить вечно? Древнейшая мечта человечества – жить вечно. Возможно ли это? Да, возможно. Существуют клетки, способные жить вечно, этот факт меня очень удивил. К сожалению, это опухолевые клетки. Все клетки нашего организма живут недолго и даже меньше, чем организм в целом. В течение жизни все клетки постоянно восполняются стволовыми клетками. Но это не касается раковых клеток. Практически во всех лабораториях есть клеточная линия HeLa, которой уже более 60 лет. Клетки HeLa – рабочие лошадки для многих исследователей. Источник их происхождения – карцинома шейки матки женщины, которую мы обычно называем Хелен Ланге, хотя на самом деле ее звали Генриетта Лакс: афроамериканка, мать пятерых детей, умершая в возрасте 31 года от карциномы шейки матки. В 1951 г. эти клетки поместили в культуру и вырастили – до этого процедура не удавалась. Вероятно, эта опухоль была агрессивно растущей. В настоящее время наследники Генриетты предъявляют претензии и заявляют, что ничего не знали о ее клетках. Этой теме посвящаются телепередачи, а в 2010 г. появилась новая книга – «Бессмертная жизнь Генриетты Лакс»[10]10
  Склут Р. Бессмертная жизнь Генриетты Лакс. – М.: Карьера Пресс, 2012.


[Закрыть]. Геном клеток секвенировали, и родственников Генриетты беспокоит, что может появиться информация о генетических особенностях, может быть, даже дефектах, носителями которых они могут являться. С тех пор результаты, касающиеся данной клеточной линии, сообщаются финансирующим организациям. Однако мне представляется маловероятным, что клетки после примерно 6000 пассажей в нестандартизированных условиях остались прежними. Будет много хромосомных изменений. Мне кажется удивительным, что опухолевые клетки могут жить «вечно». Почему бы им не существовать чуть дольше, чем обычным клеткам пациентов, но почему вечно? (В лабораторных условиях, конечно, но все же!) Как опухолевые клетки могут жить вечно? Можно ли, основываясь на результатах исследования этих клеток, получить представление о долговечности без развития рака? В интервью меня часто спрашивают, какие еще клетки живут вечно. Наши зародышевые клетки переходят из одного поколения в следующее – значит ли это, что они бессмертны? А стволовые клетки – как долго они могут существовать? Им нужна соответствующая ниша, поэтому возраст и возможности долгожительства зависят еще и от внешних условий. Мелкие животные типа жуков жили «тихонечко» долго и сохраняли жизнеспособность в течение 40 лет в условиях глубокой заморозки при –20 °С.

Одним из отличительных свойств опухолевых клеток является наличие теломеразы, специализированной формы обратной транскриптазы. Она называется теломеразной обратной транскриптазой (TERT), локализуется на концах всех хромосом и проявляет активность в период эмбрионального развития, когда происходит элонгация концов хромосом, в результате чего образуется буферная зона. Элонгация представляет собой монотонный многократный повтор участков, состоящих из семи нуклеотидов. После рождения эти концы становятся короче с каждым делением клетки, так как для функционирования механизма репликации ДНК необходимо некоторое пространство, что-то вроде места для разворота. После этого участок потерян, то есть идет работа молекулярных часов, и при каждом раунде клеточного деления концы хромосом становятся все короче и короче, пока процесс не доходит до области с важной генетической информацией, и тогда это становится опасным! В этот момент концы смыкаются и как бы «склеиваются», после чего клетка погибает. Это явление было открыто Барбарой Макклинток, которую я еще раз упомяну ниже. Можно ли, основываясь на длине теломер, предсказать продолжительность жизни? Нет, это невозможно, поскольку у разных клеток разные молекулярные часы, которые идут с разной скоростью, таким образом у теломер длина разная. Тогда возможно ли хотя бы восстановить удаленные концы, чтобы предотвратить гибель клетки и, следовательно, продлить ее жизнь? Это может стать целью исследований, однако долгоживущие клетки могут оказаться опухолевыми. К таким клеткам относятся клетки HeLa. Одно из общих свойств опухолевых клеток – способность бесконечно делиться. В опухолевых клетках теломераза способна вновь активироваться, что вызывает элонгацию концов, как в эмбрионе. Архимед говорил о точке опоры, находящейся вне Земли. В нашем случае «точка опоры» находится не вне хромосомы, а на ее удлиняемых концах.

Можно ли утверждать обратное и задать следующий вопрос: «Существует ли определенный ингибитор, способный остановить рост опухолевых клеток путем инактивирования теломеразы, то есть действуя как противораковый препарат?» Да, есть: в 90 % всех опухолей теломераза активна и является потенциальной мишенью терапии. Этот подход разрабатывается рядом институтов и компаний, в частности Институтом Пастера в Париже и компанией Geron Corporation в США.

Можно активировать теломеразу, чтобы продлить жизнь определенных клеток. Это и есть антивозрастная терапия, направленная на достижение вечной молодости, – может быть, даже удалось бы предотвратить появление морщин! Биотехнологические компании заинтересованы в разработке кремов, которые, если верить рекламе по телевидению, «активируют теломеразы». Много ли людей понимают, что это значит? Такие заявления звучат очень научно, особенно когда в рекламном ролике снимаются люди в белых халатах, что делается намеренно, чтобы мотивировать людей приобретать продукт как препарат, – но это обещание не имеет ничего общего с действительностью.

На протяжении многих лет у исследователей рака было некорректное представление о теломеразах, поскольку большинство исследований рака человека проводится на мышиных моделях, хотя у мышей рак развивается без участия теломераз. В связи с этим возникает вопрос, подходят ли мышиные модели для вышеуказанных исследований. Но их трудно заменить другими моделями.

Элизабет Блэкберн из Сан-Франциско и ее бывшая студентка Кэрол Грейдер совместно с Джеком Шостаком получили Нобелевскую премию за открытие теломеразы. В одном эксперименте Шостак показал, что защищенные концы теломераз – обычное явление (он показал это на примере одноклеточного организма тетрахимены, а позже на дрожжах, у мышей и лягушек). Недавно он разработал «интеллектуальную электростанцию» для исследователей, использующих эволюционные подходы и эволюционные технологии, «чтобы обогнать естественную эволюцию природы». Манфред Эйген первым разработал эволюционные биотехнологии для усовершенствования состава химических соединений. Шостак тоже пытается исследовать липидные капли, стремясь понять, что заставляет капли делиться, – речь идет о модели с применением волны колебания для деления клеток.

Нечасто Нобелевскую премию присуждают «дважды», за открытие двух столь родственных молекул, как ОТ и TERT. Возможно, сходство между ними заметили не сразу. В последнее время появляется все больше свидетельств, что теломеразы способны транскрибировать РНК в РНК и восстанавливать поврежденную ДНК – это совсем неочевидные функции для теломеразы.

В качестве противораковой терапии мы использовали теломерические структуры, так называемые псевдоузлы, чтобы получить более плотные «узлы» и блокировать активность теломеразы. При проведении исследования на мышиной модели мы с помощью Элизабет Блэкберн остановили рост опухоли (злокачественной меланомы). Том Чех тоже занимается изучением теломеразы. Однажды я задала ему довольно глупый вопрос: имеет ли теломераза РНКазу Н? Мне до сих пор неловко за свой вопрос, поскольку следовало бы знать, что ответ: нет, нет праймера РНК, который удаляется с использованием РНКазы Н. ДНК элонгируется, а РНК остается в зафиксированном состоянии и копируется дальше с целью наращивания цепочки ДНК. Семь нуклеотидов РНК (TTAAGGG) копируются несколько тысяч раз, и в результате происходит элонгирование теломеры. Кроме того, Том Чех сказал, что, по его мнению, ОТ древнее теломеразы, так как ОТ наблюдается повсеместно, тогда как теломеразы имеют более специализированные функции и в процессе эволюции появились позднее. А может быть, наоборот?

Интересно отметить, что у насекомых выработался другой механизм защиты концов хромосом – в качестве коротких мобильных фрагментов ДНК они используют транспозоны, которые мигрируют и связываются с концами хромосом. Это напоминает наращивание волос парикмахером и не предусматривает собственно роста волос. Однако даже транспозоны являются носителями фермента транспозазы, которая родственна теломеразе и обратна транскриптазе, первая фиксируется на теломере, а вторая подвижна. Являются ли теломеразы вырождающимися транспозонами? Для защиты концов хромосом выработались разные механизмы, и все они имеют отношение к ретровирусам и обратной транскриптазе.

Вирусы как клеточные ядра?

Эукариоты содержат ядра, от которых и получили такое название. По аналогии бактерии, не имеющие ядра, называются прокариотами.

Бактерии и клетки могут существовать в симбиозе. Наиболее показательны в этом смысле митохондрии, которые представляют собой бактерии, подвергшиеся эндогенизации и дегенерации, и не могут покинуть клетку. Они отдали 90 % своих генов ядру клетки-хозяина. Некоторые гены также утеряны. У митохондрий из существовавших когда-то 3000 генов осталось всего 300. Они приобрели очень выраженную специализацию, превратились в клеточные электростанции и обеспечивают клетки энергией. А все остальное необходимое им предоставляет клетка.

Мы отметили общий принцип: ради преимуществ специализации при симбиозе утрачиваются гены. Нечто подобное происходило с цианобактериями, которые взяли на вооружение растения, а в настоящее время в виде хлоропластов специализируются на фотосинтезе. Такое на нашей планете наблюдалось лишь дважды – на удивление редко, особенно если учесть, насколько серьезные преимущества в этом случае получает клетка.

Возможно, это все-таки произошло и в третий раз. Кто же стал поставщиком ядер для эукариотов? Известны вирусы-кандидаты, в частности поксвирусы. Даже в настоящее время ретровирус может встраиваться в качестве ДНК-провируса в ДНК поксвирусов. Интеграция происходит в ядре при каждом инфицировании ретровирусом. В ряде случаев в качестве возможных кандидатов источника ядер рассматриваются вирусы герпеса. Еще одним кандидатом мог бы стать псевдовирус, в частности вирус гепатита В. Его ДНК обычно не интегрируется в ДНК клетки-хозяина, но это могло бы способствовать интеграции ДНК ретровируса или иной ДНК. Произошедшая в прошлом интеграция ДНК-провирусов из ретровирусов в наш геном может быть обнаружена и сегодня. До 50 % нашего генома связно с интегрированными ретровирусами. Сформировали ли они наш геном, а еще и ядро?

Мы до сих пор не обсудили вопрос, откуда появились первые клетки. Первичные клетки относят к древнейшим универсальным общим (или клеточным) предкам (LUCA[11]11
  Latest Universal Common (or Cellular) Ancestors (англ.). – Прим. ред.


[Закрыть]). Был ли вирус предшественником LUCA? В чем заключается роль вирусов? Только ли в поставке ядер или, возможно, в формировании клетки в целом?

Гигантские вирусы, на которых мы подробно остановимся далее, укрепляют подозрение, что вирусы могли быть предшественниками клеток. Если LUCA представлял собой вирус, его нужно было бы назвать LUCAV, где V обозначает вирус, как предложил Евгений Кунин из Национального института здравоохранения (Бетесда, США). Он имеет в виду не превирус, не отдельно взятую последовательность генов вируса, а смесь большого количества различных последовательностей генов вируса, напоминающую квазивиды Манфреда Эйгена. И все же Эйген не считает, что сначала появились вирусы, что они сыграли важную роль на начальном этапе эволюции. Были ли бактерии «раздувшимися» вирусами? Данные проведенных недавно анализов подтверждают такую точку зрения, поскольку имеется широкий спектр вирусов – от мелких до гигантских, и последние оказываются даже крупнее некоторых бактериальных клеток. Луис Вильярреаль (Калифорния), так же как Евгений Кунин из Бетесды, долгое время является противником концепции первичности вирусов – точки зрения, согласно которой эволюция шла от вирусов к клеткам. Самые первые клетки и вирусы были похожи. Они представляли собой маленькие мешочки, состоявшие из липидных мембран и заполненные все более увеличивающимся количеством биомолекул, первых молекул, на основе которых возникла жизнь на Земле. Этот переход от вирусов к клеткам был не резким, а развивался постепенно, поэтому не обязательно придерживаться догматичной позиции в вопросе о том, что было первой простой структурой: вирус или клетка.