Текст книги "Вирусы: Скорее друзья, чем враги"

Вирусы для выявления вирусов – ПЦР

Обратная транскриптаза имеет большое значение не только для репликации ретровирусов и функционирования механизма «копировать и вставить», который действует в наших ДНК-геномах, но еще и в повседневной работе исследовательских лабораторий. Обратная транскриптаза играет важную роль в осуществлении полимеразной цепной реакции, системы амплификации. Эта система напоминает упрощенную репликацию вируса в пробирке, где происходит экспоненциальная амплификация генов. Эта технология стала революционным событием в области диагностики, поскольку до сих пор остается наиболее чувствительным методом выявления нуклеиновых кислот в микроорганизмах, вирусах, бактериях, опухолевых клетках, образцах любых тканей, ископаемых останках, мумиях, шерсти вымерших бизонов и т. д. Можно выявить даже мутации – единичные генетические изменения. Часто во время обычных посещений врача ПЦР проводится в целях диагностики либо мониторинга статуса заболевания или же реакции организма на терапию, поскольку эта реакция чрезвычайно быстро дает результаты. Получить несколько миллиграммов образца вполне возможно, и этого объема достаточно для проведения окрашивания – метод, который позволяет «увидеть» амплифицированную ДНК. Затем амплифицированная ДНК подвергается дополнительному анализу (секвенирование). Возможны варианты: если исходный материал представляет собой РНК, тогда применяется обратная транскриптаза для получения ДНК – так же, как для репликации ретровируса. Количество РНК отражает активность гена, что является информативным показателем, используемым в исследовательских и медицинских целях. Не соответствующая норме экспрессия может служить признаком заболевания. Поэтому важно провести количественную ПЦР с детекцией в реальном времени, и этот аналитический метод используется очень часто. Такой анализ называется «профилирование экспрессии» и проводится для определения активности всех генов клетки. Он характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью: например, в контексте ВИЧ вирусная нагрузка может определяться на очень низком уровне – 20 вирусных копий на 1 мл. Именно это в газетах называется «излечение», однако на самом деле речь идет не о реальном излечении, а о снижении количества вирусов до неопределяемого уровня. За счет использования технологических приемов удается ускорить реакцию и сделать ее более специфической, а термостабильные ферменты, предназначенные для реакции копирования, позволяют осуществлять полностью автоматическую амплификацию. В Йеллоустонском национальном парке такие ферменты обнаружили в гейзере с температурой воды 60 °С, но потом их стали находить во многих других термальных источниках. Говорят, что один ученый, желая получить термостойкие бактерии из такого термального источника для выделения термостабильной ОТ, поскользнулся на краю кратера и в результате потерял ногу. Если это правда, это очень печально. Этот фермент называется Taq-полимеразой, где Taq означает термостойкую бактерию Thermus aquaticus (это не архея).

Этот метод настолько чувствительный, что позволяет амплифицировать нуклеиновые кислоты из столь малого количества, что они могут оказаться «ни при чем» или не связаны с заболеванием – тем не менее! Поэтому сверхчувствительность метода может быть контрпродуктивна, а слепая вера в него – неправомерна и даже опасна. На самом деле мы не знаем, может ли наша иммунная система удалить незначительное число патогенов или даже раковых клеток, чтобы мы никогда не заболели, но это можно выяснить с помощью ПЦР, и это нас беспокоит.

Однако этот метод действительно помог нам найти утечку опасных фрагментов ДНК ВИЧ в одном из ламинарных боксов, которые попали туда из пробирок. А поскольку мы разрабатывали вакцину от ВИЧ на основе ДНК, то оказались вакцинированными ДНК, находившимися в лабораторном воздухе. При помощи ПЦР удалось найти утечку. Есть еще один недавний, более известный пример: с помощью ПЦР удалось идентифицировать английского короля Ричарда III по останкам из могилы, находящейся под парковкой в Лестере, сравнив ДНК этих останков с ДНК ныне здравствующих членов королевской семьи. Для восстановления филогенетических деревьев мамонтов достаточно шерсти, а для реконструкции миграционных путей первых ископаемых гоминидов вполне достаточно небольших костных образцов. Можно даже реконструировать пищу через несколько тысяч лет. Так же как можно обнаружить микроорганизмы в смоге Нью-Дели или Пекина. ПЦР радикально изменила процесс поиска преступников и убийц, и в настоящее время для определения личности достаточно буквально капли биологической жидкости или волоса. Все это стало возможно благодаря ПЦР.

Этот метод вызвал споры, поскольку несколько ученых претендовали на его открытие. Потом о нем забыли, а позднее открыли снова и усовершенствовали. Это был последний прорыв. Патентообладателем на данный метод является компания Hoffman La Roche, которая и получает роялти, но в научных целях этим методом можно пользоваться бесплатно. Изобретатель этого метода – человек необычный. После того как он несколько лет разрабатывал данную технологию в Cetus Co., его уволили из компании. Как мне рассказывали, ему заплатили $10 000, а продали эту технологию Hoffman La Roche за $300 млн. И все же справедливость наконец восторжествовала и эксцентричный изобретатель Кэри Муллис в 1993 г. получил Нобелевскую премию за открытие в области химии. Выступая с речью на церемонии вручения премии, он с сожалением сказал, что Нобелевская премия разрушила его отношения с девушкой! The New York Times писала, что его метод разделил биологию и медицину на две эпохи – до и после изобретения ПЦР.

4. Вирусы и рак

Тасманийский дьявол

Начну с важного замечания: рак – неинфекционное заболевание. Это важно знать тем, кто контактирует с онкологическими пациентами, – не нужно беспокоиться.

Это правда? Всегда? Без каких-либо исключений? К сожалению, некоторые исключения встречаются: к этим немногим исключениям относится тасманийский дьявол. Ученые занимались изучением этих животных с целью понять, почему их опухоль заразна. Они кусают друг друга и выглядят устрашающе – как дьяволы! У укушенных особей в 90 % случаев развивается лицевая опухоль. Эти животные находятся на грани вымирания. Как ни странно, контагиозный агент до сих пор не выявлен. Причина передачи рака заключается в том, что тасманийские дьяволы изначально больны. У этих животных наблюдается иммунодефицит, поэтому клетки, перенесенные от одного животному другому, не воспринимаются организмом как инородные и иммунная система укушенного животного толерантна к ним. Недавно проведенное секвенирование генома показало, что все тасманийские дьяволы являются очень близкими родственниками. Клетки других животных, как правило, воспринимаются иммунной системой как инородные и отвергаются. Но не в случае с тасманийскими дьяволами. Поэтому при передаче опухолевых клеток образуется новая опухоль. В результате сильных укусов образуются кровавые раны, и опухолевые клетки попадают непосредственно в кровоток и сразу же, подобно метастазам, проникают во все области организма. Такой результат позволил всем исследователям рака вздохнуть спокойно, поскольку это значит, что тасманийские дьяволы – совершенно особый случай. Итак, все снова сошлось: рак – непередающееся заболевание. Как правило.

Организм пациентов, которых готовят к трансплантации органов и для этого подавляют иммунитет, реагирует так же, как организм тасманийских дьяволов. У пациентов любой инородный орган, как правило, не является «своим» и отторгается несовместимым маркером клеточной поверхности, молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС). Чтобы организм «принял» трансплантат и не отторгал его, необходимо подавить иммунную систему пациента. В организме тасманийских дьяволов именно это и происходит.

В качестве модели для изучения раковых клеток исследователи используют мышей, лишенных иммунной системы. Эти мыши имеют генетический дефект, обусловленный потерей Т-клеток, компонентов иммунной системы, а также волосяного покрова, в силу чего они получили название «голых» мышей. В отличие от нормальных мышей, им путем инъекции можно ввести опухолевые клетки, которые не отторгаются организмом, а приводят к развитию опухоли, даже если эти опухолевые клетки неродственных им видов, в частности человека. Мы, как и любой исследователь рака, обычно использовали этих мышей. Есть еще один специальный вид лабораторных мышей – мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), на модели которых можно изучать инородные опухолевые клетки; ТКИД может развиваться и у людей (заболевание, напоминающее СПИД). Чтобы избежать риска инфицирования, таким пациентам приходится жить в стерильных условиях специальных «палаток». Кроме того, мышей с ТКИД сложно разводить. Я еще не рассматривала возможность использовать тасманийского дьявола в качестве животной модели для изучения раковых клеток человека – слишком уж они свирепы и есть в них что-то зловещее. Известно еще две трансмиссивные опухоли, которые развиваются у двух видов животных, – трансмиссивная венерическая саркома (ТВС), передающаяся половым путем и поражающая половые органы у собак, и другая опухоль – у хомяков. Обе опухоли напоминают генетическое заболевание тасманийского дьявола.

Ретровирусные онкогены

Изучение ретровирусов особенно помогло ученым понять, как вирус способствует развитию опухоли. Поэтому такие ретровирусы еще называют онкогенными (или опухолевыми) вирусами. Они являются носителями генов рака, или по-другому онкогенов, в связи с чем многие ретровирусологи считают себя исследователями рака – и я в их числе. Многие из этих вирусов являются лабораторными штаммами и редко встречаются у человека, а если и наблюдаются, то только в комбинации с прочими факторами, которые обусловливают их канцерогенность, – зачастую после нескольких десятилетий. Однако они способны вызвать рак у животных (мышей, кошек, коров) и даже у растений, а также у обезьян.

Известно около 100 вирусных онкогенов. Все они характеризуются главным образом способностью стимулировать рост клеток. Онкогены, не дающие клеткам преимуществ роста или даже подавляющие его, не проявляют себя, и их часто не замечают. Опухолеродные вирусы могут обусловить появление небольших скоплений клеток в чашке для культивирования, «мини-опухолей», называемых очагами. Они могут быть достаточно большими и различимы невооруженным глазом. Исследователи собрали самые крупные очаги и выделили вирусы, имеющие онкогены, наиболее активно стимулирующие рост опухоли. У животных «лучшие» онкогены индуцируют развитие самых больших опухолей. Эти вирусы помогли нам, исследователям, отобрать самые опасные онкогены. В настоящее время – и уже около 40 лет – их часто используют фармацевтические компании в качестве оптимальных мишеней для противораковой терапии, что привело к разработке современных наиболее эффективных лекарств. Подождите немного, и я объясню, какую роль исследуемые в пробирке онкогены играют в изучении рака у человека.

Нормальные клетки перестают расти, «столкнувшись» с соседними клетками. Это явление хорошо известно тем, кто работает на кухне, – заживление пореза на пальце происходит за счет роста клеток, и, как только они соприкасаются с соседними клетками, рост прекращается. Это явление называется контактным ингибированием роста. У опухолевых клеток нет такого стоп-сигнала, который не допускал бы роста клетки поверх другой клетки, что является важным аспектом роста опухолевых клеток.

Проводилось долгосрочное исследование, целью которого было понять, откуда берутся онкогенные вирусы: изнутри или извне клетки. Чтобы ответить на этот вопрос, ученым нужно было сначала понять, как осуществляется обмен генами между вирусами и клетками, то есть каков механизм горизонтального переноса генов (ГПГ). Этот процесс предусматривает перенос генов в обоих направлениях: гены, находящиеся внутри клетки, выводятся из нее вирусами, а вирусы в результате инфицирования способны переноситься в новые клетки. Может происходить накопление вновь приобретенных вирусных генов путем их интеграции в клеточный геном. Таким образом, осуществляется перенос генов в обоих направлениях. Гены, переносимые вирусами, выбираются случайным образом – по крайней мере первоначально. Когда экспериментаторы отобрали онкогены, индуцирующие быстрый рост клеток или опухоли, то в итоге получили вирусы, имеющие особые гены, которые обеспечивают клеткам самое большое преимущество, а именно возможность неконтролируемого деления, а это – признак рака. Имеет значение еще одно явление. Высокая частота мутаций вируса обусловливает существование канцерогенных генов, наиболее эффективно стимулирующих рост клеток. Мутации происходят в процессе репликации вируса, для чего задействуется обратная транскриптаза, работа которой не застрахована от ошибок и «нестабильна». Во время каждой репликации происходит 10 мутаций на каждые 10 000 нуклеотидов (размер ретровируса). Столь высокая частота ошибок делает ДНК-содержащие вирусы весьма «изобретательными». Мутагенез – часть стратегии выживания вирусов. Мутации повышают онкогенность онкогенов. Клетки с ДНК-геномами, в частности клетки человека, выработали корректирующие механизмы, которые в значительной степени предотвращают мутации. И это хорошо для нас, поскольку в противном случае вероятность заболеть раком была бы выше. Клеточные онкогены обозначаются как c-onc (или протоонкогены), а после мутирования их вирусами они называются вирусными онкогенами v-onc (или вирусными онк) – они «лучше», поскольку обладают более сильным онкогенным действием. Таким образом, онкогены имеют клеточное происхождение, но вирус модифицирует их.

В Центре секвенирования по Сэнгеру при Кембриджском университете (Великобритания) проводилось крупномасштабное исследование, в рамках которого осуществлялся скрининг раковых клеток в поиске канцерогенных генов. У человека 20 000 генов. Сколько из них канцерогенных? Исследователи выявили сотни таких генов; но интересно, что зачастую наиболее выраженная канцерогенность отмечалась у вирусных онкогенов, которые исследователи отобрали и изолировали. Таким образом, именно вирусы, а не механизм секвенирования помогли нам выявить онкогены. Более того, в лабораторных условиях именно их сначала выявили вместе с опухолевыми вирусами, а уже позднее, при раке у человека, – независимо от вирусов. Примерно 10 из них в настоящее время являются мишенями для довольно перспективных препаратов против рака у человека.

Вирусы показали нам, что вызывает рак. В настоящее время известно около 100 онкогенов ретровирусного происхождения. Как же они вызывают рак? Стоило бы вспомнить, как был открыт первый онкоген – «саркома», или ген Src, являющийся частью вируса саркомы Рауса (RSV или ВСР), вызывающего рак у цыплят. А теперь обратимся к истории открытия этого вируса.

Сага о саркоме

Пейтон Раус, ученый, открывший онкогенный вирус, сдался. Так же как Галилео Галилей, который лгал суду инквизиции и, чтобы спасти жизнь, отказался от своих исследований, Раус под давлением коллег прекратил исследования рака. Они не смогли воспроизвести полученные им результаты, и вместо того, чтобы как-то решить проблему, Раус просто не стал ничего предпринимать! Примерно 100 лет назад было установлено, что рак может передаваться, как и все инфекционные заболевания у цыплят. Однажды фермер принес ему в Рокфеллеровский университет (Нью-Йорк) цыпленка с большой опухолью. Фермер опасался, что заразятся остальные цыплята. Раус, будучи опытным патологом, диагностировал саркому. Он изолировал опухоль, гомогенизировал клетки, профильтровал их и ввел вирус здоровым цыплятам. Появились новые опухоли. Такой результат соответствовал первому постулату Роберта Коха, сформулированному примерно в 1880 г., согласно которому изолированный агент считается возбудителем заболевания, если он возбуждает такое же заболевание, из которого был впервые изолирован. Раус говорил о «фильтруемом агенте», а не о вирусе. Он опубликовал результаты в 1911 г. Аналогичные результаты по лейкемии были получены и опубликованы Вильгельмом Эллерманом и Олафом Бангом. Но проблема заключалась в том, что никому не удавалось воспроизвести результаты, полученные Раусом. В то время еще никто не знал о генетической резистентности к вирусам и раку. Его оппоненты использовали разных, устойчивых к опухолевому агенту цыплят. Сегодня это просто и понятно. Раусу не повезло, он упустил из виду главное.

Восемьдесят лет спустя то же самое произошло и со мной. Я не знала о проблеме, с которой столкнулся Раус. Какая досада! Я пыталась вырастить вирус лейкемии у цыплят, чтобы изолировать его в большом количестве для выделения и изучения обратной транскриптазы. На протяжении нескольких месяцев я успешно занималась этим проектом. Однако после того, как моя лаборатория переехала из Общества Макса Планка (Тюбинген) в Институт Роберта Коха (Берлин), у меня перестало что-либо получаться. Цыплята просто не заболевали, и вирус реплицировать не удавалось. Пребывая в отчаянии, я заказала цыплят у первоначального поставщика – птицефермы, находящейся недалеко от Тюбингена, хотя это было сопряжено со сложной транспортировкой нескольких тысяч однодневных цыплят в Берлин рейсом Pan Am, поскольку в то время Западный Берлин находился посреди бывшей Восточной Германии. В организме цыплят от прежнего поставщика вирус заработал. Цыплята заразились вирусом (он называется вирусом миелобластоза птиц, ВМП), и было получено огромное количество вируса. Через много лет началось исследование ВИЧ. И тогда мы впервые не без удивления поняли, что есть люди, устойчивые к этому вирусу: 15 % европейцев не заражаются ВИЧ в силу генетической резистентности, поскольку у них есть дефектный рецептор для внедрения вируса в клетку (CCR5delta32).

Раус и его коллеги просто не догадались, что использовали «не тех» цыплят. Возможно, знание этого не помогло бы Раусу, поскольку, принимая во внимание подобные исключения, его концепция не была достоверной. Но он сдался! Он не понял значимости своего наблюдения для переноса опухоли у животных! Тем не менее позже его признали «отцом онкогенных вирусов», и первый открытый онкогенный вирус был назван в его честь вирусом саркомы Рауса (ВСР). В 1966 г., через 55 лет после своего открытия, Раус получил Нобелевскую премию. Ему исполнилось 87 лет. Его номинировали на Нобелевскую премию за 40 лет до этого, но в то время ему ее не присудили. Он разработал метод выращивания вируса в хорионаллантоисных мембранах куриных яиц (напоминает небольшой воздушный пузырь). В это трудно поверить, но данным старинным способом мы до сих пор пользуемся для получения миллионов доз вакцины от вируса гриппа. Этот же метод мы применили для проверки предполагаемого случая заражения оспой в 1970-х гг. Тогда в Институте Роберта Коха (Берлин) при помощи специального инструмента мы вскрывали скорлупу, помещали туда подозрительный образец, закрывали скорлупу и инкубировали яйца в целях выращивания вируса – в такой питательной среде он рос невероятно быстро!

Вирусный белок v-Src многофункционален. Одиночная многофункциональная молекула задействована на нескольких этапах образования опухоли. v-Src короче аналогичного клеточного белка с-Src на семь из 536 аминокислот. Такое изменение может показаться незначительным, но вирусы всегда ищут простые решения, и небольшое уменьшение числа аминокислот имеет колоссальные последствия – потерю связывания с внутренней стороной клеточной поверхности, что обусловливает неконтролируемый рост клеток и развитие рака. Потеря даже одной кислоты на конце имеет серьезные последствия – поведение клетки приобретает метастатический характер. Обнаружив это явление, мы были настолько удивлены – в это было очень трудно поверить, – что стали его анализировать. Мы объяснили это потерей способности белка связываться с супрессором опухоли, что имеет серьезные последствия, ведет к потере контроля над межклеточным взаимодействием, вследствие чего у клеток появляется возможность менять свою локацию, вызывая метастазы. Следующий сюрприз заключался в том, что столь крошечная потеря одной аминокислоты вызвала изменение почти сотни других клеточных функций. (Мы показали это, проведя анализ профиля экспрессии метастатических клеток. Более подробно эта процедура описана в главе, посвященной «-омикам».)

Вирусные промоторы (длинные концевые или LTR-последовательности) интенсифицируют синтез белка v-Src. Это обусловливает сверхэкспрессию онкогена, что является опасным дозозависимым эффектом. Вирусные промоторы обычно регулируют репликацию вируса внутри клетки, обходя изменение функции клеток, так называемое «эгоистическое поведение» вирусов. Такие вирусные промоторы обладают самыми мощными свойствами, известными в биологии, – усиливают экспрессию вирусных генов, что приводит к выраженной передозировке онкогена, «промоутируя» развитие рака. Это любимые инструменты для экспрессии генов во всех биомолекулярных лабораториях.

В Сан-Франциско в 1970-х гг. Джон Майк Бишоп и его ассистент-постдокторант Гарольд Вармус использовали белок Src в качестве модели для исследования рака. Они пытались выяснить происхождение этого вируса и обнаружили его везде – от мух до слонов, в нормальных клетках, совершенно свободных от рака. Это было загадочно и, казалось, предполагало системную ошибку. Они отозвали свою статью, которая была уже принята к публикации и материалы которой уже начали циркулировать в Институте вирусологии Общества Макса Планка (Тюбинген).

Проблема заключалась в том, что применявшиеся методы не позволяли отличать нормальные гены Src от онкогена: немного более короткая версия этого гена (онкоген) выглядела так же. Джон Майк Бишоп и Гарольд Вармус решили эту проблему и в 1989 г. получили Нобелевскую премию за свою работу. Я присутствовала на их чествовании в лаборатории в Колд-Спринг-Харбор. Майкл был в смокинге и держал в руках рукопись – обычно для обсуждения она никогда не была ему нужна. Вармус (который, насколько я помню, приезжал на все мероприятия, проводившиеся в Европе, на велосипеде и был настолько мокрым, что хоть выжимай) выглядел энергичнее большинства присутствовавших! Они вдвоем пришли ко мне в лабораторию в Обществе Макса Планка (Берлин) и спрашивали о диких кабанах на территории охотничьего замка Грюневальд, упомянутого в путеводителе, – раньше мне никогда не задавали таких вопросов. Питер Фогт из Лос-Анджелеса, поставлявший вирус саркомы Рауса, тоже внес свой вклад в исследования. Кроме того, берлинец Питер Дюсберг вместе со Стивом Мартином (в настоящее время оба работают в Беркли), проведя важный эксперимент, показали, что генетически модифицированный инактивированный Src не вызывает развития опухоли. Это стало последним весомым доказательством того, что Питер Дюсберг – адвокат дьявола и всегда придерживался точки зрения, противоположной мнению научного сообщества (всегда напоминал Мефистофеля из «Фауста» Гёте). Он неоднократно оказывался прав, но жестоко ошибся, когда отверг идею о том, что ВИЧ является причиной СПИДа. Я помню, как он говорил это нескольким сотням слушателей во время подиумных обсуждений в Университете им. Гумбольдта в Берлине. Я считала эту точку зрения опасной и вводящей в заблуждение. Мы с ним не раз устраивали научные дискуссии, никогда не приходили к общему мнению, но всегда оставались друзьями.