Текст книги "Происхождение жизни. От туманности до клетки"

Стало понятно, что надо искать другие подходы к копированию РНК. Например, процесс копирования мог поначалу происходить путем сшивания концов коротких цепей, а не одиночных нуклеотидов. Обзор Карлоса Брионеса с соавторами (2009) суммирует главные открытия в этой области.

В этом сценарии первые РНК длиной 20–30 нуклеотидов образуются при случайной полимеризации на минералах. Многие из них имеют участки, комплементарные другой части молекулы, и образуют шпильки (рис. 9.3). Среди них были первые рибозимы, проводящие реакцию сшивания концов двух цепей РНК, под названием «лигазы». Они сшивали некоторые РНК друг с другом, что приводило к появлению, во-первых, более активных лигаз, а во-вторых, эти лигазы лучше узнавали те короткие РНК, из которых могли быть построены их собственные копии. По мере роста размеров и сложности РНК среди лигаз могли появиться и рибозимы-полимеразы.

Такой сценарий решает часть проблем, которые были в сценарии случайного появления полимеразы. Во-первых, рибозимы-лигазы гораздо проще и короче, чем рибозимы-полимеразы: при комнатной температуре хорошо работают лигазы длиной 40–50 нуклеотидов, а во льду – даже более короткие фрагменты, вплоть до 29 нуклеотидов (Vlassov et al., 2004). Молекулы РНК таких размеров реально получить при случайной сшивке нуклеотидов без помощи рибозимов. Во-вторых, лигазы могут сшивать две разные функциональные молекулы РНК, образуя более крупные модульные рибозимы, – путь усложнения, малодоступный для рибозимов-полимераз. В-третьих, в экспериментах рибозимы-лигазы склонны образовывать сообщества, в которых разные лигазы ускоряют сборку друг друга, поддерживая более сложную и разнообразную систему, чем один рибозим-полимераза. Более того, такие сообщества выигрывают в конкуренции с эгоистичной лигазой, собирающей только свои копии. В экспериментах Трейси Линкольн и Джеральда Джойса пара лигаз собирала копии друг друга (Lincoln, Joyce, 2009) и удваивала свою численность менее чем за час, тогда как полимеразы не могут собрать свою копию и за сутки! Более того, добавив в систему несколько версий «сырья» – коротких цепочек РНК, они добились конкуренции разных вариантов рибозимов-лигаз и начала эволюции среди них. Единственный недостаток известных сообществ лигаз, не позволяющий признать их окончательным решением проблемы копирования в мире РНК, – это необходимые для них исходные материалы. Лигазы Линкольн и Джойса так же, как их аналоги, полученные другими учеными, требуют довольно длинных фрагментов РНК, около 20 нуклеотидов, для построения из них собственных копий. Если материал для лигаз поставляется случайным соединением нуклеотидов на глине, то вероятность получения нужного 20-нуклеотидного фрагмента РНК будет крайне мала – около одной триллионной. Лигазы, хорошо работающие с кусочками РНК в три – пять нуклеотидов, пока получить не удается.

Интересный вариант содружества лигаз был получен в работе Щепанского и Джойса (Sczepanski, Joyce, 2014). Они отступили от принципа хиральной чистоты и сделали рибозим из нуклеотидов с «левыми» молекулами рибозы, отбирая его на способность сшивать обычные РНК с «правой» рибозой. В этом случае звенья рибозима не образуют комплементарных пар с теми молекулами, которые он сшивает. Подобные взаимодействия приводят к застреванию молекул РНК в обычных рибозимах-полимеразах и лигазах и сильно замедляют их работу. «Левый» рибозим из 83 нуклеотидов оказался очень хорошей лигазой, способной построить свою зеркальную копию из 11 коротких фрагментов РНК по 7–11 нуклеотидов. Зеркальная копия, в свою очередь, так же эффективно строит исходный «левый» рибозим из «левых» коротких РНК. Такой способ копирования был назван «кросс-хиральная репликация». Как и некоторые другие лигазы, этот рибозим может по совместительству «подрабатывать» полимеразой: он достраивает РНК-затравку, присоединяя к ней до шести нуклеотидных звеньев, причем к «правой» затравке присоединяются только «правые» нуклеотиды из смеси, а к «левой» – «левые». Этот эксперимент заставляет задуматься об истории хиральной чистоты: может быть, мир РНК сначала использовал левые и правые нуклеотиды в равной мере, а хиральная чистота возникла позже, с переходом к белкам? Авторы надеются в ближайшие пару лет сделать из этой лигазы кросс-хиральную полимеразу, которая будет строить из отдельных нуклеотидов свои зеркальные отражения. Посмотрим, что у них получится.

Итак, ни рибозимы-полимеразы, ни рибозимы-лигазы, известные на сегодняшний день, не обеспечивают устойчивого копирования РНК из доступных в окружающей среде древней Земли компонентов – отдельных нуклеотидов и их цепочек длиной до пяти-восьми звеньев. Чтобы запустить копирование, а следовательно, конкуренцию и естественный отбор, необходимы какие-то другие способы копирования РНК.

Самопроизвольное соединение активированных нуклеотидов, с которого мы начали эту главу, может происходить не только на глине, но и на однонитевых молекулах РНК, работающих в качестве матрицы. Достижения и проблемы в этой области обобщены в обзоре Джека Шостака (Szostak, 2012).

Еще в 1987 году было достигнуто неферментативное копирование РНК длиной 14 нуклеотидов. Использовались нуклеотид-метилимидазол-фосфаты и водный раствор с высокой концентрацией солей магния (Acevedo, Orgel, 1987).

В последующие годы это направление исследований было практически заброшено, так как ученые переключились на искусственный отбор рибозимов. Но в последние годы Джек Шостак вернулся к неферментативному копированию, причем с новыми идеями – он пытается проводить его внутри протоклеток, т. е. пузырьков, окруженных липидной мембраной. Недавно ученицей Шостака Катаржиной Адамалой было осуществлено копирование РНК внутри протоклеток (Adamala, Szostak, 2013).

Копирование РНК без помощи ферментов имеет много недостатков, которые нам знакомы по рибозимам-полимеразам:

• в конце копирования, как и у полимеразы, образуется устойчивая двунитевая РНК, которую надо как-то расплести для следующего цикла копирования;

• скорость и точность неферментативного копирования еще хуже, чем с рибозимами: ошибок – около 10 %, а на присоединение одного нуклеотида уходит более часа.

У неферментативного копирования есть и другие проблемы, которые не свойственны рибозимам-полимеразам:

• при копировании без ферментов связи между нуклеотидами образуются по-разному. Как в клеточных РНК, так и в продуктах рибозимов-полимераз, фосфатные мостики всегда связывают третий углеродный атом одного остатка рибозы с пятым атомом другого (3' – 5' – фосфодиэфирная связь, см. рис. 9.1). Без ферментов же наравне с 3' – 5' связями образуются неправильные 2' – 5' связи, и долго было непонятно, насколько это мешает появлению активных рибозимов;

• неферментативное копирование требует высокой концентрации магния, что приводит к постепенному разрушению как РНК-матрицы, так и активированных нуклеотидов. Нуклеотиды теряют фосфатные группы и превращаются в нуклеозиды, которые сами непригодны для построения цепи РНК и, хуже того, конкурируют с нуклеотидами за место на копируемой цепи РНК;

• нуклеозиды надо как-то убирать из среды, где происходит копирование РНК, или превращать их обратно в нуклеотиды;

• химические способы реактивации нуклеозидов опасны для РНК-матрицы.

По последним данным, не все эти проблемы действительно серьезны. Оказалось, что случайное чередование 3' – 5' и 2' – 5' связей не нарушает активность рибозимов по сравнению с чистыми 3' – 5' связанными РНК (Engelhart et al., 2013). Более того, примесь 2' – 5' связей снижает устойчивость двунитевой РНК и облегчает ее расплетание для повторного копирования. Так как доля 2' – 5' связей в копиях одной РНК-молекулы будет отличаться, то между ними возможно своего рода разделение труда: молекулы с большей долей 2' – 5' связей будут служить матрицами для дальнейшего копирования, а с меньшей – будут более стабильными рибозимами. Иначе говоря, даже в пределах РНК-мира за счет изменчивости связей между нуклеотидами возможно некоторое разделение на генетический материал и функциональные молекулы.

Проблемы, связанные с побочными реакциями ионов магния, удалось решить в упомянутой выше работе Адамалы и Шостака. Адамала пробовала разные вещества, которые образуют устойчивые комплексы с ионами магния, в надежде, что эти комплексы будут участвовать в одних реакциях, подобно свободным ионам магния, но не смогут участвовать в других. И оказалось, что цитрат (лимонная кислота) образует комплекс с магнием с нужными свойствами. Магний-цитратный комплекс катализирует образование РНК из активированных нуклеотидов, но не катализирует гидролиз (разрушение) РНК и отдельных нуклеотидов. Кроме того, магний-цитратный комплекс безопасен для липидных оболочек протоклеток, в отличие от обычных магниевых солей. В этих экспериментах использовались мембраны из жирных кислот, по свойствам близкие к обычному мылу. Как известно, мыло в жесткой воде (содержащей много кальция и магния) плохо мылится, т. е. не образует пузырьков, и это долго было препятствием к репликации РНК в протоклетках.

Все процессы соединения нуклеотидов в РНК очень чувствительны к концентрации нуклеотидов, которые в разбавленном растворе гораздо хуже соединяются в цепочки. К сожалению, все известные пути получения нуклеотидов, возможные в природных условиях, дают относительно разбавленные растворы продуктов. Было бы очень хорошо найти какой-нибудь эффективный механизм их концентрирования.

Как мы помним, возникновение жизни произошло на горячих источниках. В этом ландшафте возникают пересыхающие лужи, в которых могут накапливаться различные растворенные вещества, например формамид. К сожалению, для накопления нуклеотидов этот механизм не очень подходит: при испарении воды увеличивается концентрация всех растворенных веществ, включая минеральные соли, которых заведомо больше, чем нуклеотидов. Но, как оказалось, на тех же геотермальных полях есть механизмы концентрирования, которые отличают крупные молекулы нуклеотидов и РНК от растворенных минеральных солей. Для геотермальных полей характерны мелкопористые осадки и устойчивая разница температуры между горячей подземной водой и холодным воздухом. В этих условиях в порах и трещинах, заполненных водой, возникает устойчивая конвекция: поток жидкости и тепла. Благодаря конвекции и перепадам температур эти трещины становятся удобным местом концентрирования нуклеотидов и копирования РНК.

В работе Baaske et al. (2007) изучалось поведение нуклеотидов и РНК разной длины в поре, закрытой снизу и открытой сверху в холодную воду. При подогреве сбоку в такой поре происходят конвекция жидкости и перенос растворенных молекул вдоль градиента температуры (термофорез). Оказалось, что нуклеотиды и РНК в такой поре подсасываются из холодной воды и эффективно накапливаются в нижней части холодной стенки (рис. 9.4). Для поры шириной 1 мм и длиной 10 мм получается концентрирование нуклеотидов и коротких РНК в шесть-семь раз. Но степень концентрирования очень сильно (экспоненциально) зависит от отношения длины к ширине поры. Пора размером 0,1 мм × 10 мм или 1 мм × 100 мм концентрирует нуклеотиды примерно в 100 млн раз. РНК длиной примерно 40 нуклеотидов и более ведут себя по-другому по сравнению с одиночными нуклеотидами и короткими РНК. Они очень сильно концентрируются даже в коротких порах – в 20 000 раз в поре 1 мм × 10 мм для РНК длиной 100 нуклеотидов. Длинные молекулы РНК, попавшие в такую пору, практически неизбежно захватываются ею и накапливаются на маленьком (меньше 0,01 кв. мм) участке в нижней части холодной стенки. Концентрация РНК там ограничена только их физическими размерами.

Если в такой закрытой нагреваемой поре происходит еще и образование РНК из нуклеотидов (здесь неважно, идет ли речь о копировании существующей РНК или о случайной сборке), то конвекция, термофорез и накопление нуклеотидов очень способствуют образованию длинных РНК. В работе Маста с коллегами (Mast et al., 2013) было рассчитано, что в тепловой ловушке будут получаться РНК длиной 200–300 нуклеотидов безо всяких ферментов и рибозимов. К сожалению, по техническим причинам проверяли они эти расчеты не на полимеризации РНК из отдельных нуклеотидов, а на ДНК, и при этом еще не сборка отдельных нуклеотидов, а стыковка 95-нуклеотидных фрагментов ДНК при помощи одноцепочечных «липких концов». Такие видоизменения потребовались потому, что только к фрагментам ДНК такой длины возможно присоединить флуоресцентные метки, не мешающие полимеризации. Но зато благодаря таким меткам удалось в реальном времени и с высоким разрешением измерить накопление и полимеризацию ДНК на нижнем конце холодной стенки. И в точном соответствии с теорией получилось, что молекулы ДНК в этих условиях получаются в 10–20 раз длиннее, чем при любой одинаковой со всех сторон температуре.

В поре, открытой с обоих концов, поведение молекул несколько отличается. Если есть проток жидкости снизу вверх и нагрев с одной стороны, то в поре тоже происходят конвекция и термофорез. Молекулы РНК накапливаются на нижнем конце холодной стенки, но их поведение сильно зависит от длины. Нуклеотиды и короткие РНК слабее увлекаются термофорезом в нисходящий холодный поток и в итоге вымываются из поры с восходящим потоком, а РНК длиннее определенного порога (он зависит от скорости потока и размеров поры) накапливаются в ней. Это избирательное удержание длинных РНК может противостоять быстрому размножению коротких РНК и сохранять длинные молекулы в ряду поколений несмотря на то, что они копируются медленнее (Kreysing et al., 2015).

И в открытых, и в закрытых порах благодаря конвекции молекулы РНК последовательно попадают в горячие и холодные зоны. В горячей зоне двухцепочечная РНК может разделяться на одиночные цепи, которые смогут стать матрицами для следующего цикла копирования.

Изящное решение проблемы затравок было недавно предложено Александром Марковым (http://macroevolution.livejournal.com/170098.html). Оно состоит в том, что в условиях неферментативного копирования РНК преимущества получают те последовательности, которые могут служить затравками для синтеза собственных копий (рис. 9.5). Такими свойствами обладают палиндромные последовательности РНК. Палиндромами называли слова или фразы, которые читаются одинаково в обе стороны («А роза упала на лапу Азора»). В случае РНК и ДНК палиндромной последовательностью называют такую, которая читается одинаково слева направо и – после замены нуклеотидов на комплементарные – справа налево. Например, последовательность GGACCUAGGUCC будет палиндромом.

При случайном разрыве таких цепей РНК получаются короткие фрагменты, которые тоже могут служить затравками для удлинения своих родственников. В условиях неферментативного копирования РНК идея Маркова («Мир палиндромов») превращает необходимость затравок из проблемы в фактор естественного отбора, который начинается еще до появления первого активного рибозима, с молекулами РНК длиной 15–20 нуклеотидов. Причем низкая скорость неферментативного копирования здесь не страшна: достройка концов палиндромных РНК требует присоединения лишь 5–10 нуклеотидов за один цикл. Палиндромность первых РНК повышает вероятность появления рибозимов, так как палиндромные последовательности образуют множество шпилек (рис. 9.6).

Следы такого способа роста структур РНК до сих пор видны в древнейшем реликте РНК-мира – молекулах транспортных РНК (тРНК). Эти молекулы длиной 76 нуклеотидов имеют форму клеверного листочка. «Стебелек» и каждый из «листиков» трилистника включают двуспиральные участки РНК. Три «листика» образуют шпильки, а стебелек заканчивается свободными концами цепи РНК. В последовательности тРНК давно были обнаружены внутренние повторы, допускающие другие варианты укладки молекулы, например, в виде одной длинной двухцепочечной шпильки с несколькими внутренними петлями. На основе этих повторов были предложены модели роста тРНК путем увеличения количества палиндромных сегментов молекулы (Rodin et al., 2011; DiGiulio, 2009).

Если у нас есть механизм абиогенного копирования РНК, хотя бы только коротких и палиндромных молекул, то среди них могут оказаться РНК с какой-то рибозимной активностью. Строго говоря, не только лигаза и полимераза способны ускорить накопление своих копий в такой системе. Например, рибозимы-экзонуклеазы, разрушающие молекулы РНК, могут быть полезными для их точного и быстрого копирования. Экзонуклеазы работают в клетках вместе с полимеразами и служат для отрезания неправильно присоединенных нуклеотидов, повышая точность копирования. Рибозим с такой активностью мог бы повышать точность неферментативного копирования РНК и косвенно – скорость копирования, потому что после неправильно присоединенного нуклеотида (не образующего комплементарную пару с матрицей) следующий нуклеотид присоединяется намного медленнее обычного. Кроме того, для увеличения количества собственных копий рибозим может вообще воздействовать не на копирование РНК, а на предшествующие шаги – превращение простых органических веществ в нуклеотиды. Иначе говоря, появляется обмен веществ – химические реакции малых молекул, происходящие под контролем ферментов. В следующей главе мы подробнее рассмотрим, на что способны рибозимы в процессе обмена веществ.

Глава 10
Витамины, аминокислоты и пептиды в РНК-мире

Как только на Земле появляются молекулы РНК, которые как-то копируются, между ними начинается конкуренция. Одни молекулы РНК копируются быстрее, чем другие, и могут накапливаться в большем количестве. Любая новая особенность рибозима, повышающая вероятность его копирования, будет подхвачена естественным отбором.

В прошлой главе мы обсудили возможности и ограничения рибозимов-полимераз и лигаз, которые прямо участвуют в копировании РНК. Но это не единственные способы, которыми рибозим может влиять на количество своих копий и их эволюционную судьбу. Как справедливо замечено в обзоре Martin et al., 2015, путь от простой органики к РНК состоит из многих шагов, и ускорение любого из них при помощи рибозима будет выгодно для этого рибозима. Рибозимы в принципе могут как ускорять уже идущие реакции синтеза и активации нуклеотидов, например синтез Сазерленда, так и пускать в дело отходы и побочные продукты – свободные азотистые основания, рибозу и нуклеозиды, которые образуются при распаде РНК и нуклеотидов. Кроме того, если конкурирующие молекулы РНК находятся в лабиринте пор в минеральном осадке, то между соседями вероятно возникновение кооперации, когда каждый из них ускоряет копирование не только самого себя, но и молекул, находящихся рядом. В таком сообществе будет разделение труда, когда одни рибозимы копируют РНК, а другие занимаются производством нуклеотидов для них. Так появляется обмен веществ: химические реакции между малыми молекулами, проходящие под контролем соседних молекул; такие помощники-контроллеры получили название «ферменты».

Ресурсы, которые потребляет это сообщество РНК, можно рассортировать по сложности использования. Проще всего применять, конечно, готовые активированные нуклеотиды, такие как АТФ и ГТФ (гуанозинтрифосфат, у которого три фосфатные группы присоединены не к аденину, а к гуанину), – это одновременно и строительный материал для новой РНК, и источник энергии. Следующими после готовых активированных нуклеотидов будут нуклеотид-монофосфаты – готовые строительные блоки РНК, но без запаса энергии. Еще немного сложнее использовать нуклеозиды – чтобы пустить их в дело, надо добавить фосфатную группу. И нуклеотид-монофосфаты, и нуклеозиды неизбежно появлялись при распаде цепочек РНК.

Следующие по сложности использования ресурсы – отдельные азотистые основания и рибоза, образующиеся из цианида и формальдегида. Они должны быть правильно соединены друг с другом, чтобы получились нуклеозиды. Затем, когда и этот ресурс использован, можно было попытаться ускорить превращение гликольальдегида, глицеральдегида, формальдегида и цианистых соединений в нуклеотиды. Наконец, когда весь цианидно-формальдегидный дождь стал быстро и эффективно превращаться в РНК, в конкуренции начали выигрывать те химические системы (возможно, их уже допустимо называть живыми организмами), которые освоили восстановление углекислого газа и получили неисчерпаемый источник углерода.

Как только кончаются готовые активированные нуклеотиды – и строительный материал, и запас энергии «в одном флаконе», – нужно осваивать другие источники энергии. В условиях грязевых котлов их много. Например, летящие с вулканическими газами оксиды фосфора, растворяясь в воде, дают полифосфаты, которые легко использовать для активации нуклеотидов. Можно получать энергию, окисляя фосфиты и гипофосфиты, образующиеся из тех же вулканических оксидов фосфора. Можно как-то пристраиваться к фотохимическим реакциям на кристаллах сульфида цинка или пытаться улавливать солнечный свет своими силами. Мы не знаем, какие из этих источников энергии были освоены РНК-организмами раньше, но в итоге, скорее всего, они все так или иначе использовались.

В лабораториях идет поиск рибозимов, которые проводили бы все эти реакции. Например, правильное соединение рибозы и азотистых оснований в нуклеозиды, которое так долго не удавалось сымитировать в абиогенных условиях, рибозимам вполне по силам. Путем искусственной эволюции были получены рибозимы, которые соединяют активированную форму рибозы (5-фосфорибозил-1-пирофосфат) с азотистыми основаниями, производя нуклеозиды. В клетках фосфорибозил-пирофосфат тоже является ключевым промежуточным продуктом на пути к нуклеозидам. Рибозим A15 соединяет с рибозой урацил и цитозин, а рибозим МА – аденин и гуанин (рис. 10.1). Оба они ускоряют соответствующую реакцию в миллионы раз (Martin et al., 2015).

Активация нуклеозидов путем добавления к ним трех фосфатных групп катализируется рибозимом TPR1 размером 96 нуклеотидов. В качестве источника фосфора и энергии он использует триметафосфат, промежуточный продукт растворения оксида фосфора в воде, который доступен в грязевых котлах. В водно-формамидном растворе фосфорилирование нуклеозидов может происходить даже без помощи рибозимов. Нужен только самый обычный фосфатный минерал гидроксилапатит Ca₅(PO₄)₃OH, немного солей меди и нагревание до 80 °C. Медь используется для фосфорилирования нуклеозидов и в современных клетках, она входит в состав фермента пурин-нуклеозид-киназы.

Основной шаг, повторяемый в реакции Бутлерова, называется в химии «альдольная реакция» (рис. 10.2). Рибозимы, проводящие альдольную реакцию, тоже получены в эксперименте (Chen et al., 2007). Для превращения в катализаторы им необходимы ионы цинка, подобно их функциональным белковым аналогам – альдолазам класса II.

Для многих других химических реакций, нужных для производства нуклеотидов из простых молекул, возможностей чистой РНК недостаточно. Прежде всего, РНК неспособна к окислительно-восстановительным реакциям, следовательно, рибозимы не могут восстанавливать СО₂ и использовать энергию окисления неорганических веществ, таких как сера, железо и водород. Белки, состоящие из 20 разных аминокислот, могут проводить гораздо больше химических реакций, но и их возможности ограничены. Более половины ферментов для работы нуждаются в дополнительных веществах – коферментах и микроэлементах. Например, для проведения окислительно-восстановительных реакций в наборе из 20 аминокислот есть цистеин, который может легко и обратимо окисляться и восстанавливаться. Однако большинство ферментов окисления и восстановления нуждаются в дополнительных веществах. Это могут быть коферменты НАД (никотинамидадениндинуклеотид) и ФАД (флавинадениндинуклеотид), железосодержащий кофермент – гем, железосерные кластеры, молибденоптериновый комплекс и ряд более экзотических веществ.