Текст книги "Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал"

Глава 6. Трансформирующий фактор роста β в процессах взаимодействия гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vitro (соавт. д.м. н.
И.С. Брюховецкий, к.м. н. О.И. Пак, м.н. с. С.В. Зайцев)

Несмотря на огромные достижения современной науки, рак сохраняет ведущие места в списке причин смерти людей в большинстве стран мира. В структуре онкологических заболеваний особое место принадлежит мультиформной глиобластоме (МГБ) – одной из самых распространенных (Jawhari et al., 2013; Torre, 2015; Stupp et al., 2005) и агрессивных злокачественных опухолей мозга человека. Существующие методы лечения фактически неэффективны. При выполнении стандартного протокола (Stupp et al., 2014, 2017) комплексного лечения МГБ медиана выживаемости больных – 15 мес.

Резистентность к лечению связывают с опухолевыми стволовыми клетками (ОСК), занимающими ведущее место в иерархии клеток МГБ (Almeida et al., 2015) и обладающими рядом других уникальных характеристик (Pecchia et al., 2015; Lathia et al., 2015; Mann et al., 2018). Популяция ОСК гетерогенна, однако попытки поражения клеток МГБ, иммунопозитивных в отношении ведущих маркеров ОСК (Inocencio et al., 2018; Pecchia, 2015; Lathia, 2015; Gabrusiewicz et al., 2018) антигенов CD133, CD44, Sox2, Nanog, Oct4 и Stat3, к успеху в лечении не привели.

Инвазивный рост связан не с каким-то одним клоном ОСК, а с формированием инвазивного фенотипа клеток и особых условий микросреды, возникающих в ходе сложных межклеточных взаимодействий при участии ряда паракринных факторов (Brown et al., 2017; Wang et al., 2016; Bjerkvig et al., 2016; Frei et al., 2015; Iwadate et al., 2016), среди которых самое пристальное внимание уделяется трансформирующему фактору роста β (TGF-β).

Существуют разрозненные данные (Kaur et al., 2015; Goldenberg et al., 2012; Tsai et al., 2017; Kuroda et al., 2013) о способности TGF-β усиливать метастатическую и инвазивную активность глиом, однако лекарств и технологий для эффективного воздействия на эти процессы не существует. Одним из направлений их создания является реализация противоопухолевого потенциала нормальных гемопоэтических стволовых клеток.

Цель данного раздела – показать на модели глиобластомы in vitro роль трансформирующего ростового фактора β в процессах взаимодействия опухолевых и гемопоэтических стволовых клеток. Задачи настоящего раздела работы:

1) показать влияние TGF-β1 на клетки МГБ;

2) показать морфологические и ультраструктурные особенности клеток МГБ при стимуляции TGF-β1;

3) оценить влияние TGF-β1 на подвижность клеток МГБ;

4) описать закономерности взаимодействия ГСК с клетками МГБ, предобработанными TGF-β1.

Влияние TGF-β1 на клетки глиобластомы

В работе использована система высокоэффективной роботизированной количественной микроскопии в режиме реального времени.

Под воздействием TGF-β1 клетки глиобластомы распластывались по поверхности культурального планшета, приобретая очертания, существенно отличающиеся от клеток контрольной культуры (рис. 58).

Рис. 58.⠀Воздействие 10 нг/мл TGF-β1 на клетки линии U-87 глиобластомы человека. А – контрольная группа; Б – клетки, стимулированные TGF-β1. Окраска Red CMPTX (λ = 546 нм), флуоресцентная лазерная микроскопия, масштаб 400 мкм. В—Г – панорамная реконструкция культуры клеток линии U-87 глиобластомы до (В) и после (Г) стимуляции TGF-β1. Изображение в проходящем свете. Масштаб 400 мкм

При проведении исследования был сделан акцент на работу с живыми клетками, под которыми понималась итоговая сумма распознанных системой Cell-IQ образов клеток в состоянии интерфазы и митоза. При распознавании образов под пролиферирующими клетками обозначались элементы, имеющие отчетливые признаки открепления от субстрата, увеличение объема ядра и клетки в целом, с округлыми контурами клеточной мембраны, светлой цитоплазмой, с отсутствием патологических включений и другими признаками ранней профазы, а также клетки в митозе.

Как следует из эксперимента, в концентрации 10 нг/мл TGF-β1 снижал темпы пролиферации клеток глиобластомы (рис. 59).

Рис. 59.⠀Влияние 10 нг/мл TGF-β1 на клетки линии U-87 глиобластомы (ANOVA; m = 2; n = 20; α = 0,05)

Морфологические (ультраструктурные) особенности клеток линии U-87 глиобластомы после стимуляции TGF-β1

Под воздействием 10 нг/мл TGF-β1 клетки распластывались по плоской поверхности культурального планшета и приобретали фибробластоподобную форму (рис. 60). Клетки глиобластомы в контрольной культуре сохраняли типичную веретеновидную или полигональную форму.

По данным электронной микроскопии, в клетках контрольной культуры глиобластомы визуализировались крупные ядра различной формы и величины с диспергированным хроматином и хорошо конструированным ядрышком (рис. 61 А).

Рис. 60.⠀Клетки глиобластомы линии U-87. А – контрольная культура; Б – стимуляция 10 нг/мл TGF-β1. Микроскопия высокого разрешения

Цитоплазма содержала обширные поля специфического материала с низкой электронной плотностью и дисперсным распределением компонентов, напоминающих углеводные включения в цитоплазме простейших, рядом с которыми располагались округлые объекты, похожие на липидные капли. Соприкасаясь, поверхности клеток формировали адгезивные контакты и контактные пояски (рис. 61 Б) с распределенным между ними рыхлым аморфным матриксом.

В некоторых местах формировались обширные зоны слипания клеток с образованием интердигитаций в виде плотного прилегания клеточных мембран, поверхность которых в некоторых местах растворялась (рис. 61 В, указаны стрелками), образуя участки цитоплазматического слияния, заполненного гомогенным содержимым. Подобные контакты предполагают не только возможность свободного обмена макромолекулами, но и возможное обобществление внутриклеточных органелл. Участки слияния мембран между взаимодействующими клетками (рис. 61 Г) сочетались с формированием специфических контактных мостиков (рис. 61 Д) и протяженных микротрубок, соединяющих между собой распластавшиеся неопластические клетки в сложно организованную структуру (рис. 61 Е).

При стимуляции клеток линии U-87 глиобластомы TGF-β1 обращали на себя внимание резкое уменьшение или полное исчезновение специфических включений в цитоплазме, напоминающих углеводные поля, уменьшение числа липидных включений (рис. 62 А) и уменьшение числа межклеточных контактов (рис. 62 Б), что может свидетельствовать об изменении интенсивности внешнесекреторной функции клеток и их условий взаимодействия.

Рис. 61.⠀Клетки линии U-87 глиобластомы человека, просвечивающая электронная микроскопия. А – клетка с крупным ядром и хорошо конструированным ядрышком и включения электронноплотного материала в цитоплазме; Б – адгезивные межклеточные контакты; В, Г – участок цитоплазматического слияния между клетками глиобластомы; Д, Е – контактные мостики между взаимодействующими клетками

Рис. 62.⠀Количество внутриклеточных липидных включений (А) и межклеточных контактов (Б) при стимуляции клеток глиобластомы TGF-β1. * – p <0,05; критерий Стьюдента. По вертикальной оси – число внутрицитоплазматических включений (А) и межклеточных контактов (Б) в поле зрения

Влияние TGF-β1 на подвижность клеток глиобластомы

Стимуляция 10 нг/мл TGF-β1 сопровождалась резким снижением времени «зарастания царапины» (рис. 63) в клеточном монослое до 27 ч против 45 ч в контроле, что на фоне снижения динамики роста указывало на возросшую подвижность клеток глиобластомы (рис. 64).

Рис. 63.⠀Анализ миграции клеток в зону царапины в клеточном монослое (scratch-wound assay) с использованием высокоэффективной количественной роботизированной микроскопии в реальном времени. А, В, Д – клетки контрольной культуры глиобластомы. Полное «зарастание царапины» наблюдается через 45 ч после начала эксперимента; Б, Г, Е – клетки глиобластомы, культивируемые в среде с содержанием 10 нг/мл TGF-β1. Полное «зарастание царапины» наблюдается через 27 ч с момента начала исследования

Рис. 64.⠀Результаты анализа миграционной активности клеток линии U-87 глиобластомы в зону «царапины» в клеточном монослое; p <0,05; критерий Стьюдента

Закономерности взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы, предобработанными TGF-β1 in vitro

Исследование состояло из 2 частей:

1) изучение общих закономерностей взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы, предобработанными TGF-β1;

2) разработка методов повышения эффективности такого взаимодействия.

Изучение общих закономерностей взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы, предобработанными TGF-β1

Для проведения исследования сформирована контрольная культура клеток линии U-87 глиобластомы человека и культура клеток линии U-87 глиобластомы, предобработанных 10 нг/мл TGF-β1. При проведении эксперимента клетки глиобластомы человека культивировали совместно с ГСК костного мозга человека (рис. 65).

Рис. 65.⠀Клеточные культуры, использованные в эксперименте in vitro, 48 ч. Клетки глиобластомы окрашены Red CMTPX (λ = 546 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 577⁄602 нм, красный). Флуоресцентная лазерная микроскопия. А – клетки глиобластомы, контроль; Б – ГСК, контроль, окраска Vybrant® CFDA SE (λ = 488 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 492⁄517 нм, зеленый); В – сочетанная культура ГСК с опухолевыми клетками контрольной группы; Г – сочетанная культура ГСК с опухолевыми клетками агрессивного фенотипа

Спустя 48 ч в обеих сочетанных культурах на фоне флуоресценции опухолевых клеток, окрашенных Red CMTPX (λ = 546 нм – красная метка), и адгезировавших к ним ГСК, окрашенных СFDA (λ = 488 нм – зеленая метка), стали появляться зеленые флуоресцентные объекты существенно меньшего диаметра, локализованные как на поверхности, так и, вероятно, внутри клеток глиобластомы (рис. 66).

Рис. 66.⠀Сочетанная культура клеток глиобластомы и ГСК. Нормальные ГСК, окраска Vybrant® CFDA SE (λ = 488 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 492⁄517 нм, зеленый). Клетки глиобластомы окрашены Red CMTPX (λ = 546 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 577⁄602 нм, красный). Флуоресцентная лазерная микроскопия, х400. А, В – клетки глиобластомы линии U-87 контрольной группы в сочетанной культуре с ГСК; Б, Г – клетки глиобластомы агрессивного фенотипа линии U-87 в сочетанной культуре с ГСК; А, Б – флуоресценция в зеленом спектре. Стрелками указаны клетки, участвующие в обмене флуоресцентной метки

Через 72 ч в спектре свечения ГСК, адгезировавших к клеткам глиобластомы, начинали преобладать желтые тона (рис. 67, что указывает на пересечение спектров флуоресцентного сигнала, красителей СFDA (λ = 488 нм) и Red CMTPX (λ = 546 нм).

Рис. 67.⠀Сокультура клеток глиобластомы и ГСК. Нормальные ГСК окрашены Vybrant® CFDA SE (λ = 488 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 492⁄517 нм, зеленый), клетки глиобластомы окрашены Red CMTPX (λ = 546 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 577⁄602 нм, красный). Флуоресцентная лазерная микроскопия, 72 ч эксперимента. А – контроль клеток глиобластомы; Б – клетки глиобластомы агрессивного фенотипа линии U-87; В – клетки глиобластомы линии U-87 контрольной группы в сочетанной культуре с ГСК; Г – клетки глиобластомы агрессивного фенотипа линии U-87 в сочетанной культуре с ГСК

TGF-β1 оказывал влияние как на форму отдельных клеток глиобластомы, так и на архитектуру клеточного монослоя, которая под воздействием фактора формировала ячеистую структуру, образованную крупными распластанными конгломератами, состоящими из клеток различной формы. Контрольная культура характеризовалась немногочисленным хаотичным образованием конгломератов округлой формы, сформированных веретеновидными клетками.

Сокультивирование предобработанных TGF-β1 клеток глиобластомы с ГСК приводило к формированию многочисленных плотных конгломератов опухолевых клеток, окруженных ГСК (рис. 68).

Рис. 68.⠀Сокультура клеток глиобластомы и ГСК. Панорамные снимки, состоящие из 9 фотографий, х200. ГСК окрашены Vybrant® CFDA SE (λ = 488, эксцизия ⁄ эмиссия 492⁄517 нм, зеленый), клетки глиобластомы окрашены Red CMTPX (λ = 546 нм, эксцизия ⁄ эмиссия 577⁄602 нм, красный). 72 ч эксперимента. Флуоресцентная лазерная микроскопия. А – контроль клеток глиобластомы; Б – клетки линии U-87 глиобластомы, предобработанные TGF-β1; В – клетки глиобластомы линии U-87 контрольной группы в сочетанной культуре с ГСК; Г – клетки глиобластомы агрессивного фенотипа линии U-87 в сочетанной культуре с ГСК

По данным проточной цитофлуориметрии, с начала эксперимента отмечено формирование 2 монохромных популяций клеток, окрашенных флуоресцентными красителями (рис. 69). С увеличением времени наблюдения число дубль-позитивных клеток в сочетанной культуре остается постоянным. Спустя 72 ч наблюдений количество дубль-позитивных клеток в контрольной сокультуре составляло 93,5 ± 11,7%, в сокультуре сравнения – 94,6 ± 12,2%.

Рис. 69.⠀Гистограммы распределения клеток в сокультуре глиобластомы, окрашенных красным флуоресцентным красителем с ГСК, окрашенными зеленым флуоресцентным красителем, по данным цитофлуориметрии. А – 24 ч; Б – 48 ч; В – 72 ч; Г – 96 ч. А1, Б1, В1, Г1 – клетки ГСК, окрашенные CellTracker™ Red CMTPX; А2, Б2, В2, Г2 – клетки глиобластомы, окрашенные CFDA SE; А3, Б3, В3, Г3 – сокультура клеток глиобластомы U-87 с ГСК; А4, Б4, В4, Г4 – сокультура клеток глиобластомы U-87 с ГСК в присутствии TGF-β1

Как следует из эксперимента, CD34⁺CD45⁺-клетки взаимодействуют с клетками глиобластомы и обмениваются с ними флуоресцентной меткой. Обработка опухолевых клеток TGF-β1 не влияет на этот процесс, следовательно, не снижает способности к координированному межклеточному взаимодействию.

Взаимодействие ГСК c клетками глиобластомы, стимулированными 10 нг/мл TGF-β1, сопровождалось усилением темпа пролиферации опухолевых клеток до значений, сопоставимых с контрольной группой (рис. 70).

Рис. 70.⠀Динамика роста клеток глиобластомы линии U-87 в сокультуре с ГСК. Продолжительность эксперимента 120 ч. Family-wise error rate <p = 0,01 <α = 0,05/4 vs. control

Однако выявлено изменение архитектуры клеточного монослоя и темпов пролиферации опухолевых клеток под воздействием фактора в сокультуре с ГСК, что может свидетельствовать об изменении взаимодействия опухолевых клеток агрессивного фенотипа с внеклеточным матриксом в присутствии ГСК.

Разработка методов повышения эффективности взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы, предобработанными TGF-β1 in vitro

Для проведения эксперимента сформированы 2 образца, содержащие 10⁴ мононуклеарных клеток человека, 4,5% которых были иммунопозитивны к антигену СD34, что позволяет считать их ГСК. Первый образец был контрольным; второй образец 24 ч инкубировали в конденционированной среде DMEM, полученной после культивирования клеток глиобластомы (t = 37° C) и содержащей 0,01 нг/мл человеческого интерферона-γ (кат. № I3265, Sigma-Aldrich) и 100 нг/мл липополисахарида Escherichia coli (кат. № O111:B4, Sigma-Aldrich). Далее контрольные и манипулированные клетки вносили в культуру клеток глиобластомы, предварительно предобработанных TGF-β1 (10 нг/мл) в соотношении 1:1. Оценивали скорость пролиферации опухолевых клеток и скорость «зарастания царапины» в клеточном монослое (рис. 71).

Рис. 71.⠀Скорость пролиферации опухолевых клеток in vitro (А) и время «зарастания царапины» в клеточном монослое (Б) при сокультивировании контрольных и манипулированных ГСК с клетками глиобластомы, предобработанными TGF-β1

Таким образом, мононуклеарные CD45⁺-клетки костного мозга, обогащенные ГСК, взаимодействуют с клетками глиобластомы и обмениваются с ними флуоресцентной меткой. Обработка опухолевых клеток TGF-β1 не влияет на этот процесс и не снижает способности к координированному межклеточному взаимодействию. Взаимодействие ГСК c клетками глиобластомы, стимулированными 10 нг/мл TGF-β1, сопровождалось усилением темпа пролиферации опухолевых клеток до значений, сопоставимых с контрольной группой. Предварительная провоспалительная модификация повышает противоопухолевый потенциал ГСК, что проявляется снижением темпов пролиферации клеток глиобластомы и уменьшением их подвижности.

Глава 7. Трансформирующий фактор роста β в процессах взаимодействия гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток in vivo (соавт. д.м. н.
И.С. Брюховецкий, к.м. н. О.И. Пак,
м.н. с. С.В. Зайцев)

Материалы и методы проведения исследования

Эксперимент выполнен на животных c перевитой глиальной опухолью головного мозга. Животные были разделены на 5 групп:

I) контрольная группа (n = 60);

II) группа крыс (n = 30), получавших гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) для иммобилизации рекрутирования мононуклеарных CD45⁺ костного мозга в системный кровоток (группа «Г-КСФ»);

III) группа крыс (n = 30), получивших провоспалительную терапию для запуска системной воспалительной реакции путем введения бактериального липополисахарида (LPS) и интерферона-γ (IFNγ) (группа proinflamation therapy, PT);

IV) крысы (n = 30), получившие стимуляцию Г-КСФ, c последующей провоспалительной терапией (группа «Г-КСФ+PT»).

Провоспалительная терапия. Для запуска системной воспалительной реакции в течение 7 дней получали внутрибрюшинно 0,5 мл смеси, содержащей липополисахарид E.coli 0,5 мг/кг (серотип O111:B4, кат. № L2630б Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, США), и 5 мг рекомбинантного крысиного интерферона-γ (кат. № I3275 Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, US).

Морфологическое исследование. Ткань мозга крысы получали после декапитации животных. Материал разделяли на 2 части: одну часть материала использовали для проведения морфологического и иммуногистохимического исследования, вторую часть – для оценки содержания цитокинов в ткани мозга по описанной ниже методике. Материал для морфологического и иммуногистохимического исследований фиксировали (4% ПФА) в течение 12 ч с последующей промывкой PBS. Парафиновые срезы головного мозга толщиной 7 мкм депарафинировали и окрашивали гематоксилин-эозином по стандартной методике. Все использованные реагенты – производства компании Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, США).

Иммуногистохимическое исследование. Исследование выполнено по стандартной методике. Первичные антитела против микроглия (макрофаг) -специфического белка IBA1 (ab107159) пролиферирующих клеток ядерного антигена PCNA (ab 29) и мембранного белка антиген-представляющих клеток CD86 (ab213044) использованы в соответствии с инструкциями производителя – компании Аbcam (США). Вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена PI-1000 (anti-rabbit), PI-2000 (anti-mouse), использовали в соответствии с инструкциями производителя – компании Vector Laboratories. Для иммунопероксидазной реакции использовали хромоген NovaRED Substrate Kit (Vector Laboratories; SK-4800). Срезы отмывали 0,1 М PBS, обезвоживали, заключали в бальзам и изучали, используя AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия).

Иммуноферментный анализ. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) ткани мозга на содержание IL-1 (ab100768), IL-10 (ab100765), TNF-α (ab100747) и TGF-β1 (ab119558) выполнен с использованием коммерческих наборов фирмы Аbcam (США). Мозг крыс извлекали и немедленно замораживали в жидком азоте при —70 ºС. Для анализа брали ткань глиомы с захватом вещества мозга в пределах 5 мм от края. Гомогенаты ткани готовили с использованием буфера: сахароза 0,25 М, Трис-HCl 0,01 М, ЭДТА 0,001 М, HEPES 0,01 М. Все реагенты – производства компании Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, США). Лизирующий буфер добавляли из расчета 5 мл/мг ткани, проводили гомогенизацию ткани, центрифугирование и отбор надосадочной жидкости для анализа. Содержание белка определяли с использованием коммерческого набора Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Определение оптической плотности производили при длине волны 450 нм на планшетном спектрофотометре (BioRad xMark).

Результаты

Имплантация клеток глиомы приводила формированию опухоли, что сопровождалось отеком и деформацией мозговых структур, сглаженностью основных борозд и извилин. На 14-й день наблюдений ткань глиомы была представлена скоплением клеток, формирующих многочисленные кровеносные сосуды (рис. 24 А—Г), вокруг которых (рис. 24 Д) клетки глиомы формировали плотные конгломераты в виде «розеток», ограниченных на периферии очагами некроза (рис. 24 Е). К 28-му дню основное место в картине глиомы занимали обширные зоны некроза (рис. 25 А—Г), содержавшие запустевшие микрососуды и немногочисленные клеточные элементы.

К 14-му дню наблюдений опухоль характеризовалась высокими темпами пролиферации. PCNA⁺-клетки (рис. 32 А—Г) были сосредоточены в опухоли и равномерно распределены в прилежащем веществе мозга, где формировали сателлитные очаги, окруженные плотными скоплениями (рис. 38) GFAP⁺-клеток звездчатой формы с многочисленными отростками. В свою очередь, скопления клеток, иммунореактивных в отношении микроглия (макрофаг) -специфического белка IBA1, выявлялись как в ткани опухоли, так и в прилежащем веществе мозга (рис. 35).

К 28-му дню наблюдений отмечено резкое снижение темпа пролиферативных процессов, при этом архитектура реакции астроцитарной глии не претерпела значимых изменений. Количество IBA1⁺-клеток в области опухолевого узла уменьшалось, образуя уплотнения вдоль границ опухолевого очага (рис. 36 А—В). Снижение темпов пролиферации и числа клеток микроглии на фоне интенсивных процессов некроза в центре опухолевого узла к 28-му дню эксперимента сопровождалось увеличением содержания TGF-β1 в мозговой ткани (рис. 72). В свете сказанного срок 28 дней был выбран нами в качестве контрольной точки эксперимента.

Рис. 72.⠀Динамика морфологических и иммуногистохимических трансформаций опухолевой ткани в мозге крыс контрольной группы с 14 на 28 сут. эксперимента. А – рост площади некрозов; Б – уменьшение числа пролиферирующих клеток в единице площади препарата; В – уменьшение площади окрашивания антителами против белка микроглии IBA1; Г – увеличение синтеза TGF-β1

Стимуляция Г-КСФ крыс II и IV групп с 20-го по 27-й день сопровождалась увеличением доли CD45⁺-клеток в общем числе лимфоцитов, рекрутированных в кровеносное русло. При этом среди клеток костного мозга, иммунопозитивных в отношении мембранного антигена CD45, количество HSC-like cells (ГСК-подобные клетки) к 7 сут. эксперимента критически возросло.

На 28-й день эксперимента у этих животных отмечено значимое увеличение числа PCNA⁺-клеток в опухоли по сравнению с контролем и группой крыс, получавших только PT (группа III). Некоторое усиление пролиферации сочеталось с увеличением площади окрашивания узла глиомы антителами против белка микроглии (макрофагов) IBA1 (рис. 73).

Рис. 73.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс с глиомой С6. Окраска антителами против белка микроглии (макрофагов) IBA1. А, Б – группа II, только стимуляция Г-КСФ; B, Г – группа III, только провоспалительная терапия IFNγ + ЛПС; Д, Е – группа IV, стимуляция Г-КСФ + IFNγ + ЛПС.

К 28-му дню наблюдений опухолевой ткани крыс группы II, получивших только стимуляцию костного мозга Г-КСФ, возрастала плотность группировки IBA1⁺-клеток как в опухолевой ткани, так и в прилежащем к ней веществе мозга. В противовес распластанной, звездчатой или кляксообразной форме IBA⁺-клеток (рис. 73 А), наблюдаемых на 14-й день эксперимента в прилежащей ткани мозга, на 28-й день мы наблюдали IBA1⁺-клетки округлой формы с очень короткими отростками. Картину, аналогичную описанной выше, мы наблюдали как у животных III группы, получивших только провоспалительную терапию, так и у крыс IV группы, получивших Г-КСФ + IFNγ + ЛПС. Принципиальным отличием было только существенно большее количество клеток микроглии в опухолевой ткани крыс IV группы (рис. 74).

Рис. 74.⠀Динамика морфологических и иммуногистохимических трансформаций опухолевой ткани в мозге крыс сравниваемых групп на 28 сут. эксперимента. А – увеличение числа пролиферирующих клеток и площади окрашивания антителами против IBA⁺-клеток микроглии (Б) у крыс II и IV групп; B – уменьшение числа клеток CD86⁺ и уменьшение числа СD206⁺-элементов.

Исключительно важно, что увеличение количества клеток микроглии в опухолевой ткани и веществе мозга, непосредственно прилежащем к опухолевому очагу, у животных II—IV групп сопровождалось поляризацией популяции микроглиоцитов и увеличением в их составе клеток, иммунореактивных в отношении антигена CD86, к 28-му дню эксперимента (рис. 74 В, 75).

Рис. 75.⠀Опухолевая ткань в мозге крыс с глиомой С6, окраска антителами против CD86 (M1-тип). А, Б – группа I, контроль; В, Г – группа II, стимуляция Г-КСФ; Д, Е – группа III, только провоспалительная терапия IFNγ + ЛПС; Ж, З – группа IV, стимуляция Г-КСФ + IFNγ + ЛПС. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином.

Рис. 76.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс с глиомой С6, I контрольная группа. Окраска антителами против антигена CD206 – маннозного рецептора С, тип 1, продукта гена MRC1 (противовоспалительный М2-тип). А – край опухоли с прилежащей тканью мозга, 14 сут.; Б – центр опухолевого узла, 14 сут.; B – край опухоли с прилежащей тканью мозга, 28 сут.; Г – центр опухолевого узла, 28 сут. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

Количество CD86-иммунореактивных элементов в опухоли и прилежащей к ней ткани мозга у животных I контрольной группы уменьшалось к 28-му дню эксперимента (В, А, Б). Они были локализованы среди дистрофически измененного мозгового вещества, усеянного неопластическими клетками. В группах II и IV наблюдалась обратная динамика: количество CD86⁺-клеток возрастало, более того, отмечалась тенденция к их группировке на границе опухолевой ткани, преимущественно в зоне инвазии, что совпадало с участками преимущественной локализации мигрировавших сюда мононуклеарных СD45⁺-клеток костного мозга.

У животных III группы, получавших провоспалительную терапию (Е), и у животных IV группы, где введение Г-КСФ сочеталось с провоспалительной стимуляцией (рис. 75 З), CD86⁺-элементы были представлены клетками звездчатой или полигональной формы, с крупным телом и короткими отростками, контактирующими друг с другом.

Напротив, клетки, иммунопозитивные в отношении первого типа маннозного рецептора С – антигена СD206, указывающего на принадлежность макрофагов к М2-фенотипу, в большом количестве выявлялись в опухоли и прилежащей к опухолевому очагу ткани мозга у крыс контрольной группы как на 14-й, так и на 28-й день наблюдения (рис. 74 Г, 76, 77). Их количество несколько снижалось у крыс II группы, получавших Г-КСФ, и группы III, получивших провоспалительную терапию, и было минимальным в группе IV.

Рис. 77.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс с глиомой С6, 28 сут. эксперимента. Окраска антителами против антигена CD206 – маннозного рецептора С, тип 1, продукта гена MRC1 (противовоспалительный М2-тип). А, Б – группа II, стимуляция Г-КСФ; В, Г – группа III, провоспалительная терапия IFN-γ + ЛПС; Д, Е – группа IV, стимуляция Г-КСФ + IFNγ + ЛПС. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

Иммуноферментный анализ выявил значительные различия в уровне ключевых про– и противовоспалительных цитокинов у крыс экспериментальных групп. К 28-му дню эксперимента у крыс контрольной группы содержание противовоспалительных цитокинов TGF-β1 и IL-10 в опухоли и прилежащей ткани мозга было максимальным (рис. 78 А, Б). В группах II (Г-КСФ) и III (PT) содержание этих цитокинов достоверно снижалось и достигало минимума у крыс группы IV (Г-КСФ + PT). Подобный эффект сопровождался резким повышением содержания провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-1 у животных этой группы (рис. 78 В, Г).

Рис. 78.⠀Результаты иммуноферментного анализа опухолевой ткани на содержание противовоспалительных и провоспалительных цитокинов: А – TGF-β1; Б – интерлейкин-10; В – TNF-α; Г – интерлейкин-1. Результаты представлены в виде М ± s.e.m. * – различия между группами по сравнению с контрольной группой (группа I) считались достоверными с p <0,05. Результаты представлены в виде M ± s.e.m. Тест Стьюдента использован для парных образцов

Провоспалительная модификация неопластического очага сопровождалась значимым изменением морфологической картины неопластического процесса, что было особенно заметно при окраске опухолевой ткани антителами против одного из ключевых маркеров эпителиально-мезенхимального перехода – виментина. У крыс I (контрольной) группы виментин-позитивные клетки активно выявлялись в опухолевой ткани (рис. 79).

Рис. 79.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс с глиомой С6, контрольная группа. Окраска антителами против маркера эпителиально-мезенхимального перехода виментина. А, Б – край опухоли с прилежащей тканью мозга, 14 сут.; В, Г – край опухоли с прилежащей тканью мозга, 28 сут. Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

К 14 нед. эксперимента у крыс контрольной группы клетки, продуцирующие виментин, были локализованы вдоль границ опухоли (рис. 79 А), откуда многочисленные виментин-позитивные клетки звездчатой и полигональной формы вторгались в вещество мозга (рис. 79 Б), образуя скопления клеточных элементов. К 28 нед. эксперимента у крыс контрольной группы группировка виментин-позитивных клеток становилась более плотной, клетки округлой и звездчатой формы локализовались в участках мозга, прилежащих к опухоли (рис. 79 В—Г), из которой вторгались в мозговое вещество. Картина инвазивного неопластического процесса у животных II—IV групп к 28-му дню наблюдений обнаруживала существенные отличия от контроля (рис. 80).

К 28-му дню наблюдений у всех животных II—IV групп отмечено снижение плотности группировки виментин-позитивных элементов в участках мозга, примыкающих к опухоли. У крыс группы II (Г-КСФ) островковые скопления виментин-позитивных клеток (рис. 80 А, Б) были сосредоточены в прилежащей к опухоли ткани мозга, однако у животных III (IFNγ + ЛПС) и IV (Г-КСФ + IFNγ + ЛПС) групп виментин-позитивные клетки в прилежащей к опухоли ткани мозга встречались существенно реже, при этом граница опухоли становилась более четкой (рис. 80 Д, Е).

Рис. 80.⠀Неопластическая ткань в мозге крыс с глиомой С6, 28е сут. Окраска антителами против маркера эпителиально-мезенхимального перехода виментина. А, Б – край опухоли с прилежащей тканью мозга, группа II (Г-КСФ); В, Г – край опухоли с прилежащей тканью мозга, группа III (INFγ + ЛПС); Д, Е – край опухоли с прилежащей тканью мозга, группа IV (Г-КСФ + INFγ + ЛПС). Дополнительная окраска гематоксилин-эозином

Животные всех экспериментальных групп показали повышение показателей выживаемости по сравнению с контрольной группой, однако наилучшие показатели были зарегистрированы у крыс группы IV (Г-КСФ + PT) (1).

Рис. 81.⠀Кривые выживаемости экспериментальных животных по Каплану – Мейеру. Зеленый маркер – группа I (контроль); синий маркер – группа II (Г-КСФ); желтый маркер – группа III (PT); красный маркер – группа IV (Г-КСФ + PT)