Текст книги "Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал"

Рис. 82. Молекулярно-биологическая характеристика протеома CD133⁺ ОСК линии U-87 MG глиобластомы человека. А – локализация; Б – отношение к биологическим процессам; B – функциональный класс; Г – биологическая активность идентифицированных белков

Биоинформационный анализ установил принадлежность 136 дифференциально экспрессированных белков ОСК к 15 сигнальным путям (табл. 4).

Среди белков, усиливающих уровень синтеза более чем в 2 раза в ОСК по сравнению с ДКГ, выявлено 100 белков, среди которых 14 белков сигнального пути рецепторного взаимодействия (РВ) с ВКМ, 16 белков сигнального пути фокальной адгезии, 12 белков сигнального пути гликолиза (гликонеогенеза) и 12 белков сигнального пути Wnt. Учитывая особую роль сигнальных механизмов взаимодействия с ВКМ в биологии стволовых клеток всех типов, при проведении прецизионного биоинформационного анализа мы решили сосредоточиться на этих механизмах.

Сигнальный путь РВ-ВКМ является частью сложного сигнального пути фокальной адгезии (табл. 5, 6).

* Данные представлены в нормализованных масс-спектрометрических единицах.

Представляется исключительно важным, что значительная часть белков сигнального пути фокальной адгезии являются компонентами тотально апрегулированного сигнального пути РВ-ВКМ (табл. 5). При этом среди белков, усиливших уровень синтеза в ОСК по сравнению с ДКГ более чем в 2 раза, уровень синтеза коллагена-VIα1 (COL6A1) и ламинина-β1 (LAMB1) был увеличен в 8 раз (табл. 6).

* Данные представлены в нормализованных масс-спектрометрических единицах.

Итак, гиперэкспрессия белков сигнального пути РВ-ВКМ – важнейшая характеристика протеома ОСК ГБ. Представляется еще более важным, что такая картина сочетается с усилением синтеза белков сигнального пути гликолиза (гликонеогенеза), обеспечивающего выживание клеток в условиях гипоксии, и Wnt-сигнального пути, ключевого эмбрионального механизма регуляции дифференцировочного потенциала мультипотентных клеток всех типов. Допустимо предположить, что если дифференцировочный потенциал появляется у клетки в условиях жесткого гипоксического прекондиционирования, то и вектор реализации такого потенциала определяется именно фактором гипоксии. В этой связи гиперэкспрессия белков сигнального пути РВ-ВКМ является особо важным условием, позволяющим ОСК установить продуктивные взаимоотношения с ВКМ, а следовательно, выжить.

Огромное значение в этом вопросе принадлежит иммуносупрессивным цитокинам. В этой связи нами изучены характеристики протеомного профиля ДКГ при стимуляции одним из ведущих иммуносупрессивных цитокинов – TGF-β1, при этом протеомные карты ДКГ, предобработанных TGF-β1, сопоставлены с ОСК.

Сравнительный анализ ключевых параметров протеома ОСК и ДКГ, обработанных TGF-β1

Опухолевые клетки в количестве 50 тыс. засевали в лунку 6-луночной плашки и культивировали при 37° C, 5% СО₂ до достижения 30% конфлюэнтности в среде DMEM/F12, содержащей 10% FBS, 1% 200 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES. Затем клетки промывали раствором НBSS и переводили на бессывороточную среду DMEM/F12 с добавлением TGF-β1 в концентрации 5 нг/мл на 72 ч. Клетки монослойной культуры снимали и осаждали центрифугированием (1500 об./мин. в течение 10 мин.), супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 3 мл PBS (рН 7,4). Промывку клеток PBS повторяли еще 2 раза.

Протеомный анализ ДКГ, стимулированных TGF-β, идентифицировал 2400 белков, из которых 2197 протеинов детектировались во всех клеточных лизатах: 40 белков выявлено только в контрольных DGCs, 163 белка – только в клетках, предобработанных TGF-β1. Среди идентифицированных белков при стимуляции TGF-β1 только 610 значимо (p <0,05) изменили уровень синтеза: 488 усиливали, 122 снижали.

Среди белков, значимо изменивших экспрессию в ДКГ, обработанных TGF-β1, идентифицированы маркеры эпителиально-мезенхимального перехода: Е-кадгерин (CDH1), оклюдин (OCLN), клаудин-1 (CLDN1). Среди апрегулированных белков выявлены N-кадгерин (CDH2), виментин (VIM), витронектин (VTN), компоненты актин-миозинового комплекса и матриксные металлопротеиназы MMP2, MMP9, MMP14, ADAMTS1 (табл. 7).

* Стрелки указывают на белки, которые полностью исчезают (↓) или появляются впервые (↑) после стимуляции TGF-β1.

Биоинформационный анализ выявил 19 белков сигнального пути рецепторного взаимодействия с ВКМ, из которых 13 белков: гликопротеин CD44, гиалуронан-опосредованный рецептор клеточной подвижности (HMMR), коллагены I (COL1A2), VIα1 (COL6A1) и VIα3 (COL6A3), фибронектин (FN1), ламинины β1 (LAMB1) и γ1 (LAMC1), ингегрины α2 (ITGA2), α5 (ITGA5), αV (ITGAV), β1 (ITGB1) и β3 (ITGB3); а также 3 белка, активирующих этот сигнальный каскад: киндлин-2 (fermitin family homolog 2, FERMT2), лизил-оксидаза 2 (lysyl oxidase homolog 2, LOXL2), диацетилаза гистонов 2 (histone deacetylase 2, HDAC2) и фибриллин-1 (FBN1) в ДКГ, стимулированных TGF-β1, – усиливали синтез до значений, сопоставимых с ОСК (табл. 8, 9).

Таким образом, стимуляция TGF-β1 стимулирует экспрессию в ДКГ маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, белков актин-миозинового комплекса и матриксных металлопротеиназ MMP2, MMP9, MMP14, ADAMTS1, что сопровождается повышением уровня синтеза 13 белков сигнального пути рецепторного взаимодействия с ВКМ: CD44, HMMR, COL1A2, COL6A1, COL6A3, FN1, LAMB1, LAMC1, ITGA2, ITGA5, ITGAV, ITGB1, ITGB3, – и 3 белков, активизирующих такое взаимодействие: FERMT2, HDAC2 и FBN1 – в дифференцированных клетках глиобластомы до уровня опухолевых стволовых клеток.

Обсуждение результатов

Сопоставив протеомный профиль белков ОСК, выделенной из глиобластомы человека с протеомными профилями а) нормальных, тканеспецифических для нервной системы НСК и б) МССК костного мозга человека, которые локализованы за ГЭБ, мы идентифицировали 1664 белка, из которых 63,2% идентичны в НСК и ОСК и 36,47% подобны в МССК и ОСК. Для нас было особенно важно, что ОСК ГБ и нормальная НСК – это клетки, локализованные за ГЭБ и имеющие единый гистогенетический источник в ЦНС.

Высокий процент белков, идентичных в ОСК и НСК, свидетельствует о вовлеченности регионарных стволовых клеток в неопластический процесс и служит важным аргументом в пользу идеи происхождения рака из регионарных стволовых клеток (Reya et al., 2001; Jordan et al., 2006; Lathia et al., 2015; Gimple et al., 2019). Основываясь на представленных выше фактах высокой подвижности НСК в отношении клеток ГБ и способности нормальных стволовых клеток взаимодействовать с клетками ГБ, обмениваться с ними флуоресцентной меткой, допустимо предположить, что столь высокий процент общих белков НСК и ОСК указывает на существование особого механизма прогрессирования ГБ, связанного с вовлечением в неопластический процесс регионарных стволовых клеток.

На существование именно такого механизма указывает присутствие только 36,47% белков, подобных в МССК и ОСК. Остальные белки в ОСК глиобластомы U-87 связаны с опухолевым процессом. Первоначально мы предполагали (Брюховецкий и др., 2014), что общие идентифицированные белки представляют собою некую «матрицу подобия» и ОСК – это и есть тот «здоровый» и «видоспецифичный» белковый клеточный субстрат, который остался сохранным в ОСК.

Исходя из данных 2014 г., мы предполагали, что эти белки могут стать основой для разработки метода персонализированного, таргетного управления ключевыми функциями ОСК, проаннотировали белки этого типа клеток, которые не пострадали в результате неопластической трансформации клетки, и распределили их на мембранные, секретируемые и ядерные. Такой подход не является личной инициативой авторов и, скорее, продиктован спецификой объекта исследования, разрешающими возможностями метода и возможностями современных баз биологической информации.

В частности, анализируя «матрицы подобия», мы не смогли в полном объеме идентифицировать важный кластер – «цитоплазматические белки», связывающие «ядерный» и «мембранный» компоненты внутриклеточных путей сигнальной трансдукции. Помимо этого, исходя из соображений достоверности, из анализа каждой из групп сравнения мы исключили все белки, у которых нормализованная сигнальная интенсивность изменилась менее чем в 2 раза, что, безусловно, исключает влияние некоторых уникальных белков. В частности, в данную, безусловно идеализированную, выборку не попал Wnt-сигнальный путь – важнейший молекулярный механизм регуляции активности стволовых клеток всех типов, что потребовало проведения дополнительных исследований.

Полученные данные позволили идентифицировать в ОСК ряд путей сигнальной трансдукции, не пострадавших в результате опухолевой трансформации и общих для стволовых клеток всех типов. Наше дальнейшее внимание привлекли сохранные сигнальные пути активации В-клеток; путь Т-клеточной активации; путь воспаления, опосредованного цитокинами; путь гликолиза; путь ангиогенеза; FAS, EGF, FGF – сигнальные механизмы; сигнальный путь фокальной адгезии; интегриновый сигнальный путь.

Анализируя эти механизмы, нельзя не обратить внимание на то, что путь активации В-клеток, путь Т-клеточной активации и путь воспаления, опосредованного цитокинами, наиболее характерны для клеток иммунной системы – важнейшего регулятора процессов репарации и регенерации в многоклеточном организме. Очевидно, что нормальная стволовая клетка использует именно эти пути для взаимодействия с клетками иммунной системы, что указывает на исключительно важную роль таких взаимодействий.

Наше внимание привлек сигнальный путь воспаления, опосредованного цитокинами, который, весьма вероятно, задает главный вектор, предопределяющий судьбу нормальных и патологически измененных низкодифференцированных клеток в процессе воспаления. Вероятно, конечный выбор определяется провоспалительными или иммуносупрессивными цитокинами. На основании данных предшествующих экспериментов можно предположить, что в иммуносупрессивной среде оптимизируются энергетические процессы в опухолевых клетках, подавляется FAS-сигнализация, формируются ансамбли взаимодействующих клеток, продуцирующих EGF– и FGF-лиганды, запускаются процессы ангиогенеза и прогрессирования опухоли. Но стратегически важным условием для реализации именно такого сценария является установление продуктивных взаимодействий между стволовыми клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ).

В этой связи сигнальный путь интегринов, который большей частью совпадает с путем фокальной адгезии, представлял наибольший интерес. Во-первых, сигнальный путь фокальной адгезии можно рассматривать как путь клеточной гибели. Аноики́с (от др.-греч. ἀν – «без», οἶκος – «дом») – механизм гибели «бездомной» клетки путем апоптоза, которая наступает в ответ на утрату связи с ВКМ. Данный механизм активируется при связывании классического провоспалительного цитокина – фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) – с FAS-рецептором, внутриклеточный сигнальный домен которого, как показывают наши исследования, остается сохранным в нормальных и опухолевых стволовых клетках. Взаимодействие TNF-α/FAS приводит к сборке сигнального комплекса, индуцирующего смерть (death-inducing signalling complex, DISC), который запускает апоптоз.

Воздействие на FAS-систему исключительно перспективно. Описаны примеры (акад. РАН проф. М. А. Пальцев, 2003) подавления роста опухолей путем активации TNF-α/FAS сигнального пути, и этот эффект опосредован моноцитами и гранулоцитами, инфильтрирующими опухоль. Безусловно, опухолевая клетка – это патологически измененная клетка, и рассуждая о ее поведении в провоспалительной среде, необходимо принимать во внимание и мутации компонентов сигнального пути FAS, и мутации компонентов других сигнальных путей.

Основываясь на этой логике, во второй части нашей работы выполнен сравнительный анализ молекулярных фенотипов ОСК и ДКГ. В качестве отправной точки нами был выбран протеом ОСК линии U-87 MG глиобластомы человека, изолированной из глиомасфер по экспрессии антигена CD133. Как следует из данных анализа протеомных профилей, ОСК представляет собой уникальную живую систему, обладающую живучестью, на что указывает усиление синтеза белков сигнальных путей гликолиза (гликонеогенеза). Гипоксический тип метаболизма является одной из важнейших характеристик клеток злокачественных опухолей, но особенно он характерен для клеток дикого типа ГБ (Allen et al., 2016). Столь значительные отличия протеомного профиля ОСК от ДКГ свидетельствуют о том, что в процессе селекции на бессывороточных средах с пониженным содержанием глюкозы создаются условия, идентичные таковым внутри узла ГБ, что обеспечивает отбор клеток, обладающих уникальными морфогенными и сигнальными свойствами.

В пользу этого аргумента указывает апрегуляция множества белков сигнального пути Wnt – ключевого эмбрионального механизма регуляции репродукции и плюрипотентности клеток, что сочетается с усилением синтеза в ОСК белков сигнальных путей клеточного цикла, адгезивных контактов, адгезивных молекул и плотных контактов. Тесная связь между усилением синтеза белков сигнальных путей адгезионных контактов и белков Wnt-сигнального пути, вероятно, объясняется спецификой пролиферации ОСК в глиомасфере, где усиление контактного взаимодействия индуцирует выход клеток из глиомасфер, дифференцировку и формирование монослоя.

Здесь опять целесообразно вернуться к фокальной адгезии. Инвазия – главное свойство ГБ, и в этой связи именно фокальная адгезия является регулятором поведения ОСК, что требует особого внимания к вопросу. Для проникновения опухолевых клеток через ВКМ, что, собственно, составляет основную суть процесса инвазии, опухолевые клетки изначально прикрепляются к его компонентам. В формировании клеточно-матриксных контактов ключевая роль принадлежит интегринам – рецепторам, которые обеспечивают рецепторное взаимодействие с ВКМ, осуществляя трансдукцию сигнала «внутрь» и «наружу».

Проведение сигнала «наружу» клетки координирует аффинный статус интегриновых рецепторов, которые, связываясь с ВКМ, формируют фокальную «адгезивную бляшку», в результате чего клетка прикрепляется, выживает и реорганизует цитоскелет, что необходимо для амебоидной миграции в ткани. В свою очередь, трансдукция сигнала «внутрь» активизирует все внутриклеточные сигнальные механизмы фокальной адгезии, координирующие основные жизненные процессы, обеспечивая включение программ миграции или ангиогенеза.

В пользу высоких инвазивных возможностей ОСК свидетельствует апрегуляция 14 белков сигнального рецепторного взаимодействия с ВКМ. Такой молекулярный арсенал позволяет ОСК быстро запустить инвазивный процесс, что подтверждает экспериментальные данные (Singh et al., 2004) об исключительной онкогенности этих клеток. Однако запуск опухолевого процесса и прогрессирование МГБ – это не синонимы.

Колличество ОСК в опухоли сравнительно невелико (Gimple et al., 2019); в этой связи прогрессирование МГБ, а следовательно, проникновение неопластических клеток в окружающие ткани за пределы первичного опухолевого узла возможны только при условии преодоления определенного количественно-качественного порога, что становится возможным благодаря селекции биохимических изменений, которые претерпевают ДКГ под воздействием иммуносупрессивных цитокинов, в фокусе самого пристального внимания TGF-β.

В норме TGF-β индуцирует апоптоз, контролирует пролиферацию и дифференцировку клеток. Стимуляция TGF-β1 ведет к резкому изменению молекулярного профиля ДКГ в виде подавления синтеза адгезионного Е-кадгерина, усиления продукции миграционного N-кадгерина, апрегуляции компонентов актин-миозинового комплекса, белков мезенхимального фенотипа и матриксных металлопротеиназ.

В пользу исключительно продуктивной межклеточной коллаборации в опухолевом очаге свидетельствует значительное усиление синтеза в ДКГ 19 белков сигнального пути рецепторного взаимодействия с ВКМ, среди которых 13 белков увеличивают уровень синтеза более чем в 2 раза, достигая значений, сопоставимых с ОСК, что отчасти позволяет рассматривать клетки этого типа в качестве своеобразной «матрицы», детерминирующей свойства ДКГ агрессивного фенотипа.

При сравнительном анализе протеомов ДКГ, стимулированных TGF-β и ОСК, нами обнаружено резкое усиление продукции гликопротеина CD44 – рецептора гиалуроновой кислоты – и опосредованного гиалуронаном рецептора подвижности (HMMR), что является ключевым фактором для инвазии (Mooney et al., 2016).

Антиген CD44 в контексте полученных данных особенно интересен. В клетках, выделенных из глиомасфер, количество элементов ИР в отношении антигена CD44 сравнительно невелико. Однако в эксперименте in vivo к 28-му дню наблюдений отмечен рост количества клеток ИР в отношении антигена CD44, который рассматривают (Goffart et al., 2016; Pińa Batista et al., 2017) как признак агрессивного фенотипа опухолевых клеток. В этой связи появление этого маркера на поверхности клеток глиомы на 28-й день эксперимента подтверждает возросшую мобильность, вызванную стимуляцией TGF-β.

В эксперименте (Brown et al., 2016) имплантация CD44⁺-клеток в мозг животных позволяла быстро запустить инвазивный процесс, при этом формирование объемных опухолей было возможно только при наличии среди имплантируемых клеток СD133-ИР морфологических элементов.

Результаты настоящего исследования показали, что содержание белка CD44 в ОСК было в 2,5 раза выше, чем в ДКГ, при этом стимуляция TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 2,3 раза по сравнению с интактными ДКГ.

HMMR является онкогеном, который играет важную роль в развитии солидной опухоли. Он сильно активируется в тканях глиомы человека, особенно в ГБМ. Белок HMMR создает комплекс с CD44 и после связывания с гиалуроновой кислотой активирует внутриклеточные сигнальные пути, регулирующие пролиферацию и инвазию CSC. Ингибирование HMMR подавляет и радиосенсибилизирует клетки МГБ. Результаты настоящего исследования показали, что экспрессия HMMR в CSCs была в 2,2 раза выше по сравнению с экспрессией в ДКГ, что свидетельствует о высокоинвазивной природе этих клеток. В дифференцированных опухолевых клетках агрессивный фенотип; сформированный при стимуляции TGF-β уровень синтеза этого белка возрастает в 2,3 раза.

Особого внимания заслуживают компоненты ВКМ: коллаген, фибронектин и ламинин, синтез которых является обязательным компонентом комплексной программы инвазивного роста. В настоящем исследовании продемонстрирована более чем в 2 раза выросшая экспрессия коллагенов I и IV типов в ОСК по сравнению с таковыми в ДКГ. При этом стимуляция дифференцированных опухолевых клеток TGF-β приводила к усилению уровня синтеза 3 субъединиц коллагена: COL1A2, COL6A1 и COL6A3 – до уровня, сопоставимого с РСК.

Коллаген I типа (COL1A2), уровни которого в РСК выше в 3,2 раза по сравнению с ОСК, стимулирует дифференцированные клетки TGF-β, усиливает синтез этого белка в 3,6 раза. Этот протеин является молекулярно-ориентированным маркером при раке желудка и раке простаты. Подавление гена COL1A2 угнетает процессы инвазии и метастазирования опухолей желудочно-кишечного тракта.

Коллаген типа VI α1 цепи (COL6A1), уровни которого в ОСК выше в 8,4 раза по сравнению с ДКГ, однако стимуляция опухолевых клеток TGF-β усиливает синтез этого белка более чем в 8 раз. Высокие уровни COL6A1 в клетках МГБ ассоциируется резистентностью к лечению и является одним из самых значимых маркеров инвазивных глиальных опухолей.

Фибронектин-1 (FN1) является ключевым компонентом ВКМ. Повышенные уровни экспрессии FN1 выявлены у большинства пациентов с ГБ. Повышенная продукция FN1 модулирует адгезию, пролиферацию, дифференцировку и химиорезистентность ОСК. Результаты настоящего исследования показали, что экспрессия этого белка в ОСК была в 4,1 раза выше, чем в DGCs. При этом стимуляция TGF-β увеличивает уровень синтеза FN1 в опухолевых клетках в 4,2 раза.

Экспрессия субъединиц β (LAMB1) и γ (LAMC1) ламининов была выше в 8,8 и 3,8 раза соответственно в ОСК по сравнению с таковой в ДКГ. Стимуляция клеток ГБ TGF-β1 приводит к усилению продукции этих молекул ламинина в 8,2 и 3,7 раза соответственно.

При связывании с коллагеном, ламинином и фибронектином происходит перестройка цитоплазматического домена ингегриновых рецепторов с образованием адгезивной бляшки, необходимой для амебоидной миграции в окружающие ткани. В этой связи наблюдаемое нами обогащение репертуара интегриновых рецепторов клеточной поверхности представляется одним из важнейших компонентов общей картины изменений, наблюдаемых при формировании агрессивного фенотипа.

Обогащение репертуара интегриновых рецепторов при стимуляции TGF-β показано нами на модели клеток линии А549 аденокарциномы легких и МГБ человека (Шевченко и др., 2016). В данном исследовании особо отметим увеличение значительное увеличение содержания в DGCs агрессивного фенотипа 5 белков, которые достигают значений, сопоставимых с РСК.

Субъединица интегрина 2 (ITGA2) участвует в прогрессировании инвазивных опухолей, включая меланому, способствует выживанию и инвазии клеток рака предстательной железы и является маркером инвазивно-активных клеток-предшественников трофобласта. Текущее исследование показало, что ОСК имели в 3,9 раза более высокую экспрессию ITGA2 по сравнению с таковой в ДКГ. Стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 4,1 раза.

Субъединица интегрина 5 (ITGA5) является маркером неблагоприятного прогноза при раке пищевода и колоректальной аденокарциноме, положительно регулирует клеточную стволовость при трижды негативном раке молочной железы и поддерживает образование глиомасфер in vitro и миграцию клеток ГБ. Результаты текущего исследования показали, что CSC имели 3,6-кратную повышенную экспрессию ITGA5 по сравнению с DGCs. При этом стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 3,5 раза.

Интегрин V (ITGAV) активируется в первичных опухолевых клетках головного мозга и метастазах меланомы, рака легких, почек и молочной железы. ITGAV регулирует биологические эффекты TGF-β через SMAD-зависимый механизм, индуцирует дифференцировку ОСК при взаимодействии с компонентами ECM. Эти белки играют важную роль в позиционировании клеток-предшественников, при миграции нейробластов из субвентрикулярной зоны мозга в обонятельную луковицу. Текущее исследование показало, что экспрессия ITGAV в ОСК в 5 раз выше, чем в ДКГ. Cтимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 4,5 раза. Эти белки являются важнейшими рецепторами витронектина, фибронектина, фибриногена, ламинина и других компонентов ЕСМ.

Уровни экспрессии субъединиц интегрина β1 (ITGB1) и β3 (ITGB3) также были увеличены в ОСК в 4,5 и 3,24 раза соответственно. Стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 4,5 и 3,4 раза по сравнению с интактными дифференцированными опухолевыми клетками. Уровень синтеза ITGB1 усилен в клетках ГБ, резистентной к бевацизумабу, а эффективность антиангиогенной терапии возрастает при подавлении этой мишени. Усиленная продукция ITGB3 характеризует клетки МГБ, выделенные из богатых витронектином гипоксических зон опухоли и обладающие высокой инвазивной и метастатической активностью. Экспрессию этих белков в клетках колоректального рака предложено рассматривать в числе молекулярных маркеров отдаленных метастазов в мозг.

Итак, стимуляция дифференцированных опухолевых клеток TGF-β сопровождается апрегуляцией ряда белков сигнального пути рецепторного взаимодействия с ВКМ, что сближает их молекулярный фенотип с ОСК. Однако сходство молекулярных фенотипов на этом не заканчивается: более тонкий биоинформационный анализ выявил ряд белков, активирующих сигнальный путь РВ-ВКМ, которые апрегулируются в ДКГ после стимуляции TGF-β, достигая значений, сопоставимых с ОСК.

FERMT2 является важным регулятором активности интегрина в межклеточных взаимодействиях, который модулирует опосредованную интегрином адгезию и инвазию трофобластов в стенку матки, а также участвует в канцерогенезе и прогрессировании опухоли. Результаты настоящего исследования показали, что ОСК имели 3,5-кратное увеличение экспрессии FERMT2 по сравнению с ДКГ. Стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 3,2 раза по сравнению с интактными ДКГ.

LOXL2 является секретируемой медь-зависимой аминооксидазой семейства LOX; ее субстратами являются коллаген и эластин. Повышенная экспрессия LOXL2 в клетках различных типов рака коррелирует со снижением показателей выживаемости у пациентов и связана с инвазивной и метастатической активностью рака молочной железы, гепатоцеллюлярной аденокарциномы, клеток рака предстательной железы и некоторых других агрессивных опухолей. Текущий анализ выявил 9-кратное увеличение экспрессии LOXL2 в CSC по сравнению с таковой в ДКГ. Однако стимуляция опухолевых клеток TGF-β значительно повышает уровень синтеза этого белка в ДКГ по сравнению с интактными DGCs, что указывает на особую роль этого фермента в биологии ОСК.

Поэтому LOXL2 может быть заметным маркером ОСК и многообещающей терапевтической мишенью. Уровень экспрессии LOXL2 позитивно регулируется индуцируемыми гипоксией факторами, а повышенная экспрессия часто наблюдается в инвазивных опухолях молочной железы, головы и шеи. Следовательно, значительное увеличение экспрессии LOXL2, наблюдаемое в ОСК в настоящем исследовании, указывает на то, что этот белок может играть роль в опухолевых процессах в клетках этого типа. LOXL2 изменяет структуру гистонов и, таким образом, изменяет форму клеток, способствуя развитию метастазов и инвазии.

Уровень экспрессии LOXL2 коррелирует с экспрессией HDAC2, что указывает на то, что эти белки могут играть синергетическую онкогенную роль. В настоящем исследовании экспрессия HDAC2 была в 1,7 раза выше в ОСК по сравнению с таковой в ДКГ. При этом стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 1,5 раза, до значений, сопоставимых с ОСК.

FBN1 представляет собой белок семейства фибриллинов, который участвует в поддержании плюрипотентности нормальных эмбриональных стволовых клеток и ОСК и обеспечивает биологическое действие TGF-β. Было обнаружено, что уровень экспрессии FBN1 в ОСК в 6,21 раза выше, чем в ДКГ. Стимуляция опухолевых клеток TGF-β увеличивает уровень синтеза этого белка в 5,1 раза, до значений, сопоставимых с РСК. Таким образом, стимуляция TGF-β подавляет пролиферацию, увеличивает подвижность и формирует агрессивный молекулярный фенотип клеток МГБ, который характеризуется переключением адгезионных Е-кадгеринов на миграционные N-кадгерины, продукцией маркеров тканей мезодермального происхождения, усилением синтеза белков актин-миозинового комплекса, продукцией матриксных металлопротеаз и апрегуляцией 19 белков сигнального пути рецепторного взаимодействия с внеклеточным матриксом, из которых 13 белков увеличивают уровень синтеза более чем в 2 раза, достигая значений, сопоставимых с РСК. Формирование агрессивного фенотипа клеток ГБ сопровождается усилением синтеза молекул, непосредственно взаимодействующих с апрегулированными белками.

Экспрессия LOXL2 более чем в 9 раз выше в ОСК по сравнению с ДКГ, из чего можно заключить, что ОСК имеют высокоинвазивную природу и что этот белок может быть важным маркером ОСК и многообещающей мишенью для устранения этих клеток в МГБ. Вероятно, клетки фенотипа CD133⁺ LOXL2⁺ занимают особое место в иерархии клеток МГБ; продукция этого маркера отличает клетки агрессивного фенотипа от ОСК, что должно обязательно учитываться при выборе мишеней для целевой терапии.

Исследование позволяет сформулировать мысль, что важнейшим путем регуляции инвазивной активности ОСК может стать подавление трансмиссии TGF-β в опухолевом очаге, которая сближает молекулярный фенотип СD133-дифференцированных и СD133⁺ стволовых клеток МГБ. Теоретически это возможно в условиях модуляции активации опухолевой микроглии по классическому пути в условиях запуска системной воспалительной реакции.