Текст книги "Гемопоэтическая стволовая клетка в патогенезе болезней цивилизации, ее диагностические возможности и биотерапевтический потенциал"

Обсуждение результатов

Как следует из результатов эксперимента, стереотаксическая имплантация клеток глиомы С6 в мозг иммунокомпетентных крыс породы вистар позволяет сформировать глиальную опухоль, которая воспроизводит основные патофизиологические механизмы развития МГБ и характеризуется инвазивным ростом, высокой скоростью пролиферации раковых клеток, интенсивным ангиогенезом и ранним появлением очагов некроза, что позволяет отнести ее к классу глиом высокой степени злокачественности согласно классификации St. Anne-Mayo System (SAMS), или Grade IV в соответствии с критериями ВОЗ.

Исключительно важно, что эта опухоль в своем развитии воспроизводит основные патофизиологические механизмы, характерные для МГБ. Так, несмотря на интенсивный ангиогенез, к 28 сут. наблюдения происходит прогрессирующее увеличение площади зон некроза и снижение темпов пролиферации опухолевых клеток, что косвенно указывает на ключевую роль фактора гипоксии – основного регулятора морфологических изменений в опухолевой ткани.

При проведении эксперимента мы отказались от окраски опухоли антителами к фактору, индуцированному гипоксией (HIF), что связано с большой изученностью вопроса и наличием прямой взаимосвязи между количеством HIF в ткани глиомы и интенсивностью ангиогенеза (Clara et al., 2014). Однако, несмотря на интенсивный ангиогенез, уже на 14 сут. в опухоли формируются очаги некроза, которые на 28-й день начинают занимать основное место в морфологической картине. При этом опухоль не погибает, а на границе опухоли с веществом мозга наблюдаются активная инвазия неопластических клеток и образование сателлитных очагов.

Обращает на себя внимание то, что пролиферация сохраняется на границах с неизменным веществом мозга, где степень оксигенации выше, чем в центре опухолевого узла. В этом случае именно высокий уровень энергозатратной пролиферации множества клеток опухоли и становится, с одной стороны, причиной гипоксии и формирования очагов некроза, а с другой – индуктором синтеза TGF-β1 и VEGF в клетках глиомы. Первый фактор одновременно с противовоспалительными эффектами стимулирует формирование структур межклеточного матрикса, в то время как второй фактор запускает ангиогенез, связанный именно со структурами матрикса, и провоцирует тем самым инвазию, что и подтверждается результатами морфологического анализа. Нельзя не отметить, что роль VEGF в процессе провоспалительной модификации опухоли не входила в задачи исследования и требует дальнейшего изучения. Однако уже эти результаты морфологического исследования являются достаточным основанием для углубленного анализа роли TGF-β1 в ходе опухолевого процесса и патофизиологического значения его усиленной продукции в области инвазивного края опухоли и в веществе мозга.

Основным источником TGF-β1 в опухолевой ткани являются клетки МГБ (Massague, 2008); некоторую лепту вносят активированные клетки микроглии, продуцирующие TGF-β вместе с другими противовоспалительными цитокинами. Однако число клеток микроглии в опухоли крыс контрольной группы значительно сокращается к 28-му дню наблюдений, а интенсивность продукции TGF-β фибробластами в сравнении с неопластическими клетками невелика. Существуют данные, что наряду с клетками МГБ непосредственное участие в синтезе TGF-β принимают рекрутированные в опухоль клетки костного мозга (Hambardzumyan et al., 2016), но наши данные не подтверждают такую возможность (Bryukhovetskiy, 2016).

Существуют прямые корреляции между уровнем TGF-β в сыворотке крови и степенью злокачественности глиом (Rich et al., 2003), однако вопрос нельзя считать изученным. В норме этот цитокин индуцирует апоптоз, контролирует пролиферацию и дифференцировку клеток. Помимо этого, по нашим данным, стимуляция TGF-β1 ведет к резкому изменению молекулярного профиля клеток МГБ, что сопровождается подавлением синтеза адгезионного Е-кадгерина, усилением продукции миграционного N-кадгерина и компонентов актин-миозинового цитоскелета, что полностью согласуется с важнейшей ролью TGF-β1 в организации межклеточного матрикса и проявляется усилением синтеза белков мезенхимального фенотипа и матриксных металлопротеиназ (Bryukhovetskiy et al., 2016). В этой связи усиленная продукция TGF-β предшествует ангиогенным эффектам VEGF (Krishnan et al., 2015) и потенцирует их, что является важным фактором «зрелости» опухоли и свидетельствует о наличии в ее составе клеток, способных к проникновению в окружающие ткани и органы, а следовательно, обладающих всей полнотой свойств раковых клеток.

Безусловно, инвазивный рост – главный критерий прогрессирования опухоли, и, по мнению большинства авторов, это свойство МГБ связано не столько с опухолевыми клетками, сколько с опухолевыми стволовыми клетками (ОСК). Именно на поражение ОСК ориентирован огромный арсенал таргетных средств, применение которых (Touat et al., 2018) не привело, однако, к значимому увеличению выживаемости больных МГБ при масштабных клинических исследованиях. Между тем количество ОСК в опухоли всегда сравнительно невелико (Sundar et al., 2014), они локализованы в нишах и реализуют свойственный им дифференцировочный потенциал в направлении создания неопластической кровеносной сети как основного условия выживания опухоли (Hambardzumyan et al., 2016). И хотя данное исследование напрямую не затрагивает роли РСК, полученные результаты указывают, что, возможно, их значение в опухолевой прогрессии не столь велико, как считается.

При этом данные собственных исследований указывают на то, что стимуляция TGF-β сближает молекулярный фенотип дифференцированных клеток МГБ с ОСК, что позволяет ликвидировать критический разрыв между количеством ОСК и инвазивными свойствами дифференцированных опухолевых клеток, делая возможным прогрессирование опухоли (Bryukhovetskiy, 2019). В этой связи полученные данные свидетельствуют, что важным путем регуляции инвазивной активности МГБ может стать подавление продукции TGF-β в опухоли, что может быть реализовано путем использования противоопухолевого потенциала ГСК и мононуклеарных клеток костного мозга.

Мононуклеарные CD45⁺-клетки костного мозга активно используются в онкологии более 50 лет. Они применяются после высокодозной химиотерапии для снижения депрессии костного мозга, сокращения риска инфекционных и геморрагических осложнений и восстановления иммунного противоопухолевого ответа. При аллогенной трансплантации клетки этого типа обладают собственным лечебным эффектом благодаря реакции донорских иммунных клеток против остаточной опухоли у больного. Однако во всех случаях для рекрутирования в системный кровоток и последующей иммобилизации клеток этого типа применяется Г-КСФ, использованный в нашем исследовании.

Г-КСФ (Pierce et al., 2017; Deotare et al., 2017) обладает способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку предшественников нейтрофилов, ускоряет созревание гранулоцитов, ускоряет их выброс из костного мозга, увеличивает их фагоцитарную и антителозависимую клеточную цитотоксическую активность против опухолевых клеток, усиливает активность естественных киллеров, адгезию нейтрофилов, модулирует экспрессию их рецепторов и их аффинность. Г-КСФ является одним из самых мощных агентов (Domingues et al., 2017), рекрутирующих ГСК и прогениторные клетки костного мозга в системный кровоток и индуцирующих на них экспрессию рецептора CXCR4 (Saba et al., 2015), детерминирующего миграцию клеток этого типа в опухолевый очаг, в ответ на рост градиента концентрации фактора стромальных клеток SDF-1α (Bryukhovetskiy et al., 2015) и еще 80 цитокинов, реализующих этот эффект через соответствующего типа рецепторы.

Безусловно, злокачественные опухоли оказывают влияние на локальное тканевое микроокружение. Моноциты крови инфильтрируют опухоль и под влиянием сигнальных молекул, секретируемых опухолью (Г-КСФ, гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста КСФ, интерлейкины-4 и -10, трансформирующий ростовой фактор β), дифференцируются в макрофаги с «антивоспалительным» фенотипом и, подавляя антиопухолевый иммунитет и стимулируя формирование новых кровеносных сосудов, способствуют росту и метастазированию опухоли. Однако здесь целесообразно еще раз вернуться к дизайну исследования.

Значительную часть мононуклеарных клеток, иммобилизированных в кровеносное русло Г-КСФ, составляют ГСК, которые окрашиваются антителами против антигена CD34. Именно этот феномен был основанием для формирования группы II. К сожалению, у большинства авторитетных производителей отсутствуют в продаже антитела против CD34⁺-антигена ГСК крысы, что, конечно, вызывает определенные сложности, но ценности исследования не снижает. Но, как следует из эксперимента, стимуляция Г-КСФ не только позволяет резко и статистически значимо увеличить долю CD45⁺-клеток в общем числе лимфоцитов, но и более чем в 19 раз увеличивает в их популяции число СD45⁺ HSC-like cells, принадлежащих к боковой популяции, определяемой как ГСК (Telford et al., 2010).

В гл. 6 показано, что стволовые клетки человека обладают высокой подвижностью в отношении клеток глиом и карцином in vitro и при внутривенном введении in vivo в организм экспериментальных животных с перевитой глиальной опухолью мозга мигрируют в неопластический очаг, где трансформируются в клетки IBA⁺ микроглии, обладающей высоким противоопухолевым потенциалом (Bryukhovetskiy et al., 2017).

Теоретически одним из механизмов подавления активности ОСК является модуляция активности моноцитарно-макрофагальной системы с использованием ГСК, рекрутируемых Г-КСФ в кровоток человека. Рекрутирование ГСК в системный кровоток приводит к резкому увеличению в опухоли числа клеток с маркерами микроглии, что тоже иногда связывают с прогрессированием процесса (Fonseca et al., 2015; Hambardzumyan et al., 2016). Однако морфохимическая модификация узла экспериментальной глиомы в ответ на рекрутирование ГСК и пула CD45⁺-клеток не всегда сокращает продолжительность жизни крыс с глиомой С6. Решающее значение здесь принадлежит особенностям локализации и качественным параметрам микроглии.

Анализируя данные гл. 6, допустимо утверждать, что накопление клеток костного мозга в опухоли обусловлено формированием неопластической кровеносной сети, которая является прямым ответом на стимулирующее воздействие внутриопухолевой гипоксии. Детальное изучение этого вопроса – задача будущего, однако в норме количество ГСК, способных проникнуть через неповрежденный гематоэнцефалический барьер, крайне мало. В естественных условиях защитную функцию в мозге обеспечивают резидентные микроглиоциты, происходящие из эмбрионального желточного мешка, они поддерживают популяцию путем пролиферации; клетки костного мозга в этом процессе не участвуют.

Именно формирование кровеносной сети позволяет МГБ рекрутировать стволовые, прогениторные и другие клетки костного мозга с последующей трансформацией в клетки микроглии. Отсюда можно предположить, что наблюдаемое рядом исследователей (Wang et al., 2016) стимулирующее влияние этих клеток на рост опухоли отчасти обусловлено как воздействием привлекающей их гипоксии, так и прекондиционирующим влиянием особых иммуносупрессивных цитокинов, без которых невозможны формирование неопластической кровеносной сети и амортизация цитотоксического влияния иммунных клеток, проникающих в «забарьерный» орган.

Вероятно, гипоксия активизирует либо предрасполагает к активации макрофагов по альтернативному пути (состояние М2), что повышает их фагоцитарную активность, усиливает синтез интерлейкина-10, TGF-β1 и других противовоспалительных цитокинов, усиливающих процессы ремоделирования некротизированной ткани (Nusblat et al., 2017), что, вероятно, и объясняет преобладание в микроокружении инвазивно активных элементов МГБ клеток с маркерами M2 микроглии. Клетки этого типа образуют секреторные петли в коллаборации с фибробластами и активно продуцируют TGF-β и запускают процессы генерации клеток с фенотипом эпителиально-мезенхимального перехода. В этой связи подавление инвазивной активности клеток МГБ возможно при активации макрофагов по классическому пути (состояние М1), что послужило главным аргументов для создания групп III и IV.

Эффекты, наблюдаемые в группе III, были связаны с двойным стимулирующим воздействием на клетки микроглии, связанные в своем происхождении с моноцитарно-макрофагальным рядом. При этом воздействие ЛПС реализуется через рецептор врожденного иммунитета TLR4 и приводит к формированию инфламмасомы и секреции после процессинга преформированных провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-α), что полностью подтверждается результатами, приведенными на. Одновременно главным биологическим эффектом IFNγ также является стимуляция всего пула клеток моноцитарно-макрофагального ряда, что выражается в дальнейшем нарастании продукции провоспалительных цитокинов, в сборке протеосомного комплекса и экспрессии на мембране адгезионных молекул IBA1 и костимулирующих молекул В7 (CD80/CD86), что вновь находит подтверждение в результатах (рис. 74—78).

Как известно, микроглиоциты мозга происходят из эмбрионального желточного мешка и после закрытия гематоэнцефалического барьера поддерживают свою популяцию путем пролиферации; моноциты и ГСК в этом участия не принимают. Вероятно, этим и объясняется обилие в опухоли PCNA⁺-клеток, иммунопозитивных в отношении маркеров микроглии, на 14-й день эксперимента. Однако этот ресурс быстро истощается, что проявляется уменьшением плотности группировки клеток микроглии на 28-й день наблюдений.

Несколько настораживает отмеченный нами факт некоего усиления пролиферативной активности в опухолевой ткани на фоне стимуляции Г-КСФ и провоспалительной терапии. Однако следует принять во внимание, что активированные IFNγ макрофаги вновь обретают способность к пролиферации, и вряд ли микроглия является исключением из этого правила, что позволяет предполагать еще один источник роста числа PCNA⁺-клеток по периферии опухолевого узла у животных группы IV на 28-й день опухолевого роста, а также объясняет компактизацию опухоли и рост числа IBA1⁺-клеток микроглии по периферии узла и в его толще.

Другим, не менее важным, эффектом IFNγ является торможение продукции противовоспалительных цитокинов, что на примере TGF-β1 и IL-10 также находит свое подтверждение в результатах работы (рис. 78). При этом комбинированное воздействие Г-КСФ, а также бактериального ЛПС и IFNγ (группа IV) обеспечивает максимальное рекрутирование всех мононуклеаров, стимуляцию созревания ГСК в сторону миелоидного ряда, многогранную и глубокую стимуляцию всех (циркулирующих и тканевых) клеток моноцитарно-макрофагального ряда, в т.ч. микроглии. Неслучайно именно результаты группы IV по всем тестам обеспечивают получение наиболее четких и убедительных эффектов и позволяют ставить вопрос о возможности экспериментально-клинического исследования в рамках терапии МГБ.

Результаты, полученные для группы IV, а также полученные нами ранее данные о возможности стимуляции активности металлопротеиназ в клетках микроглии (Bryukhovetskiy et al., 2018) позволяют соединить в целостную картину результаты иммуногистохимии, ИФА с результатами морфологического исследования. Поскольку металлопротеиназы играют крайне существенную роль в ремоделировании матрикса при воспалении, повышение их продукции клетками микроглии может существенно изменить структуру матрикса и снизить скорость неоангиогенеза в опухолевом узле, что проявится снижением скорости его роста и повышением выживаемости. Это предположение подтверждается и ростом числа IBA1⁺-клеток микроглии в узле и вокруг него и полностью совпадает с результатами томографии и микроскопического исследования.

Активный ангиогенез, наблюдаемый в процессе роста опухоли (см. гл. 5), способствует повреждению гематоэнцефалического барьера, что делает возможным рекрутирование стволовых и прогениторных клеток костного мозга в опухоль, где они восполняют популяцию микроглиоцитов. Однако попадая в иммуносупрессивную среду, формируемую TGF-β, эти клетки получают альтернативный вектор активации, в пользу чего свидетельствует значительное уменьшение в опухолевой ткани крыс группы Г-КСФ числа клеток, иммунопозитивных в отношении маннозного рецептора CD206 – одного из наиболее ценных признаков альтернативной активации макрофагов (Suzuki et al., 2018; Scodeller et al., 2017).

Принципиально важно, что рекрутирование мононуклеарных CD45⁺-клеток костного мозга в кровеносное русло сопровождается увеличением выживаемости экспериментальных животных. При этом наибольшие показатели выживаемости крыс с глиомой С6 у крыс группы Г-КСФ + PT свидетельствуют о том, что локальное усиление воспалительной реакции – это ведущий механизм противоопухолевого действия ГСК и всего пула мононуклеарных CD45⁺-клеток костного мозга.

Таким образом, исследование позволяет сделать вывод: интенсивность продукции TGF-β1 в опухолевой ткани обратно пропорциональна интенсивности процессов пролиферации. Стимуляция экспериментальных животных Г-КСФ рекрутирует ГСК и мононуклеарные CD45⁺-клетки в системный кровоток и далее в опухоль экспериментальных животных с глиомой С6, что сопровождается усилением процессов микроглиальной пролиферации и обогащением инфильтрации в опухолевой ткани маркерами клетками микроглии. Провоспалительная терапия на фоне стимуляции Г-КСФ вызывает усиление процессов презентации антигена, что сопровождается снижением продукции TGF-β, ремоделированием опухолевого матрикса и увеличением выживаемости экспериментальных животных.

Глава 8. Протеомика стволовых и опухолевых клеток (соавт. д.м. н. И.С. Брюховецкий, д.б.н. проф. В. Е. Шевченко, м.н. с. С.В. Зайцев)

Механизм появления и накопления патологических белков в специализированной клетке организма закономерен и непосредственно связан с мутациями или возможными погрешностями в процессах митозов, количество которых в организме человека составляет несколько миллиардов в день. Однако болезнь дебютирует только при нарушении механизмов компенсации, снижении общей реактивности организма или дезинтеграции согласованной работы интегративных систем, обеспечивающих постоянство внутренней среды, посредством скоординированных реакций, направленных на поддержание стойкого динамического равновесия.

Принято считать, что основной линией защиты многоклеточного организма являются иммунокомпетентные клетки (ИКК) периферической крови, целью которых является уничтожение патологических клеток и инфекционных агентов. Однако накоплено множество данных (Low, Verfaillie, 2008; Викторов и др., 2001) в пользу того, что регионарные стволовые клетки являются вторым, но не менее важным локальным компонентом общей системы гомеостаза и вовлечены в регуляцию патологических процессов вместе с иммунными клетками. И, наконец, уже третьей «линией» клеточной и гуморальной иммунной защиты является вовлечение в этот процесс ГСК.

Несмотря на то что ГСК – это основная кроветворная клетка и родоначальница всех иммунных клеток организма, она участвует в процессах тканеспецифической регуляции всех органов и систем организма. Показано (Милькина и др., 2017), что при взаимодействии с опухолевыми клетками некоторых типов рака (рак легкого, рак груди, глиобластома) ГСК секретируют множество белков, которые попадают в другие клетки и радикально меняют их судьбу. При этом ГСК тоже получают некоторое количество опухолеспецифических белков (ОСБ), ввиду чего протеом ГСК следует рассматривать только в контексте конкретного заболевания у конкретного индивида, о чем будет сказано ниже. Однако независимо от молекулярного фенотипа судьба любой нормальной и опухолевой клетки определяется специфическим влиянием локального микроокружения, которое применительно к опухолевому процессу в абсолютном большинстве случаев является иммуносупрессивным.

Нами проведен сравнительный анализ протеомных профилей нормальных нейральных (CD133⁺) стволовых клеток (НСК), выделенных из обонятельной выстилки носа человека, мезенхимальных CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD90⁺, СD34^— стволовых клеток (МСК) костного мозга человека и опухолевых CD133⁺ стволовых клеток (ОСК) мультиформной глиобластомы человека. Выполнено сравнительное картирование протеомов CD133⁺ ОСК и дифференцированных CD133^—-клеток ГБ, и установлены закономерности трансформации протеома ДКГ при стимуляции одним из ключевых иммуносупрессивных цитокинов – TGF-β1.

Сравнительный анализ протеомных профилей нормальных нейральных CD133⁺ стволовых клеток человека, мезенхимальных CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD90⁺, СD34^— стволовых клеток костного мозга человека и опухолевых (CD133⁺) стволовых клеток (ОСК) глиобластомы человека

При разработке дизайна эксперимента исходили из следующей идеальной модели: ГБ – одна из самых агрессивных опухолей ЦНС, в патогенезе которой ключевая роль принадлежит ОСК. Тканеспецифические, регионарные нейральные стволовые клетки (НСК) находятся за ГЭБ и непосредственно вовлечены в патогенез ГБ. Напротив, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСК) в условиях сохранного ГЭБ участия в опухолевом процессе не принимают.

Целью исследования явилось проведение сравнительного протеомного картирования ОСК ГБ человека, НСК и МССК человека для определения степени вовлеченности регионарных стволовых клеток в опухолевый процесс и идентификации универсальных молекулярных механизмов участия всех типов стволовых клеток в неопластическом процессе. Исследование одобрено Этическим комитетом Школы биомедицины ДВФУ (протокол №2 от 02.08.2015).

Нейральные стволовые клетки человека. Материал предоставлен ЗАО Клиника «НейроВита» (г. Москва, Россия). Перед использованием в эксперименте клетки протестированы на загрязнение микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™). После разморозки материал характеризовали методом проточной цитометрии в отношении антигена CD133 (кат. №130-105-226; Miltenyi Biotec, Inc.).

Мезенхимальные стволовые клетки человека. Материал предоставлен ЗАО Клиника «НейроВита» (г. Москва, Россия). Перед использованием в эксперименте клетки протестированы на загрязнение микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™). МССК характеризовали с помощью проточной цитометрии по экспрессии поверхностных антигенов: CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD90⁺, СD34^—.

Выделение и культивирование стволовых клеток глиобластомы человека. В работе использована клеточная линия U-87 MG МГБ, полученная из Американской коллекции типовых культур (ATCC; кат. № HTB-14 ™). Безусловно, эта клеточная линия не является оригинальной линией U-87, созданной в Университете Уппсалы (Allen et al., 2016), но представляет собой «дикий» тип человеческой ГБ. Этот факт значительно увеличивает ценность эксперимента, т.к. глиобластома дикого типа составляет более 90% случаев этой опухоли.

Для получения глиомасфер клетки использованы клетки, полученные после 3-го пассажа с момента получения от производителя. Перед использованием в эксперименте клетки протестированы на загрязнение микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 30—1012K™). Клетки линии U-87 культивировали в среде DMEM/F12 с пониженным содержанием сыворотки и добавлением L-glutamine; B27; bFGF, 20 нг/мл; EGF, 20 нг/мл; Penicillin/Streptomycin, 100 U/мл; Heparin, 5 μg/мл. Все реагенты – производства компании Gibco. Культивирование проводили во флаконах Т75 при 37 ^○С, в атмосфере 5% CO₂. Добавление свежих ростовых факторов проводили каждые 3 дня. Селекцию CD133⁺-клеток выполняли методом иммуносортинга с использованием магнитных шариков с иммобилизованными на них антителами к CD133 (кат. №130-105-226; Miltenyi Biotec, Inc.).

Методика сравнительного исследования клеточных протеомов. Использована комбинация высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Для оценки изменения экспрессии уровней белков применялся метод label-free. Клетки лизировали при помощи Mammalian Cell Lysis Kit (MCL1—1KT, Sigma-Aldrich), образцы очищали от низкомолекулярных соединений, проводили энзиматический гидролиз и по 3 мкл растворов анализировали масс-спектрометрически для контроля проведения трипсинолиза. По окончании реакции содержимое пробирок упаривали досуха при 60 ºС, проводили разделение триптических пептидов. Анализ триптических пептидов проводили на нанопроточном хроматографе Dionex Ultimate 3000 (Dionex, Нидерланды) в сочетании с масс-спектрометром LTQ Orbitrap XL (Thermo) с источником ионизации NSI. Разделение пептидов осуществляли на колонке Acclaim C18 PepMap100 (75 мкм × 150 мм, размер зерна 3 мкм, Dionex), снабженной предколонкой. Для идентификации белков масс-спектры конвертировали программой Proteome Discoverer 1.0 (Thermo). Поиск белков проводили с помощью программы Mascot Server 2.3.02 (Matrix Science, Великобритания). Списки идентифицированных белков вместе с хромато-масс-спектрами загружали в программу Skyline 1.2.0.3303. Аннотирование биологических процессов, молекулярных функций, клеточной локализации и сигнальных путей белков проводили с помощью баз PubMed, PANTHER, Gene Ontology и KEGG.

Результаты. После проведения лизиса количество общего белка в лизатах составило: НСК – 2032 ± 85 мкг/мл; ОСК – 2150 ± 360 мкг/мл; МССК – 3198 ± 281 мкг/мл. Обработка данных ВЭЖХ программой Mascot Server идентифицировала 1664 белка во всех пробах. В результате дальнейшей обработки данных программой Skyline были определены уровни:

• НСК – 1447 белков по 11 176 пептидам (молекулярный вес от 3,53 до 3908,10 кДа);

• ОСК – 1225 белков по 13 674 пептидам (молекулярный вес от 4,60 до 3908,10 кДа);

• МССК – 842 белка по 10 932 пептидам (молекулярный вес от 5,02 до 1017,07 кДа).

Динамический диапазон для идентифицированных белков составил 7 порядков. Протеомные карты НСК, МССК и ОСК линии U-87 глиобластомы человека приведены на сайте ДВФУ: https://www.dvfu.ru/science/the-r-d-results/current-projects-pcpir/14.575.21.0038/.

Для проведения сравнительного анализа из данного списка были исключены белки, идентифицированные только в 1 типе клеток, что позволило из 1664 белков получить группу сравнения А – НСК и ОСК (1052 белка) и группу сравнения Б – ОСК и МССК (607 белков). При проведении анализа в группе сравнения А обнаружено 63,2 ± 11,5% идентичных белков, что отражает близость морфофункциональных фенотипов НСК и ОСК ГБ человека, имеющих единый источник происхождения, единую нейральноподобную дифференцировку и общую локализацию в мозге. В группе сравнения Б выявлено 36,5 ± 9,5% идентичных белков.

Далее из анализа каждой из групп сравнения были исключены все белки, у которых нормализованная сигнальная интенсивность изменилась менее чем в 2 раза. В результате в группе А осталось только 637 белков (38,28%), в группе Б – 425 белков (25,54%). Затем на основании баз данных исключили уже ранее известные белки, участвующие в канцерогенезе МГБ, роль которых доказана, что позволило сформировать некую «матрицу подобия», или особый субстрат, объединяющий нормальные стволовые клетки и ОСК. Для дальнейшего анализа выполнили разделение идентифицированных белков на функционально значимые кластеры и провели прецизионный анализ протеомных профилей сравниваемых клеточных систем.

Распределение белков на функционально значимые кластеры

Из белков групп сравнения А и Б был выделен первый кластер – «Рецепторные белки», представляющий группу протеинов, расположенных на мембранах анализируемых клеток. Всего было отобрано 105 белков, среди которых идентифицированы акцепторные белки 35 сигнальных путей.

Из оставшихся белков выделен второй кластер – «Ядерные белки», всего отобрано 146 белков. При анализе данного кластера белков установлено, что только 22 из них имели сигнальный домен на клеточной мембране.

Третий кластер – «Белки сигнальной трансдукции и межклеточной регуляции», 33 белка. При анализе данного кластера белков выявлено 16 сигнальных путей, из которых только 10 имеют сигнальный домен как в (на) мембране, так и в ядре этих клеток: сигнальный путь активации В-клеток; путь Т-клеточной активации; путь воспаления, опосредованного цитокинами; путь гликолиза; путь ангиогенеза; FAS, EGF, FGF – сигнальные механизмы; сигнальный путь фокальной адгезии; интегриновый сигнальный путь. Очевидно, это и есть фундаментальные механизмы, которые предопределяют судьбу низкодифференцированых клеток в организме человека.

Прецизионный анализ протеомных профилей сравниваемых клеток

На данном этапе обработки данных из групп сравнения А и Б были исключены протеины, участвующие в канцерогенезе ГБ, обеспечивающие быстрое воспроизводство АТФ для поддержки энергетического статуса, синтез макромолекул, работу дыхательной цепи, эффект Варбурга, и некоторые другие белки. В результате в группах осталось 34 ядерных, 53 мембранных и 10 внеклеточных белков.

Далее были исключены белки цитоскелета и эндоплазматического ретикулума. В результате в группах осталось 19 ядерных, 20 мембранных и 5 внеклеточных белков.

Далее с помощью международных баз данных провели аннотирование сигнальных путей и белок-белковых взаимодействий, что позволило идентифицировать сигнальные пути, не трансформированные в результате канцерогенеза в ОСК. Сравнение этих данных позволило установить, что не трансформированными в процессе канцерогенеза и общими для всех типов стволовых клеток являются сигнальные пути интегринов и фокальной адгезии, предопределяющие взаимодействие с внеклеточным матриксом (ВКМ).

Итак, как следует из данных первой части исследования, именно участие в процессе воспаления предопределяет судьбу стволовых клеток всех типов, при этом стратегическим условием выбора в пользу гибели или выживания низкодифференцированных клеток являются продуктивные взаимодействия с ВКМ.

Сравнительное картирование стволовых CD133⁺ и дифференцированных CD133^—-клеток глиобластомы

Протеомный анализ выявил 1990 уникальных белков в образцах CD133⁺ ОСК и CD133^— ДКГ. Всего в образце CD133⁺ ОСК идентифицирован 1891 белок, в образце CD133^— ДКГ обнаружено 1748 белков. Идентифицированные белки показали высокий процент совпадения между 2 клеточными популяциями: 1649 белков присутствовали во всех клеточных лизатах, 242 белка были обнаружены только в ОСК, и 99 белков наблюдались только в ДКГ. Среди обнаруженных белков 589 имели значительно отличающиеся уровни экспрессии в ОСК (p <0,05) по сравнению с ДКГ; 358 белков усиливали, а 231 снижали экспрессию.

Большинство идентифицированных белков имели внутриклеточную локализацию, связь с метаболическими и клеточными процессами, были функционально неоднородны и проявляли ферментативную активность (рис. 82 А—Г).