Электронная библиотека » Дженнифер Даудна » » онлайн чтение - страница 14


  • Текст добавлен: 21 апреля 2022, 16:23


Автор книги: Дженнифер Даудна


Жанр: Биология, Наука и Образование


Возрастные ограничения: +12

сообщить о неприемлемом содержимом

Текущая страница: 14 (всего у книги 20 страниц)

Шрифт:
- 100% +

Технически это непросто сделать, но в конечном счете этот подход со всеобщим наложением (ultimate multiplexing approach) позволяет исследователям редактировать и нокаутировать каждый ген в геноме – и это в рамках единственного эксперимента. Дэвид Сабатини, профессор из МТИ, был одним из первых, кто провел такой полногеномный скрининг нокаутов (genome-wide knockout screen)[212]212
  T. Wang et al., “Identification and Characterization of Essential Genes in the Human Genome”, Science 350 (2015): 1096–1101.


[Закрыть]
. Однако группа Сабатини не задавалась вопросом, какие генные мутации вызывают рак (этот вопрос исследовала группа Эберта). Сабатини хотел выявить генные мутации, делающие рак невозможным, – другими словами, определить, существуют ли гены, без мутаций в которых клетки совершенно неспособны стать раковыми. В ходе поистине виртуозной работы команда Сабатини исследовала этот вопрос для четырех различных линий злокачественно переродившихся клеток крови и обнаружила целый пласт новых генов, по-видимому играющих ключевую роль для процветания таких клеток. За счет выявления новых вариантов генетической предрасположенности к лейкозам и лимфомам эти эксперименты указали на новые перспективные мишени для химиотерапии.

Последующие исследования, проведенные в других лабораториях, обнажили слабые места других типов рака, и в числе этих типов колоректальный рак, рак шейки матки, меланома, рак яичников и глиобластома (особенно агрессивный вариант рака мозга). Ученые даже применили полногеномные поиски для определения неизвестных генетических факторов, дающих раковым клеткам страшную способность перемещаться с кровотоком и внедряться в “чужие” ткани, то есть участвовать в процессе под названием “метастазирование”.

Прогресс в нашем понимании рака может быть слишком медленным с точки зрения полезной практической информации и конкретных новых методов лечения, но важность данной работы невозможно переоценить. По мере персонализации медицины ученым и врачам приходится иметь дело со все большим количеством информации, позволяющей отличить рак у одного пациента от рака у другого, и такая информация будет давать подсказки, как подобрать схему лечения, наилучшим образом подходящую для биологии конкретного типа заболевания. Инструменты редактирования генома помогут извлечь пользу из этой информации, выявляя, какие мутации наиболее тесно связаны с раком и какие мутации могут уменьшить или увеличить восприимчивость конкретных раковых клеток к конкретным лекарствам.

Однако есть намеки на то, что редактирование генома способно быть не только инструментом разведки в борьбе человечества с раком, но и оружием. В этом плане его наиболее многообещающая роль – система поддержки формы лечения, на которую в последние годы обращают особенно много внимания: иммунотерапия. Этот революционный метод борьбы с раком отличается от трех “классических”, давно применяемых типов лечения – оперативного вмешательства, лучевой терапии и химиотерапии. В отличие от этих более старых подходов, иммунотерапия рака нацелена на использование иммунной системы самого пациента для выслеживания и поимки опасных клеток. Иммунотерапия проводится в рамках совершенно отличной от предыдущих парадигмы, и ее мишенью служат не опухоли, а тело больного: она дает пациенту силы самостоятельно бороться с раком.

Ключевая идея в основе иммунотерапии рака заключается в том, чтобы настроить иммунную систему человека, и в особенности ее главную силу – Т-клетки. Программируя эти клетки на распознавание молекулярных меток рака, ученые помогают Т-клеткам запускать иммунный ответ для уничтожения раковых клеток. Главная задача – выяснить, каким образом полностью реализовать потенциал Т-клеток.

Одна из многообещающих разработок включает ингибиторы контрольных точек – лекарства, отключающие тормоза, которые обычно ограничивают иммунный ответ на раковые клетки. В рамках другой стратегии создаются генетически модифицированные Т-клетки, которые нацеливаются точно на рак конкретного пациента. Этот процесс, представляющий собой очередной пример терапии ex vivo, известен как адоптивный перенос клеток, и именно в этой разновидности иммунотерапии на сцену выходит редактирование генома.

Основная цель адоптивного переноса клеток, или АПК, – повысить способность Т-клеток находить раковые клетки. Т-клетки наделяют новым геном, кодирующим белок, который называется рецептор и настроен распознавать молекулярные метки рака и наводить атаку на них. Но есть проблема: у Т-клеток уже имеется “природный” ген рецептора, и наличие сразу нескольких подобных генов вызовет беспорядок на молекулярном уровне. В настоящее время ученые могут избежать этого, используя CRISPR для нокаутирования “родного” гена рецептора и таким образом расчищая место под ген рецептора, способный обнаруживать рак. Затем к тем же клеткам можно применить другие варианты редактирования генов, делающие их еще более эффективными.

Представляется вероятным, что редактирование генома сделает шаг вперед и преобразует иммунотерапию рака в более простой в применении метод, когда единственную партию Т-клеток, настроенную на борьбу с конкретным видом рака, можно дать фактически всем пациентам, страдающим от данного заболевания. Сейчас проводятся клинические испытания этого варианта переноса клеток, и трогательная история, датируемая концом 2015 года, дает представление о его потрясающих возможностях. Фактически героиня этой истории Лайла Ричардс – первый человек, чья жизнь была спасена благодаря терапевтическому редактированию генома[213]213
  S. Begley, “Medical First: Gene-Editing Tool Used to Treat Girl’s Cancer”, STAT News, November 5, 2015; A. Pollack, “A Cell Therapy Untested in Humans Saves a Baby with Cancer”, New York Times, November 5, 2015.


[Закрыть]
.

В то время Лайле был год, и она страдала от острого лимфобластного лейкоза – именно эта форма рака наиболее часто встречается у детей. Врачам лондонской клиники, где лечилась Лайла, пришлось признать, что у девочки один из наиболее агрессивных видов лейкоза, которые им доводилось видеть. Хотя примерно у 98 % детей с этой болезнью после начала лечения наблюдается ремиссия, состояние Лайлы не улучшалось – несмотря на химиотерапию, пересадку костного мозга и применение препарата, основанного на антителах[214]214
  W. Qasim et al., “First Clinical Application of TALEN Engineered Universal CAR19 T Cells in B-ALL”, статья, представленная на ежегодной встрече Американского общества гематологов, Орландо, Флорида, 5–8 декабря 2015-го.


[Закрыть]
. Пересадка собственных перенастроенных клеток Лайлы обратно в ее организм тут не годилась: иммунная система девочки была настолько ослаблена лейкозом (в конце концов, этот недуг портит как раз те белые кровяные тельца, что нужны для нормальной работы иммунной системы), что у нее не хватало Т-клеток для извлечения и последующего изменения.

Положение Лайлы выглядело безрадостным, и доктора уже предложили родителям девочки паллиативный уход, чтобы облегчить предсмертные страдания. Но затем, в последнюю минуту, открылась новая возможность лечения.

В той же самой больнице, где проходила лечение Лайла, размещалась лаборатория, редактирующая Т-клетки с помощью TALEN, одной из технологий, предшествовавших CRISPR. Клетки подготавливала французская биотехнологическая компания под названием Cellectis – для использования в клинических испытаниях. Получив разрешения от родителей Лайлы и Cellectis, врачи первыми применили эти непроверенные клетки для лечения живого человека. Подобное разрешается в исключительных обстоятельствах.

Т-клетки, которые получила Лайла, были в некотором смысле особенными. Во-первых, они несли новый ген рецептора, специально настроенного так, чтобы он выявлял любые клетки, содержащие молекулярные метки лейкоза. Во-вторых, геном Т-клеток был отредактирован таким образом, чтобы Т-клетки не запускали иммунный ответ против собственных клеток Лайлы, что было бы неизбежно, не будь они отредактированы (донор и реципиент в данном случае не были иммуносовместимыми). Наконец, в геном Т-клеток были внесены поправки, делавшие их “невидимыми” для местных иммунных клеток, благодаря чему они могли дольше выживать в теле Лайлы.

В течение нескольких недель после введения клеток в организме годовалой девочки произошли чудесные изменения: ее лейкоз начал реагировать на присутствие отредактированных Т-клеток. Лайле снова провели пересадку красного костного мозга, когда ее здоровье улучшилось достаточно, и через несколько месяцев уже наблюдалась стабильная ремиссия. То, что началось как очень рискованное предприятие – тестирование метода лечения, который до этого проверяли только на мышах, – обернулось ошеломительным успехом и весомым свидетельством в пользу применения редактирования генома в новых средствах для иммунотерапии.

Благодаря случаю Лайлы (и некоторым другим) компании по производству средств CRISPR-терапии уже заключили с производителями средств иммунотерапии масштабные договоры о совместных разработках. Editas Medicine получила от Juno Therapeutics исключительные права на разработку препаратов для Т-клеточной терапии, а Intellia Therapeutics объединила усилия с гигантом здравоохранения Novartis, чтобы подобным же образом развивать иммунотерапию рака. Национальные институты здравоохранения одобрили первые в США клинические испытания CRISPR-отредактированных клеток, проведенные учеными из Пенсильванского университета, и в октябре 2016-го группа китайских исследователей из Сычуаньского университета впервые сделала людям инъекции клеток, модифицированных с помощью CRISPR[215]215
  D. Cyranoski, “CRISPR Gene-Editing Tested in a Person for the First Time”, Nature News, November 15, 2016.


[Закрыть]
. Эти похвальные начинания помогут открыть доступ к положительным эффектам от редактирования генов тем пациентам, кто в них нуждается.

Я искренне надеюсь, что история Лайлы однажды перестанет быть исключительной и превратится просто в один из множества примеров спасения человеческой жизни в результате прорывов в редактировании генома. Определенно, мы потихоньку движемся к этому светлому будущему. Однако прежде чем мы окажемся там, нам нужно будет решить одну большую проблему редактирования генома. До тех пор пока эта проблема – проблема точности поправок, вносимых CRISPR, – не будет решена, случай Лайлы и подобные ему не смогут из исключений превратиться в правило.


CRISPR – по крайней мере, его изначальная версия, которой обладают прокариоты, – не стопроцентно точный метод разрезания ДНК. Это было очевидно еще при проведении самых первых экспериментов с CRISPR в моей лаборатории.

После определения основной функции CRISPR Мартин приступил к измерению точности разрезающего ДНК фермента Cas9 и его направляющей РНК. Казалось, что этот крошечный самонаводящийся снаряд способен находить и атаковать любые последовательности ДНК, совпадающие с его направляющей РНК, выслеживая их с впечатляющей точностью. Но есть ли пределы его точности? Действительно ли может CRISPR отличать одну двадцатибуквенную последовательность – ту, что подходит его РНК, – от остальных последовательностей, которые, вероятно, отличаются от этой всего на одну-две “буквы” ДНК? Чтобы появилась хоть какая-то надежда на превращение этой бактериальной системы защиты в достаточно безопасное для использования на людях средство редактирования генома, требовалось прежде всего ответить на этот вопрос.

Мартин обнаружил, что, когда он “спустил” CRISPR-систему на последовательности ДНК, в которых некоторые “буквы” были специально заменены на неправильные и больше не подходили РНК, фермент Cas9 в ряде случаев все же разрезал ДНК[216]216
  M. Jinek et al., “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”, Science 337 (2012): 816–821.


[Закрыть]
. Выходило, что CRISPR порой может совершать ошибки и путать одни “буквы” ДНК с другими, – да, точность функции поиска на компьютере явно выше: она не выдаст вам документы со словом “эффект” вместо запрошенных файлов со словом “аффект”.

Позже мы совместно с коллективом ученых из Гарвардского университета под руководством Дэвида Лю повторили эти эксперименты гораздо тщательнее[217]217
  V. Pattanayak et al., “High-Throughput Profiling of Off-Target DNA Cleavage Reveals RNA-Programmed Cas9 Nuclease Specificity”, Nature Biotechnology 31 (2013): 839–843.


[Закрыть]
. Мы провели исчерпывающее тестирование различных мутаций ДНК, чтобы определить, какие нецелевые (то есть не совпадающие с направляющей РНК) последовательности достаточно похожи на целевую последовательность (совпадающую с направляющей РНК), чтобы их обнаружил и вырезал CRISPR. Другие лаборатории тоже проводили похожие эксперименты в клетках[218]218
  Y. Fu et al., “High-Frequency Off-Target Mutagenesis Induced by CRISPR-Cas Nucleases in Human Cells”, Nature Biotechnology 31 (2013): 822–826; P. D. Hsu et al., “DNA Targeting Specificity of RNA-Guided Cas9 Nucleases”, Nature Biotechnology 31 (2013): 827–832.


[Закрыть]
, чтобы показать, каким образом сделанные CRISPR ошибочные надрезы могут привести к перманентным изменениям ДНК в тех местах, куда их не предполагалось вносить.

Само собой, буквально все медицинские препараты обладают какой-либо нецелевой активностью – и до тех пор, пока эти риски перевешивает польза от целевых эффектов, врачи и регуляторы в целом весьма снисходительны. К примеру, антибиотики уничтожают и патогенные, и полезные штаммы бактерий, а препараты для химиотерапии убивают и раковые клетки, и здоровые. Но в случае CRISPR проблема в специфичности: тут речь о разработке лекарства, которое настолько точно нацелено на свою предполагаемую мишень, что изменение положения всего нескольких атомов ослабит взаимодействие в такой степени, что лекарство не будет давать побочных эффектов.

Какая-то нецелевая активность всегда неизбежна (и поэтому в инструкции к любому лекарству есть пункт о побочных эффектах), но если речь идет о редактировании генома, то эти побочные эффекты могут быть особенно опасными. В конце концов, побочные эффекты от лекарства обычно проходят, когда пациент прекращает его прием, – однако в случае редактирования генома любая нецелевая последовательность ДНК, будучи однажды отредактирована, изменится необратимо. Непреднамеренные изменения ДНК не только сохраняются навсегда, но и будут скопированы в каждую клетку-потомка изначальной клетки. И хотя большая часть случайных изменений вряд ли нанесет повреждения клетке, но – если мы правильно понимаем результаты исследований некоторых разновидностей рака и других заболеваний, – даже одной мутации может быть достаточно, чтобы нанести серьезный ущерб организму.

К счастью, нецелевые правки ДНК, внесенные CRISPR (как и другими технологиями редактирования генома), чаще всего весьма предсказуемы, поскольку они появляются только в последовательностях ДНК, наиболее сходных с соответствующей направляющей РНК. Если CRISPR запрограммирован на обнаружение 20-буквенной последовательности в гене X, но ген Y содержит сходную последовательность, отличающуюся лишь на одну “букву”, есть определенная вероятность, что CRISPR внесет правки в оба гена. Чем меньше две последовательности похожи друг на друга, тем ниже вероятность появления нецелевых мутаций.

Исследователи уже начали искать окружные пути, позволяющие обойти эту потенциальную трудность. Во многих лабораториях были написаны компьютерные алгоритмы, автоматически проверяющие состоящий из трех миллиардов “букв” человеческий геном: сколько его участков несут в себе последовательность, близкую к той, которую собираются отредактировать ученые. Если число нецелевых последовательностей ДНК, которые могут быть затронуты, слишком велико, то исследователь при помощи алгоритма сможет выбрать в качестве мишени другой участок (во многих случаях ученые могут редактировать один и тот же ген, выбрав из нескольких близко расположенных последовательностей ДНК). Впрочем, недостаток этого подхода в том, что компьютерный алгоритм – независимо от того, насколько хорошо он написан, – не всегда может успешно предсказать нецелевые правки.

Эти “известные неизвестные” заставили исследователей прибегнуть ко второй стратегии: по умолчанию исходить из того, что не известно вообще ничего. Они полагают, что каждая версия CRISPR неизбежно продемонстрирует нецелевые эффекты и единственный способ обнаружить их – сначала просто провести эксперимент, а затем уже разыскивать новые мутации в местах, где их не должно быть. Вместо предсказаний на основе компьютерных вычислений эта стратегия предполагает простую эмпирическую проверку. Прежде чем выбирать последовательность ДНК для редактирования у пациентов, ученые в рамках этой стратегии проводят исчерпывающую проверку нескольких близких последовательностей ДНК в культуре клеток, определяют, какие из них дадут наименьшее количество нецелевых “срабатываний” CRISPR, и только потом – когда определится “победитель” – приступают к клиническим испытаниям.

Существует и третья стратегия избегания потенциальных нецелевых мутаций, и в ней ученые уже добились значительных успехов: настройка CRISPR таким образом, чтобы он четко отличал целевую ДНК от других. К примеру, удалось успешно расширить последовательность нуклеотидов ДНК, которую CRISPR требуется распознать, уменьшив вероятность несовпадений, – нечто подобное вы делаете, удлиняя пароль, чтобы снизить вероятность, что кто-нибудь его подберет. За счет одного лишь изменения оригинальной версии белка Cas9 в нескольких различных местах – замены одних аминокислот на другие – исследователи, в том числе Кит Джоунг из Гарвардской медицинской школы и Фэн Чжан из МТИ, разработали высокоточные версии CRISPR[219]219
  F. Urnov, “Genome Editing: The Domestication of Cas9”, Nature 529 (2016): 468–469.


[Закрыть]
, менее склонные к нецелевому редактированию генома, чем версия той же системы, созданная самой природой.

Наконец, размер введенной дозы CRISPR влияет на вероятность появления в геноме непредвиденных мутаций. В целом чем больше молекул Cas9 и направляющей РНК получает клетка и чем дольше они в ней находятся, тем выше вероятность, что CRISPR обнаружит близкие, но все же иные последовательности и внесет нецелевые правки. Фокус в том, чтобы ввести в клетки ровно столько CRISPR, чтобы он отредактировал только нужные фрагменты ДНК, и не более того.

Оттачивая этот метод в лаборатории, исследователи продолжают работу, дабы убедиться, что CRISPR можно безопасно вводить пациентам. Если достигнутое ими что-нибудь значит, то пройдет не слишком много времени, прежде чем точность этой молекулярной машины станет приемлемой для ее применения в клинике – а не только в лаборатории.


Технология CRISPR появилась всего несколько лет назад, но уже сейчас непросто найти заболевание, которое не предлагали лечить с ее помощью. Помимо рака, ВИЧ-инфекции и уже упомянутых генетических заболеваний, быстрый поиск по опубликованным научным статьям выдает непрерывно растущий список болезней, потенциальные методы избавления от которых были разработаны с помощью CRISPR: ахондроплазия (карликовость), хронический гранулематоз, болезнь Альцгеймера, врожденная тугоухость, боковой амиотрофический склероз (БАС), высокое содержание холестерина в крови, диабет, болезнь Тея – Сакса, заболевания кожи, синдром ломкой X-хромосомы и даже бесплодие. Практически во всех случаях, когда конкретную мутацию или дефектную последовательность ДНК можно связать с патологией, CRISPR в принципе может обратить мутацию или заменить поврежденный ген на “здоровую” последовательность нуклеотидов.

Благодаря легкости, с которой CRISPR находит и “чинит” любую последовательность ДНК, этот инструмент часто называют “прорывом, благодаря которому болезни исчезнут с лица Земли”. Но не все так просто. Существует множество недугов – от аутизма до болезней сердца, – у которых нет четко выраженной генетической подоплеки или же они вызваны сложным сочетанием генетических факторов и условий окружающей среды. В этих случаях редактирование генома не слишком поможет. Кроме того, даже если редактирование генома способно “починить” ДНК в культурах клеток человека, пройдут годы, прежде чем его эффективность (или неэффективность) будет показана в клинике. А несколько успешных клинических испытаний (в комбинации с иммунотерапией рака и в лечении ВИЧ) еще не гарантируют, что на этом пути будут достигнуты и дальнейшие успехи.

Более ранние технологии генной инженерии, включая генную терапию и РНК-интерференцию, тоже (как впоследствии CRISPR) превозносились как знаковые прорывы, которым суждено полностью преобразить медицину, – однако сотни неудачных клинических испытаний заметно охладили этот энтузиазм. Я не говорю, что нас ждет аналогичный “холодный душ” и в случае редактирования генома, я лишь напоминаю, что важно отличать ажиотаж от реалистичных ожиданий, методических исследований и тщательно проведенных клинических испытаний. Только при этом условии мы будем уверены, что первая волна средств CRISPR-терапии имеет максимальные шансы на успех и минимальный риск опасных побочных эффектов.

Когда я пишу эти строки, эти средства, основанные на редактировании генома, развиваются с небывалой скоростью – и это касается как фундаментальных исследований, так и коммерческих разработок. Новые работы появляются c частотой примерно пять публикаций в день, а инвесторы уже вложили существенно больше миллиарда долларов в разнообразные стартапы, связанные с основанными на CRISPR биотехнологическими инструментами и терапевтическими средствами.

Я невероятно радуюсь любым успехам в области CRISPR (а они феноменальны) и каждый раз настроена оптимистично, когда узнаю об очередном таком успехе, – за исключением лишь одной области применения этой технологии. Я считаю, что нам следует воздержаться от использования CRISPR для необратимого редактирования геномов будущих поколений людей – по крайней мере до тех пор, пока мы не обдумаем как следует все проблемы, которые могут возникнуть при редактировании генома клеток зародышевого пути. Пока у нас не будет четкого понимания всех проблем безопасности и этических проблем, пока мы не позволим присоединиться к обсуждению этих проблем максимальному числу заинтересованных лиц, ученым лучше не трогать клетки зародышевого пути. Но на самом деле еще большой вопрос, достигнем ли мы вообще когда-нибудь достаточного морального и интеллектуального уровня, чтобы управлять судьбой собственного генофонда, – и я думаю над этим вопросом с тех пор, как начала понимать, на что способен CRISPR. По этой и по ряду других причин я провожу четкую границу между процедурами, описанными в этой главе, – и тем, что может быть использовано в редактировании геномов клеток зародышевого пути. Стоит подумать дважды, прежде чем пересекать эту границу. А потом подумать еще раз.


Страницы книги >> Предыдущая | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 | Следующая
  • 4 Оценок: 5

Правообладателям!

Это произведение, предположительно, находится в статусе 'public domain'. Если это не так и размещение материала нарушает чьи-либо права, то сообщите нам об этом.


Популярные книги за неделю


Рекомендации