Текст книги "Трещина в мироздании"

В 1917 году, спустя два года после публикации статьи Туорта, вирусы бактерий заново открыл канадский врач Феликс д’Эрелль. Во время Первой мировой войны д’Эрелль служил во Франции, и ему поручили расследовать причину вспышки дизентерии, которая косила солдат одного из кавалерийских эскадронов. Стремясь выяснить, почему одни больные выздоравливают, а другие нет, д’Эрелль взял у пациентов образцы кала и подверг их обстоятельному, хотя и достаточно грубому анализу. Сначала он пропустил кровянистый стул своих подопечных через мелкоячеистый фильтр, чтобы удалить из него все твердые частицы – включая бактерии. Затем д’Эрелль налил немного отфильтрованной жидкости на культуры бактерий рода Shigella, вызывающих дизентерию. На следующий день он с удивлением обнаружил, что одна из культур заразных бактерий под фекальной жидкостью “растворилась подобно сахару в воде” – исчезла буквально за ночь[50]50
  D. H. Duckworth, “Who Discovered Bacteriophage?”, Bacteriological Reviews 40 (1976): 793–802.


[Закрыть]. Что еще интереснее, когда д’Эрелль поспешил в госпиталь узнать о состоянии пациента, у которого был взят этот образец кала, он обнаружил, что больному заметно лучше. Сопоставив эти факты, д’Эрелль заключил, что возбудителя дизентерии уничтожил некий паразит, которого ученый назвал бактериофагом (“пожирателем бактерий”); эта форма жизни должна была быть достаточно маленького размера, чтобы пройти через фильтр. Судя по всему, “бактериофаг” заражал бактерии фактически так же, как другие вирусы инфицировали растения или животных.

В последующие годы было открыто множество бактериофагов, или, сокращенно, фагов, и выяснилось, что каждый из них поражает свой конкретный вид бактерий. По мере накопления знаний о новых разновидностях фагов увеличивался ажиотаж вокруг так называемой фаговой терапии – идеи о том, что бактериофагов можно использовать для лечения микробных инфекций. Хотя некоторым ученым претила идея вводить живые вирусы в организм человека, клинические испытания показывали, что фаги “не замечают” человеческие клетки и видимых побочных эффектов у фаговой терапии нет. В 1923 году д’Эрелль помогал советским ученым организовать институт в Тбилиси[51]51
  Институт бактериофагов в Тбилиси основал Георгий Григорьевич Элиава в 1923 году. Д’Эрелль приехал туда значительно позже – в 1934-м. Тем не менее в 1923-м двое ученых уже были знакомы.


[Закрыть], исследования в котором были посвящены бактериофагам; во времена своего расцвета учреждение насчитывало более тысячи сотрудников, производящих тонны фагов в год для клинического использования[52]52
  C. Zimmer, A Planet of Viruses. Chicago: University of Chicago Press, 2011. Книга переведена на русский: Карл Циммер. Планета вирусов / Пер. А. Рангулова. Ростов-на-Дону: Феникс, 2012.


[Закрыть]. В некоторых уголках мира фаговую терапию используют и по сей день – в Грузии в настоящее время фаги назначают при бактериальных инфекциях примерно в 20 процентах случаев[53]53
  G. Naik, “To Fight Growing Threat from Germs, Scientists Try Old-fashioned Killer”, Wall Street Journal, January 22, 2016.


[Закрыть]. Однако после того как в 1930-х были открыты антибиотики (а в 1940-х началось их массовое производство), этот способ терапии был быстро забыт, особенно на Западе.

Хотя бактериофаги нашли лишь ограниченное применение в медицине, для генетиков они стали настоящим подарком судьбы. К тому моменту, когда ученые с помощью новых электронных микроскопов с большим увеличением смогли впервые увидеть фагов (это случилось в 1940–1950-е годы), эти вирусы вкупе с бактериями-жертвами уже предоставили очередное доказательство дарвиновской теории естественного отбора. Они помогли установить, что именно ДНК, а не белки, служит “молекулой наследственности” в клетках. Тот факт, что генетический код триплетен (то есть каждые три “буквы” ДНК обозначают одну аминокислоту в белке), был впервые продемонстрирован на примере фагов; эксперименты с последними позволили также выяснить, как “включаются” и “выключаются” гены внутри клетки. Даже открытие Джошуа Ледерберга (он обнаружил, что вирусы могут вносить чужеродные гены в инфицированные ими клетки, и это стало одним из ранних подступов к генной терапии) было сделано благодаря фагу, специализирующемуся на бактериях рода Salmonella. Во многом именно эксперименты с вирусами бактерий заложили основы молекулярной генетики.

Кроме того, изучение фагов послужило толчком к революции в молекулярной биологии 1970-х годов. Исследуя иммунные механизмы, с помощью которых бактерии дают отпор фаговым инфекциям, ученые обнаружили класс ферментов, называемых эндонуклеазами рестрикции; их можно “настроить” таким образом, чтобы они разрезали фрагменты искусственно синтезированной ДНК (это было показано в простых экспериментах вне живых объектов). Используя сочетание этих ферментов с другими ферментами, выделенными из инфицированных фагами клеток, исследователи сумели создать и клонировать искусственные молекулы ДНК в лабораторных условиях. Одновременно с этим геномы фагов послужили прекрасной мишенью для только что разработанных технологий секвенирования ДНК. В 1977 году Фред Сенгер и его коллеги успешно определили последовательность всех нуклеотидов ДНК в геноме фага ФX174. Двадцать пять лет спустя тот же фаг снова оказался в центре внимания: он стал первым объектом, чей геном был синтезирован с нуля[54]54
  G. P. C. Salmond and P. C. Fineran, “A Century of the Phage: Past, Present and Future”, Nature Reviews Microbiology 13 (2015): 777–786.


[Закрыть].

Впрочем, бактериофаги – это не просто популярные “подопытные кролики”. Это еще и наиболее многочисленные биологические объекты на планете – и по этому показателю они лидируют с большим отрывом. Фаги в природе так же вездесущи, как свет и почва, и их можно найти в грязи, воде, человеческом кишечнике, горячих источниках, ледяных кернах и практически во всех других местах, где возможна жизнь. Ученые оценивают численность бактериофагов на Земле в 10³¹ вирусных частиц – десять миллионов триллионов триллионов, или единица с 31 нулем. В одной чайной ложке морской воды в пять раз больше фагов, чем в Нью-Йорке людей. Невероятно, но фагов на планете намного больше, чем бактерий, которые они могут инфицировать; столь же вездесущие, как и микроорганизмы, бактериофаги превышают численность последних на порядок. Они вызывают примерно триллион триллионов инфекций по всему миру каждую секунду, а если брать только океан, то там ежедневно от смертоносного заражения фагами погибает около 40 % всех бактерий[55]55
  F. Rohwer et al., Life in Our Phage World (San Diego: Wholon, 2014).


[Закрыть].

Эти вирусы созданы для убийства: в течение миллиардов лет они эволюционировали, чтобы научиться заражать бактерии с беспощадной эффективностью. Все фаги состоят из прочной белковой наружной оболочки, называемой капсидом, в которую упакован генетический материал. Фаговый капсид может иметь одну из десятков разнообразных форм, и все они спроектированы таким образом, чтобы максимально эффективно защищать геном вируса и успешно переносить его генетический материал в бактериальные клетки, где тот способен размножаться и распространяться. Некоторые фаги имеют изящную икосаэдрическую форму, у других длинный хвост присоединяется к шарообразному капсиду. Нитевидные фаги цилиндрические. Возможно, самые устрашающие из этих вирусов – те, что похожи на инопланетные корабли, с “ногами” для закрепления на поверхности клетки, “головой”, в которой хранится ДНК[56]56
  Даудна, вероятнее всего, описывает строение фага лямбда, геном которого представлен молекулой ДНК. Однако бактериофаги вместо ДНК могут содержать и РНК, что в тексте не указано.


[Закрыть], и “насосами”, впрыскивающими эту ДНК в клетку после того, как фаг закрепится снаружи.

Примеры различных бактериофагов

Методы работы вирусов, как и их внешний вид, разнообразны, но неизменно (и смертоносно) эффективны. Некоторые вирусные геномы упакованы в капсид так плотно, что генетический материал под давлением буквально выстреливает в клетку, словно пробка от шампанского, как только нарушается целостность белковой клеточной оболочки. Сразу после того, как геном вируса попал в клетку, он способен захватить контроль над клеткой-хозяином одним из двух способов. При паразитическом, или лизогенном, жизненном цикле геном вируса внедряется в геном хозяина и в таком виде, никак себя не проявляя, может передаваться из поколения в поколение, ожидая подходящего момента для нападения. Напротив, при инфекционном, или литическом, жизненном цикле геном вируса сразу же захватывает ресурсы клетки-хозяина, заставляя их работать на себя: производить вирусные белки вместо микробных и многократно копировать геном фага до тех пор, пока клетка не лопнет от распирающих ее вирусных частиц, разбросав последние на соседние бактерии. С помощью этого цикла внедрения в клетку, захвата контроля над ней и распространения по ее потомкам или соседям один-единственный фаг может полностью уничтожить целую популяцию бактерий за считанные часы.

Но бактерии не так уж беспомощны в этой старой как мир войне. Точно так же как растения и животные, за миллиарды лет эволюции они выработали впечатляющие стратегии защиты. К моменту нашего разговора с Джилл у бактерий уже были открыты четыре основные защитные системы[57]57
  S. J. Labrie, J. E. Samson, and S. Moineau, “Bacteriophage Resistance Mechanisms”, Nature Reviews Microbiology 8 (2010): 317–327.


[Закрыть]. В рамках наиболее выдающейся из них бактерии “навешивают” на свой геном уникальные метки, немного меняющие химические свойства ДНК, но не меняющие экспрессию генетической информации. В дополнение к этому бактерии производят ферменты (эндонуклеазы рестрикции), которые разрезают любую ДНК, не несущую таких меток, зачищая клетку ото всех фаговых генов, проникших под ее оболочку. Также бактерии способны попросту заблокировать фаговой ДНК путь внутрь себя – либо заделывая отверстия, проделанные этими вирусами, в результате чего последние не могут ввести ДНК в клетку, либо делая неузнаваемыми белки на своей поверхности, к которым в обычных условиях прикрепляются фаги. У бактерий даже развилась способность чувствовать наступающую инфекцию и “совершать самоубийство” до распространения заразы – самоотверженный способ защитить остальные клетки в сообществе.

Литический жизненный цикл бактериофага

Может ли CRISPR быть еще одним механизмом антивирусной защиты? Чем больше я читала о гонке вооружений между бактериями и бактериофагами, тем более вероятным мне казалось существование других, еще не открытых, орудий, которые они используют в борьбе друг с другом.

Более того, узнавая все больше о CRISPR, я начинала понимать, в каком направлении будут двигаться исследования в нашей лаборатории, если мы примем предложение Джилл. Расчеты голландца Рююда Янсена и его коллег[58]58
  R. Jansen et al., “Identification of Genes That Are Associated with DNA Repeats in Prokaryotes”, Molecular Microbiology 43 (2002): 1565–1575.


[Закрыть] – это они в 2002-м предложили аббревиатуру CRISPR – выявили набор генов, которые в бактериальных хромосомах почти всегда примыкали к участкам с CRISPR. Они разительно отличались и от повторяющихся последовательностей, и от спейсеров в CRISPR.

Даже то немногое, что мы тогда знали об этих ассоциированных с CRISPR генах, или cas-генах, подсказывало, что они представляют собой нечто крайне интересное. Сравнение их строения со строением уже известных генов позволило предположить, что cas-гены кодируют специализированные ферменты, в чьи функции может входить разделение двух цепочек двойной спирали ДНК или разрезание молекул РНК либо ДНК, как у эндонуклеаз рестрикции (последние режут только ДНК).

Учитывая, насколько полезным оказалось открытие эндонуклеаз рестрикции для развития технологии рекомбинантных ДНК в 1970-е годы, казалось весьма вероятным, что при более глубоком изучении разных аспектов работы CRISPR мы обнаружим целый клондайк новых ферментов – и эти белки тоже будут иметь значительный биотехнологический потенциал.

Вот так все это и случилось. Я оказалась на крючке.

Учеными, которые занимаются фундаментальными исследованиями, движут азарт, любопытство, интуиция и упорство – но вдобавок к этим возвышенным качествам нам необходима здоровая доза практичности. Это и банальные поиски финансирования, и непрерывное решение вопросов управления. Те из нас, кто руководит собственными лабораториями, вынуждены делегировать другим ученым множество задач, которые мы прекрасно умеем выполнять самостоятельно. Часто это означает, что каждый раз, когда мы приступаем к новому для нас направлению исследований, нам нужно найти подходящего человека, который отвечал бы за этот участок.

По счастью, моя лаборатория в Беркли получала довольно хорошее финансирование, но когда Джилл рассказала мне о CRISPR, никто из моих сотрудников не был достаточно квалифицирован для того, чтобы взять на себя этот новый, непредсказуемый и потенциально рискованный проект. И тут нам повезло: на собеседование на вакансию постдока пришел Блейк Виденхефт. Когда я спросила молодого претендента на вакансию, над чем он хотел бы работать, то, к своему восхищению, получила в ответ встречный вопрос: “А вы слышали когда-нибудь о CRISPR?” Я тут же взяла Виденхефта на работу. Всего несколько месяцев спустя Блейк обжился в Беркли и самозабвенно работал над успешным запуском проекта по изучению CRISPR.

Дружелюбный и располагающий к себе уроженец Монтаны, впитавший вместе с любовью к спортивным играм присущий им дух соперничества, Блейк приехал в Беркли из Бозмена, из Университета штата Монтана, где он получил и высшее образование, и степень доктора философии. В отличие от большинства исследователей, которых мне приходилось брать на работу до него (все они специализировались на биохимии или структурной биологии), Блейк был прирожденным микробиологом. Подобно Джилл, часть своих исследований он проводил в лаборатории, а часть – собирая образцы в полевых условиях. Работа над докторской диссертацией заносила его и в Йеллоустонский национальный парк, и в Россию, на Камчатку, где в кислотной воде горячих источников он обнаружил ранее неизвестные вирусы, способные выживать и сохранять способность к заражению при температурах выше 75 °C. Стало известно, что эти вирусы инфицируют архей – одноклеточные организмы, похожие на бактерии; в геноме почти у каждой археи есть CRISPR. После секвенирования геномов двух выделенных им вирусов Блейк обнаружил, что значительная часть ДНК у них совпадает. Это означало, что у вирусов должен был быть общий предок – несмотря на огромное расстояние, отделяющее Йеллоустон от Камчатки. Геномы вирусов также содержали ответы на вопрос, каким образом они заражают своих хозяев; анализируя конкретные вирусные гены, Блейк вычислил, какой именно фермент, скорее всего, давал вирусам возможность встраивать фрагменты своих геномов в ДНК ничего не подозревающих хозяев.

Именно такого рода “расследование” нам надо было провести в отношении CRISPR – только в обратную сторону. Вместо того чтобы сконцентрироваться на вирусных генах, обеспечивающих инфицирование, нам необходимо было выследить те гены в бактериях, которые препятствуют заражению – и ассоциированы с CRISPR. Или гены, которые, как мы считаем, препятствуют заражению. Мы в то время еще не были уверены, что именно обеспечивает этот эффект – cas-гены или сам CRISPR.

Большая часть наших ранних обсуждений вращалась вокруг привлекательной гипотезы, согласно которой CRISPR и cas-гены представляют собой части одной системы иммунной защиты от вирусов и РНК используется в этой системе для обнаружения последних. Но гипотеза – лишь первый этап любого обстоятельного научного исследования. Так что нам нужно было еще проверить эту гипотезу и собрать сведения, подтверждающие или опровергающие ее.

На встречах с Джилл и несколькими заинтересованными учеными в Национальной лаборатории имени Лоуренса всего в нескольких минутах ходьбы от моего кабинета в Беркли мы с Блейком размышляли, как нам организовать наши эксперименты. Главный вопрос заключался в том, какой модельный организм нам использовать. В качестве одного из вариантов мы рассматривали Sulfolobus solfataricus, архею, которую впервые выделили из воды горячих источников вулкана Сольфатара рядом с Неаполем. Известно было, что ее клетки содержат CRISPR и что их поражают вирусы, обнаруженные Блейком в Йеллоустоне и на Камчатке, – что было удобно, поскольку Блейк был хорошо знаком с этими формами.

Другим “кандидатом” выступала кишечная палочка Escherichia coli, которую часто называют просто E. coli. Наиболее хорошо изученный на данный момент вид бактерий, E. coli подвержена заражению десятками одинаково хорошо изученных фагов, многие из которых можно просто заказать в интернете. (Также E. coli принадлежит честь быть первой бактерией, у которой определили последовательность CRISPR[59]59
  Y. Ishino et al., “Nucleotide Sequence of the Iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product”, Journal of Bacteriology 169 (1987): 5429–5433.


[Закрыть].) В дополнение к этому Блейк предложил Pseudomonas aeruginosa, патогенную бактерию, которая, как было известно, устойчива ко многим антибиотикам и несет в себе CRISPR. Мы знали, что сможем манипулировать ДНК P. aeruginosa, используя разнообразные инструменты генной инженерии, и что эту бактерию инфицируют многочисленные фаги (Блейк провел некоторое время в поисках новых фагов Pseudomonas, но не в экзотических местах вроде Йеллоустона, а на местных канализационных очистных сооружениях области залива Сан-Франциско).

Блейк четко дал мне понять, что он хочет сфокусироваться на изучении биохимии и структурной биологии во время работы в моей лаборатории, и ему не терпелось приступить к научной работе в новом направлении. Перед исследованиями CRISPR он очистил белки семейства Cas, закодированные в геноме P. aeruginosa, и стал проверять их на способность каким-либо образом распознавать или разрушать вирусную ДНК, начав с наиболее распространенного из них – белка Cas1. Затем (это было в 2007 году, примерно в то же время, когда Блейк начал работать в моей лаборатории) Джилл сообщила нам, что скоро будет опубликована важная статья исследователей из Danisco – датской биотехнологической компании и одновременно одного из ведущих мировых производителей пищевых ингредиентов. В своем исследовании они с помощью генетических методов показали, что CRISPR действительно представляет собой бактериальную иммунную систему[60]60
  R. Barrangou et al., “CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes”, Science 315 (2007): 1709–1712.


[Закрыть] – хотя спектр ее возможностей на тот момент оставался неизвестным.

Предметом исследования ученых из Danisco была ферментирующая молоко бактерия под названием Streptococcus thermophilus, один из ключевых пробиотиков, используемых в производстве йогурта, сыра моцарелла и бесчисленного множества других молочных продуктов. Человечество поглощает существенно больше миллиарда триллионов клеток живых S. thermophilus в год, и годовая рыночная стоимость культур этих бактерий превышает сорок миллиардов долларов[61]61
  A. Bolotin et al., “Complete Sequence and Comparative Genome Analysis of the Dairy Bacterium Streptococcus thermophilus”, Nature Biotechnology 22 (2004): 1554–1558.


[Закрыть]. Вероятно, не стоит удивляться, что эти масштабные инвестиции в молочную промышленность постоянно находятся под угрозой фаговых инфекций – наиболее распространенной причины потерь продукции и неполного брожения. В одной капле сырого молока содержится от десятка до тысячи вирусных частиц, что делает полное уничтожение фагов в нем просто невозможным. Компании, подобные Danisco, пытались бороться с фагами, совершенствуя технологии очистки молока и оборудование фабрик, а также принимая другие меры, – но проблему так и удалось решить[62]62
  M. B. MarcÓ, S. Moineau, and A. Quiberoni, “Bacteriophages and Dairy Fermentations”, Bacteriophage 2 (2012): 149–158.


[Закрыть].

Работая совместно с Филиппом Хорватом и его командой из французского филиала Danisco, группа исследователей под руководством Родольфа Баррангу из американского филиала компании изучала S. thermophilus в попытках найти решение. Родольф и Филипп задумались над тем, что делает некоторые штаммы S. thermophilus более устойчивыми к фаговым инфекциям по сравнению с другими. В молочной промышленности уже начали применять линии мутантных бактерий, менее восприимчивых к бактериофагам, но Родольф и Филипп подозревали, что участки CRISPR в геноме S. thermophilus могут обеспечивать бактерии иммунитетом такого типа, что он окажется даже более сильным, чем случайные мутации у упомянутых штаммов.

Последовательности CRISPR у S. thermophilus, как было известно Родольфу и Филиппу, обладают определенными необычными свойствами, которые можно было бы использовать в экспериментальной работе. Александру Болотину удалось обнаружить некоторые из этих свойств, когда он секвенировал геном S. thermophilus; позднее Болотин сосредоточился на изучении ДНК CRISPR и в конце концов проанализировал более двадцати различных штаммов. В ходе этой работы он заметил, что, хотя повторяющиеся последовательности CRISPR (заштрихованные черным ромбики на рисунке Джилл) всегда были одинаковыми, спейсерные последовательности (пронумерованные квадратики на том же рисунке) у представителей разных штаммов заметно отличались. Более того, многие из этих спейсеров фактически совпадали с участками фаговых геномов, секвенированными незадолго до этого. (Результаты работы Болотина обобщены в одной из трех статей 2005 года, которые Джилл показывала мне в кафе Free Speech Movement.) Главный вывод из статьи Болотина таков: штаммы S. thermophilus, в CRISPR которых было больше таких спейсеров, оказались более устойчивыми к заражению фагами. Хотя было не особенно понятно, какое это имеет значение, казалось, что бактерии неким образом модифицируют свою ДНК в составе CRISPR, имитируя геномы определенных фагов и совершенствуя собственную иммунную систему – если предположить, что CRISPR является таковой, – чтобы эффективнее бороться с этими вирусами.

Основываясь на работе Болотина, Родольф и Филипп спланировали эксперименты для проверки этого предположения. Действительно ли штамм S. thermophilus способен повышать свою устойчивость к конкретному бактериофагу, вставляя себе в область CRISPR новые фрагменты ДНК, совпадающие с последовательностями ДНК этого фага?

В своих опытах исследователи из Danisco сосредоточились на штамме S. thermophilus, который широко используется в молочной промышленности, и на двух вирулентных фагах, выделенных из образцов фабричного йогурта. Основой методики послужили простейшие генетические эксперименты – подобные проводили с начала XX столетия. Ученые заражали популяции бактерий в отдельных пробирках двумя фагами, инкубировали их 24 часа, а затем проверяли, остались ли в этих культурах живые бактерии, высевая их в чашки Петри и оставляя их на ночь расти. Было обнаружено, что, хотя фаги уничтожили более 99,9 % бактерий, девять новых, мутировавших штаммов S. thermophilus, видимо, были устойчивы к заражению фагами.

В этой части исследования Danisco не было ничего принципиально нового, поскольку другие ученые тоже использовали сходные методы для обнаружения резистентных к фагам штаммов S. thermophilus. Но Родольф и Филипп пошли дальше. Они попытались выяснить, что именно на уровне генов обеспечивает бактериям эту наблюдаемую неуязвимость.

У Родольфа и Филиппа была одна догадка по поводу того, какая часть бактериального генома делала мутировавшие штаммы S. thermophilus устойчивыми к заражению вирусами: они подозревали, что за это отвечает CRISPR, и предполагали, что участки CRISPR у девяти новых мутантных штаммов по строению отличаются от таковых у предкового штамма. И действительно: выделив геномную ДНК из каждого мутантного штамма, исследователи обнаружили, что каждая область с CRISPR расширилась за счет вставки новых кусочков ДНК между повторами. Более того, эти новые спейсеры точно повторяли последовательности ДНК фага, к которому конкретный штамм приобрел иммунитет. Особенно примечательным казалось следующее: благодаря физическому встраиванию в область CRISPR бактериальной ДНК новоприобретенная устойчивость наследовалась и могла передаваться всем последующим поколениям при каждом делении.

Исследователи из Danisco обнаружили еще один способ борьбы бактерий с вирусами – их пятый набор вооружения. Как мы теперь знаем, в дополнение к ранее открытым системам защиты у бактерий имеется (в виде CRISPR) удивительно эффективная система противовирусного адаптивного иммунитета, позволяющая “воровать” кусочки ДНК фагов, когда последние заражают бактерии, и использовать их для обеспечения иммунного ответа в будущем. По выражению Блейка, CRISPR работал как “молекулярная карта” профилактических прививок: сохраняя память о предыдущих фаговых инфекциях в форме спейсерных последовательностей ДНК, запрятанных в рядах из повторов и спейсеров, бактерии могли использовать эту информацию для распознавания и разрушения тех же самых фагов во время новых столкновений с ними.

CRISPR: молекулярная карта профилактических прививок

С момента публикации исследования Danisco малопонятная биология CRISPR начала привлекать внимание исследователей. Кроме того, эта статья стала поводом для проведения первой посвященной CRISPR встречи, которая состоялась в Калифорнийском университете в Беркли в 2008 году и была организована Джилл Бэнфилд и Родольфом Баррангу. Однако, как это всегда бывает в науке, исследователи приоткрыли одну дверь, чтобы обнаружить за ней другую. Поскольку для иммунного ответа CRISPR требуется, чтобы последовательности ДНК в вирусном и бактериальном геноме полностью совпадали, было понятно, что эта иммунная система “целится” в генетический материал фагов, чтобы разрушить его, – но как? Какая составляющая клетки наводилась на цель?

Прошло не так уж много времени, и начал вырисовываться ответ и на этот вопрос. Стэн Броунс, постдок из лаборатории Джона ван дер Ооста в Вагенингенском университете в Нидерландах, предоставил убедительное доказательство того, что молекулы РНК задействованы в основанной на CRISPR защите от вирусов[63]63
  S. J. J. Brouns et al., “Small CRISPR RNAs Guide Antiviral Defense in Prokaryotes”, Science 321 (2008): 960–964.


[Закрыть]. Стэн опирался на более раннее исследование, в ходе которого были обнаружены молекулы РНК, в точности совпадающие с последовательностью ДНК CRISPR в клетках архей различных видов[64]64
  T.-H. Tang et al., “Identification of Novel Non-Coding RNAs as Potential Antisense Regulators in the Archaeon Sulfolobus solfataricus”, Molecular Microbiology 55 (2005): 469–481.


[Закрыть] (включая обитающие в вулканах штаммы Sulfolobus, которых изучал Блейк). Это позволило предположить, что РНК может координировать в иммунном ответе стадии распознавания и разрушения фагов. А Стэн, экспериментируя с E. coli, добавил к этим наблюдениям новые сведения, подтвердив, что РНК играет эту роль в основанной на CRISPR системе защиты у совершенно иного микроорганизма, – и это послужило хорошим аргументом в пользу того, что РНК необходима для всех связанных с CRISPR иммунных систем.

Стэн также показал, каким образом в клетке синтезируются молекулы РНК CRISPR. Сначала бактериальная клетка “переводит” весь ряд элементов CRISPR в длинные цепочки РНК, с точностью до буквы совпадающие с последовательностью нуклеотидов в ДНК CRISPR (как мы помним, РНК – молекула-сестра ДНК, состоящая из тех же “букв”, с той только разницей, что “буква” Т в ДНК в РНК заменяется на У). Как только клетка синтезирует эти длинные цепочки РНК на основе CRISPR, фермент с хирургической точностью разрезает их на более короткие РНК одинаковой длины, единственное отличие между которыми – последовательности нуклеотидов в их спейсерах. В ходе этого процесса длинные повторяющиеся последовательности ДНК переводятся в библиотеку из более коротких молекул РНК, каждая из которых содержит одну последовательность, построенную на основе фрагмента генома конкретного фага.

Эти данные указали на ключевую роль, которую РНК CRISPR играет в бактериальной иммунной системе, – и для этой роли РНК идеально подходит. Поскольку РНК химически очень похожа на ДНК, она также может образовывать двойные спирали за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований (которые лежат и в основе знаменитой двойной спирали ДНК)[65]65
  Но это происходит гораздо реже, чем в случае ДНК, из-за разницы в сахарах. В каждом нуклеотиде РНК содержится сахар рибоза, и у нее по сравнению с дезоксирибозой ДНК один атом кислорода “лишний”. Именно он затрудняет образование двойных спиралей РНК.


[Закрыть]. Подходящие (комплементарные) цепочки РНК могут взаимодействовать друг с другом, формируя двойную спираль РНК – РНК, но и одна цепочка РНК способна соединяться с подходящей одиночной цепочкой ДНК с образованием двойной спирали РНК – ДНК. Эта вариабельность и многообразие последовательностей, обнаруженных в РНК CRISPR, подсказали ученым заманчивую идею. Казалось возможным, что молекулы РНК CRISPR способны “вывести из игры” ДНК и РНК фагов-интервентов, образуя пары с любыми из них, подходящими по последовательности нуклеотидов, и запуская в клетке некий иммунный ответ.

Если РНК в самом деле помогает таким образом “целиться” в генетический материал вирусов, то механизм CRISPR, видимо, действительно похож на механизм РНК-интерференции, который изучали в моей лаборатории, – как и предполагали авторы той статьи, которая и “подсадила” меня на изучение CRISPR! При РНК-интерференции в клетках растений и животных для разрушения вирусов-интервентов образуются двойные спирали РНК – РНК. Вероятно, весьма похожим образом – используя двойные цепочки РНК – РНК, молекулы РНК CRISPR атакуют фаговые РНК в ходе иммунного ответа. Я была очарована открывавшейся здесь дополнительной возможностью: в отличие от РНК-интерференции, молекулы РНК в механизме CRISPR были способны распознавать и комплементарную ДНК – и благодаря этому “CRISPR-оружие” могло атаковать вирусные геномы по двум фронтам сразу.

Вскоре после открытия Стэна два исследователя из Северо-Западного университета – Лучано Марраффини и его наставник Эрик Сонтхаймер (с которым мы были знакомы еще со времен, когда он учился в Йеле) – выяснили, что РНК CRISPR действительно способна управлять процессом разрушения ДНК. Работая с еще одним микроорганизмом под названием Staphylococcus epidermidis – сравнительно безобидной бактерией с поверхности кожи человека (но близкой родственницей опасного и устойчивого к антибиотикам штамма золотистого стафилококка Staphylococcus aureus), Лучано спланировал серию элегантных экспериментов, чтобы доказать, что РНК CRISPR нацеливается на ДНК генетических паразитов-вторженцев[66]66
  L. A. Marraffini and E. J. Sontheimer, “CRISPR Interference Limits Horizontal Gene Transfer in Staphylococci by Targeting DNA”, Science 322 (2008): 1843–1845.


[Закрыть]. Он также показал, что это наведение на цель, скорее всего, производится за счет комплементарных взаимодействий азотистых оснований – единственного процесса, способного обеспечить специфичность, с которой CRISPR уничтожал свою жертву.

Скорость и тщательность проведения этих исследований захватывали дух. Всего за несколько лет после моего знакомства с механизмом CRISPR его изучение из россыпи интересных, но мало что объясняющих работ переросло во всеобъемлющую единую теорию устройства и работы системы приобретенного (адаптивного) иммунитета микроорганизмов. Эта теория была основана на непрерывно растущем множестве экспериментальных исследований, и, хотя к концу двухтысячных было уже опубликовано немало фундаментальных статей, было очевидно, что всем нам предстоит проделать еще больший объем работы, чтобы действительно разобраться в этой мудреной бактериальной системе защиты.

CRISPR, как мы начинали понимать, имеет гораздо более сложное строение, чем можно вообразить для какого-либо компонента простого одноклеточного организма. В некоторых отношениях открытие этой части иммунной системы бактерий поставило их на одну доску с людьми, так как продемонстрировало, что и те и другие обладают сложными формами клеточного ответа на инфекцию. Правда, никто из нас не знал, какое значение эта бактериальная система защиты может иметь для нашего вида.