Текст книги "Трещина в мироздании"

Глава 4
Управление войсками

Примерно через год после того, как наша статья о CRISPR вышла в журнале Science, я оказалась в Кембридже, штат Массачусетс, – в первой своей поездке по стране для обсуждения нашего открытия (впоследствии такие поездки случались каждый месяц).

То был июнь 2013-го, и я отправилась в Гарвардский университет, чтобы встретиться там с восходящей звездой с местной кафедры изучения стволовых клеток и регенеративной биологии. Кабинет профессора Кирана Мусунуру находился в здании имени Шермана Фэйрчайлда, в котором я слушала лекции по химии в 1980-х, когда была аспирантом. Тридцать лет спустя здание снаружи выглядело почти так же, но внутри его полностью обновили. Ушли в прошлое старомодные потоковые аудитории и биохимические лаборатории с устаревшим оборудованием. На смену им пришли белые, просторные, ярко освещенные помещения, оборудованные по последнему слову техники. В тот день, когда я была там, это современное пространство кипело жизнью: десятки исследователей работали сообща ради разгадки самых глубоких тайн клеток и тканей.

В некотором смысле преобразование Фэйрчайлд-билдинг – особенно смещение фокуса внимания с фундаментальной биохимии на прикладную биологию – совпадало с той метаморфозой, что произошла в моем мировосприятии и научной работе. Предыдущий год пронесся как ураган. Исследователи со всего мира – гораздо больше, чем могла бы вместить любая лаборатория, – быстро подхватили полученные нами сведения о биохимических свойствах CRISPR-Cas9 и стали их применять. Они уже успели использовать эти новые знания, чтобы изменить нужным образом ДНК бесчисленного множества организмов, включая генетический материал клеток человека. И ученые, и врачи воспринимали CRISPR как священный Грааль генетических манипуляций: быстрый, простой и точный способ устранить дефекты генетического кода. Будто в мгновение ока я перенеслась из области изучения бактерий и биологии CRISPR-Cas в мир медицины и биологии человека. Для такого узкоспециализированного ученого, как я, это был квантовый скачок – как если бы я заснула в Беркли и проснулась на Марсе.

Моя встреча с Мусунуру была прекрасной иллюстрацией ажиотажа вокруг этой новой технологии. Я приехала в Гарвард, чтобы обсудить варианты применения CRISPR в лечебных целях, но Киран уже был на шаг впереди меня. Прежде чем мы прошли в его кабинет, он пригласил меня прогуляться по лаборатории. В ходе этой экскурсии он живо описал мне множество способов применения CRISPR, которые его сотрудники использовали для разработки методов лечения генетических заболеваний.

Одной из мишеней экспериментов его команды, объяснил Киран, была серповидноклеточная анемия – состояние, при котором одна мутация в ДНК нарушает способность красных кровяных телец разносить кислород по телу. Сотрудники лаборатории использовали CRISPR для того, чтобы найти и вырезать мутировавший ген бета-глобина, тем самым запуская возвращение “правильного” Т, 17-го по счету нуклеотида в гене, на место “неправильного” А. И если бы у них получилось доработать технологию на реальных человеческих клетках в лаборатории, то были бы все основания предполагать, что того же самого можно достичь и у пациентов – и таким образом заложить основы терапии, позволяющей устранить саму причину генетического заболевания.

Я вслед за Кираном подошла к монитору, на котором слева направо одна под другой отображались длинные цепочки нуклеотидов ДНК. Мусунуру указал на две последовательности в верхней части экрана и объяснил, что они представляют собой “буквы” ДНК бета-глобина из клеток крови двух пациентов – здорового и страдающего серповидноклеточной анемией. Ожидаемо, что у здорового человека семнадцатый нуклеотид в этом гене был Т, а у больного – А.

Затем Киран обратил мое внимание на самую нижнюю строчку. Последовательность ДНК там также была взята из гена бета-глобина пациента с серповидноклеточной анемией, но после того, как ученые ввели ему в кровь три элемента CRISPR-системы. Первым из них был набор генетических инструкций из Streptococcus pyogenes для синтеза белка Cas9. Второй элемент представлял собой построенную на основе информации от CRISPR молекулу направляющей РНК, составленную таким образом, чтобы она взаимодействовала точно с мутировавшим участком гена бета-глобина. Третий элемент – это специально синтезированная замена фрагмента ДНК, кусочек “здоровой” последовательности гена бета-глобина, которую клетки используют для починки этого гена после того, как Cas9 его разрезал. Киран применил систему CRISPR-Cas9, чтобы вырезать определенную целевую часть генома, а также пометить место разреза таким образом, чтобы сама клетка могла заменить дефектную последовательность на нужную, правильную.

Взглянув на нижнюю часть монитора, я, к своему восторгу, увидела, что именно это и произошло: последовательность ДНК у больного серповидноклеточной анемией теперь была неотличима от той, что взяли у здорового человека. Используя CRISPR, сотрудники Кирана с идеальной точностью заменили вызывающую заболевание “букву” А на нормальную “букву” Т, никак не изменив при этом другие участки генома. В простом эксперименте с использованием клеток крови пациента они показали, что система CRISPR-Cas9 способна вылечить заболевание, поражающее миллионы людей по всему миру и приводящее к инвалидности.

В тот вечер я вышла на пробежку по набережной реки Чарльз. Я не раз бегала здесь, пока работала над получением степени доктора философии, а теперь, когда рядом снова струились такие знакомые воды Чарльза, я чувствовала, будто снова вернулась в те времена. Пока я бежала, память уносила меня назад, к обсуждениям репарации ДНК, большинство которых вращалось вокруг исследования, которое опубликовали мой научный руководитель Джек Шостак и его аспирантка Терри Орр-Вивер. В то время многие ученые были озадачены предложенной ими моделью, которая описывала, каким образом клетки устраняют повреждения двойной спирали ДНК. В еще большее замешательство всех привело предположение, выдвинутое Марией Джесин и ее коллегами из Мемориального онкологического центра имени Слоуна – Кеттеринга: ученые могут использовать механизмы устранения этих повреждений для изменения требуемых последовательностей ДНК. Однако эта стратегия сработала для предшествующих технологий, таких как ZFN и TALEN, и теперь мы наблюдали воочию, что это предположение оказалось верным и для CRISPR. Более того, основанный на CRISPR метод редактирования генов было гораздо проще применять. Вытеснит ли он более старые технологии так же, как компакт-диски вытеснили магнитофонные кассеты (а те, в свою очередь, вытеснили виниловые пластинки)? Я размышляла об этом, пока бежала от Гарвард-сквер до моста Лонгфелло и обратно, и совершенно не замечала, как вокруг меня сменяется городской пейзаж: его затмевал рой мыслей о CRISPR.

Что действительно воодушевляло меня, так это мысль, что методика, которую использовали в лаборатории Кирана, может быть применима и при массе других генетических заболеваний. Если ученые смогут безопасно и эффективно доставлять CRISPR в тело человека, так что нужный ген будет отредактирован и у пациентов, и у клеток в культуре, то возможности для преобразования медицины будут безграничными. Впрочем, реализация этой “безграничности” потребует такого количества ресурсов и рабочих рук, сколько ни одна исследовательская лаборатория не в состоянии предоставить – если будет действовать отдельно от других. Именно поэтому я и некоторые мои коллеги подумывали о том, чтобы основать компанию по разработке методов лечения, основанных на CRISPR, – собственно, это и было целью моего визита в Кембридж. Мы мечтали приспособить CRISPR для лечения генетических заболеваний – это был бы метод, совершенно недоступный раньше.

Во время череды встреч летом и осенью 2013-го из пяти человек составилась команда организаторов этой гипотетической компании: Джордж Чёрч, Кит Джоунг, Дэвид Лю, Фэн Чжан и я. В ноябре 2013-го мы основали Editas Medicine, получив от трех венчурных фирм финансирование в размере 43 миллионов долларов. Всего шестью месяцами позже Эммануэль стала соосновательницей другой компании, CRISPR Therapeutics, с начальным капиталом 25 млн, а в ноябре 2014-го на сцену вышла и третья компания – Intellia Therapeutics, с финансированием на первом этапе также 25 миллионов долларов. К концу 2015-го эти три компании собрали совокупно еще более полумиллиарда долларов инвестиций для исследований и разработок методов лечения множества заболеваний – от кистозного фиброза и серповидноклеточной анемии до миодистрофии Дюшенна и врожденной формы слепоты. И все – с использованием технологии CRISPR, которую впервые разработали и описали мы с Эммануэль.

Какими бы невероятными ни казались возможности применения CRISPR в медицине, все же требуются еще годы для того, чтобы эта технология “доросла” до клинических испытаний. А пока в ее исследование вовлекалось все больше и больше коллективов, так как в мировом научном сообществе быстро распространялась информация, что редактирование генов в живых клетках теперь можно осуществить всего за несколько дней. Многие эксперты прогнозировали, что CRISPR станет воплощенной мечтой ученых-биологов и позволит проводить эксперименты, о которых раньше можно было только мечтать. Я представляла себе, что это сделает технологию более доступной и она перестанет быть привилегией меньшинства. До CRISPR редактирование генов требовало сложных протоколов проведения, колоссального уровня научных знаний и умений и существенных финансовых вливаний, а еще это удавалось сделать лишь на нескольких видах модельных организмов. А ко времени моего визита в Гарвард даже в тех лабораториях, где раньше не работали с редактированием генов, уже применяли CRISPR.

Времена, когда упоминание CRISPR на семинаре или научной конференции вызывало по большей части непонимающие взгляды, давно прошли. Теперь казалось, что CRISPR буквально у всех на устах и его упоминают в каждом разговоре. И тем не менее это было еще только верхушкой айсберга.

Сидя в самолете Бостон – Сан-Франциско на обратном пути из той первой поездки в Кембридж, я уже видела на горизонте новую эру генетического “управления войсками” – эру, в которой CRISPR преобразит арсенал инструментов биолога, позволив ученым переписывать геном буквально любым образом, каким они пожелают. Из неудобочитаемого документа, с трудом поддающегося переводу, геном станет таким же податливым, как фрагмент литературного произведения в руках умелого редактора. Представляя себе эти новые широкие возможности, я с трудом верила, насколько быстро развились события с момента первых успешных попыток Мартина и Кшиштофа запрограммировать CRISPR на нарезку ДНК в пробирке. А теперь научное сообщество оказалось в стремительно расширяющемся круге света – и для него открывались всё новые невероятные прозрения о том, как работает CRISPR и как однажды его станут использовать для улучшения здоровья человека.

В экспериментах, опубликованных в статье в Science 2012 года, Мартин и Кшиштоф продемонстрировали нечто совершенно новое: что ассоциированный с CRISPR белок под названием Cas9, изолированный из плотоядных бактерий, взаимодействует с двумя молекулами РНК для нацеливания на подходящие двадцатибуквенные последовательности ДНК и их разрезания. РНК играет роль проводника, указывая “GPS-координаты” для атаки, а Cas9 действует как орудие для уничтожения цели. У бактерий, инфицированных вирусом, аппарат CRISPR был мобилизован для разрезания и уничтожения определенных молекул ДНК вируса – это было частью адаптивного иммунного ответа.

Виргиниюс Шикшнис и его коллеги осенью 2012-го опубликовали статью, сходную с нашей[79]79
  G. Gasiunas et al., “Cas9-crRNA Ribonucleoprotein Complex Mediates Specific DNA Cleavage for Adaptive Immunity in Bacteria”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109 (2012): 86.


[Закрыть]; она описывала функции белка Cas9, найденного в производящих йогурт бактериях, относящихся все к тому же роду стрептококков. Как и мы, литовские исследователи обнаружили, что Cas9 разрезает последовательности ДНК, “буквы” которых подходят к “буквам” РНК CRISPR. Но команда Шикшниса не смогла раскрыть важнейшую роль второй РНК (так называемой трансактивационной РНК, tracrRNA), которая, как удалось показать нам, была неотъемлемой частью реакции нацеливания на нужный участок ДНК и разрезания этой молекулы.

В своей статье мы максимально подробно описали молекулярные требования этой защитной системы и показали, насколько легко и просто можно настроить новые версии CRISPR для разрезания ДНК любым нужным образом. Мы сделали еще один шаг вперед и из направляющей РНК, состоящей у бактерий из двух отдельных молекул РНК (РНК CRISPR и трансактивационной РНК), сделали одну молекулу РНК-гида, тоже дающую Cas9 возможность находить и вырезать определенную последовательность ДНК. Мы также предположили, что эту систему защиты можно настроить на выполнение других функций в клетках – например, не на разрушение вирусной ДНК, а на прицельное редактирование ДНК самой клетки. Если мы поменяем двадцатибуквенный код РНК таким образом, чтобы он был комплементарен последовательности отдельно взятого человеческого гена, и затем введем Cas9 и новую направляющую РНК в клетки человека, CRISPR сделает хирургически точный разрез в гене-мишени, отметив это место как нуждающееся в репарации. Разрезав ДНК, CRISPR приведет клетку в полную боевую готовность, и она устранит внутри себя повреждения – но так, что мы сможем контролировать этот процесс.

Как мы предполагали, использование CRISPR в человеческих клетках подтвердит широту возможностей этого нового способа редактирования генов. И для этих предположений были веские причины. Наше собственное исследование показало, что белок Cas9 и его направляющая РНК очень избирательны и крепко связаны друг с другом, а это свидетельствует, что они без проблем найдут друг друга в человеческой клетке. А что касается отправки их в клеточное ядро, где расположена ДНК, то тут нам достаточно присвоить этим молекулам подходящий химический “адрес получателя”, и клетка сама сделает остальную работу за нас. До этого сотрудники многих лабораторий преуспели в переносе белков и молекул РНК от бактерий в клетки человека, и в нашем распоряжении было немало молекулярно-биологических инструментов, которые помогли бы CRISPR работать должным образом и за пределами его обычных мест обитания.

Нам оставалось только показать, что все работает именно так, как мы и предположили.

Мартин начал с переноса бактериальной ДНК, кодирующей Cas9, и синтезированной на основе информации от CRISPR РНК в две плазмиды – небольшие колечки ДНК, которые ведут себя как искусственные мини-хромосомы. Первая плазмида содержала генетические инструкции для направляющей РНК, а также отдельные инструкции для человеческих клеток, чтобы они тоже понемногу производили такие молекулы РНК. Во второй плазмиде находился ген cas9, но он был “гуманизирован”[80]80
  То есть приближен по структуре к генам человека.


[Закрыть], чтобы его могли прочесть белок-синтезирующие аппараты человеческих клеток. Мартин также слил с геном cas9 еще два гена, часто используемых биологами: один, совсем небольшой, под названием клеточный сигнал ядерной локализации, направляющий белок в клеточное ядро, и ген зеленого флуоресцентного белка, благодаря которому каждая человеческая клетка, производящая белок Cas9, должна была засветиться зеленым, если на нее подействовать ультрафиолетом.

Соединив все эти молекулярные компоненты в единую систему, мы с Мартином намеревались превратить человеческие клетки в фабрики для производства CRISPR, которые, сами того не ведая, штампуют молекулы, запрограммированные на разрезание заданных частей собственного генома. И еще мы знали, что CRISPR не убьет человеческие клетки “шинкованием” ДНК, как он делает это с вирусами в бактериях, разрезая вирусную ДНК. ДНК человека (да и всех эукариотических организмов, если уж на то пошло) постоянно получает повреждения – например, это происходит, когда она подвергается воздействию канцерогенных веществ, ультрафиолета либо рентгеновского излучения. И чтобы приводить в порядок поврежденную ДНК, клетки разработали хитроумные системы репарации двуцепочечных разрывов в ней. Таким образом, в самом вероятном сценарии, если CRISPR вырежет нужный ген, клетка ответит на это просто “склеиванием” фрагментов молекулы ДНК обратно в единое целое, будто приварит одну металлическую трубу к другой. Ученые именуют этот процесс негомологичным соединением концов, ведь он, в отличие от гомологичного, не требует ДНК-шаблонов для починки молекулы. (Слово “гомологичный” происходит от греческого homologos, означающего “согласный с законом”.)

Ключевая особенность этого процесса репарации – заложенная в самой его природе небрежность. Как сварщик перед работой должен удостовериться, что у обеих труб очищены торцы, подлежащие сварке, так и клетке перед соединением фрагментов разорванной ДНК тоже нужно убедиться, что концы этих фрагментов чистые. Создание чистых концов иногда требует удаления или вставки нескольких “букв” ДНК, что приводит к изменениям состава генов после окончания процесса репарации. Это означает, что ген, скорее всего, изменится после “атаки” и вырезания его CRISPR и последующей починки за счет клетки. Этот неточный и порождающий ошибки способ репарации должен был обеспечить нам с Мартином простой метод выявления успешных попыток редактирования генов. Выбирая в качестве мишени конкретный ген и анализируя последовательность его нуклеотидов буква за буквой до воздействия CRISPR и после него, мы могли бы найти любой признак неаккуратной репарации, а это доказало бы, что CRISPR обнаружил свою цель и разрезал ее.

Мы с Мартином решили запрограммировать CRISPR таким образом, чтобы он атаковал человеческий ген, который называется ген легкой цепи клатрина A (CLTA) и задействован в эндоцитозе – процессе, который клетки используют для захвата питательных веществ и гормонов. Мы не изучали эндоцитоз, но ген CLTA уже был отредактирован по более старой технологии ZFN в лаборатории профессора Дэвида Друбина, которая тоже находится в Беркли. Поэтому мы знали, что редактирование этого гена возможно, а тестирование CRISPR на материале, на котором уже изучали ZFN, помогло бы нам выявить сходства и различия действия двух методов. Конечно, создание инструмента на основе ZFN для редактирования CLTA требовало нескольких месяцев работы и тесного сотрудничества с компанией, бесплатно предоставившей команде Дэвида ZFN (в то время разработка одного ZFN стоила непозволительно дорого – 25 000 долларов). В случае Мартина все было совсем иначе: ему потребовалось всего несколько минут, чтобы смоделировать на компьютере аналогичный[81]81
  То есть атакующей ту же мишень.


[Закрыть] вариант CRISPR, и синтезировать нужные молекулы можно было за несколько десятков долларов. В конце концов, это и есть одно из главных преимуществ CRISPR – то, что вам фантастически легко указывать в качестве мишени определенные гены. Все, что нужно было сделать, – выбрать желаемую двадцатибуквенную последовательность ДНК для редактирования и затем перевести ее в соответствующий двадцатибуквенный код РНК. Когда эта РНК окажется в клетке, она соединится с подходящей последовательностью ДНК по принципу комплементарности, и Cas9 разрежет ДНК.

Экспериментальной площадкой для нашего первого испытания редактирования генома должны были стать клетки линии HEK 293. Впервые полученные в 1973 году из клеток почки абортированного плода, клетки HEK 293 снискали популярность среди специалистов в клеточной биологии благодаря простоте их культивирования в лаборатории и тому, насколько легко они принимали в себя чужеродную ДНК. Когда мы смешали две плазмиды (одну – с генетическими инструкциями по производству Cas9 и вторую – с генетическими инструкциями по сборке направляющей РНК) в маслянистом растворе молекул, которые называются липидами, то мини-хромосомы (плазмиды) стали спонтанно захватываться жировыми пузырьками, очень похожими на капли жира на поверхности куриного бульона. После того как мы добавили эту смесь к культурам клеток HEK 293, жировые пузырьки должны были слиться с клеточными мембранами и выбросить содержащуюся в них ДНК внутрь клеток. Оказавшись в клетке, ДНК подверглась бы копированию, транскрипции и трансляции, в результате чего получатся белок Cas9 и направляющая РНК, специфически связывающая ген CLTA. Разрезающий ДНК аппарат должен был затем транспортироваться внутрь ядра, где находились наши целевые последовательности ДНК. Мы предполагали, что он найдет правильную двадцатибуквенную последовательность ДНК и разрежет ее. А клетка починит поврежденную ДНК таким образом, что мы это заметим.

Эксперименты Мартина тут же продемонстрировали, что мини-хромосомы действительно давали клеткам человеческой почки возможность производить компоненты CRISPR. Когда Мартин изучал эти клетки под микроскопом, он увидел, что значительная доля клеток светилась зеленым, что могло получиться только в результате образования Cas9, связанного с зеленым флуоресцентным белком. Собрав часть клеток и превратив их в кашицу для анализа различных содержащихся в них молекул РНК, Мартин также обнаружил, что клетки почки производили солидные количества направляющей РНК.

Перенос CRISPR из бактериальных клеток в человеческие сработал так, как мы ожидали, но оставался один резонный вопрос: редактирует ли CRISPR ДНК человека?

Мартин и Александра Ист-Селетски, молодая студентка, недавно присоединившаяся к проекту, измельчили еще некоторое количество клеток, выделили из них ДНК и проанализировали состав гена CLTA. Ошибки быть не могло: ген был отредактирован именно на участке, точно совпадающем с последовательностью направляющей РНК. Для неспециалиста результаты не выглядели впечатляющими – какие-то темные полоски на тонкой пластинке гелеподобного материала, – однако выводы из этих “полосок” и потенциальные применения этих выводов имели грандиозное значение.

Всего в несколько простых и хорошо отработанных стадий мы с Мартином выбрали произвольную последовательность ДНК в состоящем из 3,2 миллиарда “букв” геноме человека, спроектировали вариант CRISPR для ее редактирования и стали наблюдать, как крохотная машинерия выполняла то, на что была запрограммирована, – и не где-нибудь, а в живых человеческих клетках. Своими результатами мы подтвердили работу новой технологии, дающей ученым удивительную способность переписать код жизни с хирургической точностью и поразительной простотой. В мгновение ока CRISPR по своему развитию догнал технологии редактирования генома, исследование и разработка которых шли почти двадцать лет.

Редактирование ДНК в человеческих клетках c помощью CRISPR

Фактически в такой же спешке, как и шестью месяцами ранее, когда мы готовили публикацию с Кшиштофом и Эммануэль, мы написали текст научной статьи с изложением наших новейших результатов. Если наша первая публикация 2012 года содержала прямое указание на то, что CRISPR следует применить в качестве новой платформы редактирования генома в клетках, то во второй статье уже содержались четкие демонстрация и подтверждение внушительных возможностей этой недавно открытой системы.

Когда 2012-й подходил к концу, я ощущала заметную иронию, читая, что журнал Science, опубликовавший нашу статью о CRISPR всего за полгода до этого, поставил редактирование генома на вторую строчку списка прорывов года (первое место отдали бозону Хиггса), но упомянул в этом пункте более старую технологию, TALEN, открытую непосредственно перед началом нашей работы с CRISPR. Мне было интересно, какие еще сюрпризы CRISPR преподнесет научному сообществу.

К моему глубокому удовлетворению, первые две недели 2013 года ознаменовались публикацией еще пяти научных статей о CRISPR (не считая нашей)[82]82
  L. Cong et al., “Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems”, Science 339 (2013): 819–823; P. Mali et al., “RNA-guided Human Genome Engineering via Cas9”, Science 339 (2013): 823–826; M. Jinek et al., “RNA-programmed Genome Editing in Human Cells”, eLife 2 (2013): e00471; W. Y. Hwang et al., “Efficient Genome Editing in Zebrafish Using a CRISPR-Cas System”, Nature Biotechnology 31 (2013): 227–229; S. W. Cho, S. Kim, J. M. Kim and J.-S. Kim, “Targeted Genome Engineering in Human Cells with the Cas9 RNA-guided Endonuclease”, Nature Biotechnology 31 (2013): 230–232; W. Jiang et al., “RNA-guided Editing of Bacterial Genomes Using CRISPR-Cas Systems”, Nature Biotechnology 31 (2013): 233–239.


[Закрыть], и все они описывали сходные эксперименты, в которых эту систему применяли для редактирования генов непосредственно в клетках – как мы и предсказали в 2012-м. И профессор МТИ Фэн Чжан, и гарвардский профессор Джордж Чёрч предварительно связывались со мной, чтобы сообщить о готовящихся публикациях. Статьи Чжана и Чёрча появились на сайте журнала Science в начале января, а чуть позже в том же месяце вышли и наша с Мартином статья, и три другие за авторством профессора Джин Су Кима из Сеульского национального университета, профессора Рокфеллеровского университета Лучано Марраффини и профессора Гарвардской медицинской школы Кита Джоунга.

Это было бурное время. Меня окрыляло то, что наша с Эммануэль работа, опубликованная предыдущим летом, вдохновила других ученых на проведение серий экспериментов, подобных нашим. Лишь позднéе содержание этих статей и даты их публикации начали скрупулезно разбирать и сопоставлять для обоснования той или иной позиции в патентных спорах о CRISPR – досадный поворот событий в истории, которая начиналась как сотрудничество исследовательских коллективов, в атмосфере неподдельного общего восторга по поводу того, что смогут дать человечеству наши исследования!

Сравнив все шесть статей, я осознала, что суммарно в этих экспериментах было отредактировано больше дюжины разных генов. Еще больше радовало разнообразие типов клеток, подвергшихся редактированию. Вдобавок к редактированию генома клеток эмбриональной человеческой почки механизм CRISPR был запрограммирован на то, чтобы разрезать ДНК в клетках человека, пораженных лейкемией, стволовых клетках человека, клетках нейробластомы мыши, бактериальных клетках и даже одноклеточных эмбрионах данио-рерио, популярного модельного организма для генетических исследований. CRISPR не просто демонстрировал отдельные признаки успешного применения; он показывал невероятную гибкость в использовании. Казалось, что любой ген можно сделать мишенью CRISPR, разрезать его и отредактировать, если в клетке присутствует белок Cas9, а направляющая РНК имеет участок, комплементарный двадцатибуквенному коду ДНК.

Ажиотаж вокруг CRISPR усилился в мае, когда лаборатория Рудольфа Йениша в МТИ сообщила о создании мышей с геномом, отредактированным с помощью CRISPR[83]83
  H. Wang et al., “One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering”, Cell 153 (2013): 910–918.


[Закрыть]. Всего шестью годами ранее Нобелевскую премию по физиологии или медицине присудили нескольким ученым за разработку методов внедрения изменений в геном мышей – наиболее популярных модельных животных в изучении генетики млекопитающих. Более двадцати лет этот эффективный, но трудоемкий метод был наилучшим – и фактически единственным – способом воспроизведения в организмах мышей мутаций, вызывающих рак или другие болезни у человека. В 1974-м Йениш стал первым, кто создал трансгенную мышь, чьи клетки содержали чужеродный генетический материал, а пятнадцатью годами спустя он вновь вызвал сенсацию, одним из первых применив этот метод, удостоенный Нобелевской премии. А сейчас успех Йениша с CRISPR привлек внимание к новой технологии, которая не просто вытеснила старый подход, но и давала возможность без сучка и задоринки редактировать геномы других животных.

Предыдущий метод редактирования генома нуждался в эмбриональных стволовых клетках, масштабном обратном скрещивании[84]84
  Скрещивание потомков с представителями родительского поколения.


[Закрыть], скрещивании различных линий животных и во множестве поколений мышей; нередко главным результатом какой-нибудь кандидатской диссертации становилось создание и описание всего одной линии генетически модифицированных мышей. Аналогичных результатов команда Йениша, используя CRISPR, достигла всего за месяц, применив простой четкий протокол – микроинъекции компонентов CRISPR непосредственно в одноклеточный эмбрион с последующей имплантацией эмбрионов с отредактированными геномами в матку самки. Более того, эти исследователи показали, что для отдельно взятого CRISPR не обязательно программировать только одну направляющую РНК; их может быть много, и тогда они способны нацеливать Cas9 на разрезание и одновременное редактирование нескольких последовательностей ДНК в эмбрионах мышей. Такой вариант одноступенчатого множественного редактирования генов раньше никогда не применяли на мышах.

Возможно, самое прекрасное в работе Йениша – по крайней мере, с точки зрения генетиков, работающих не с мышами, а другими животными, – так это то, что в ходе нее был открыт почти не требующий усилий способ редактирования генома едва ли не любого организма. И если изначальный метод с применением эмбриональных стволовых клеток применяли только на мышах, то теперь создавалось впечатление, что CRISPR можно ввести в любые половые клетки (яйцеклетки и сперматозоиды) или эмбрионы – и генетические изменения на выходе точно скопируются во все клетки и всегда будут передаваться будущим поколениям. В тот момент я не могла вообразить, что расширение области применения CRISPR на человеческие эмбрионы породит одну из самых сложных этических дискуссий вокруг CRISPR – и в эту дискуссию очень скоро затянет и меня.

Создание мышей с геномом, отредактированным с помощью CRISPR

Летом 2013-го, восхищаясь, с какой скоростью распространяется метод CRISPR, я начала составлять список всех типов клеток и всех видов живых организмов, чьи геномы уже были отредактированы с использованием этой технологии. Сначала это было легко: в январе-феврале список включал в себя данио-рерио и культуры клеток бактерий, мышей и человека, потом к нему добавились дрожжи, живые мыши, плодовые мушки и микроскопические черви. К концу того же года в перечень вошли крысы, лягушки и гусеницы шелкопряда. За следующий год я добавила в список кроликов, свиней, коз, асцидий и обезьян – и после этого, как я честно признавалась слушателям на семинарах, где рассказывала о своем списке, потеряла счет. Наблюдение за тем, как молекулы белков и РНК, в природе служащие для защиты бактерий от вирусов, все шире используются для разрезания и точного редактирования последовательностей ДНК самых разнообразных животных, захватывало дух.

Однако метод находил применение не только на животных. Ботаники, пусть они сначала и двигались медленнее, тоже открывали для себя невероятный потенциал CRISPR в редактировании ДНК сельскохозяйственных и диких растений. Вал публикаций осенью 2013-го сообщал об успешном применении CRISPR для редактирования генома в главных пищевых культурах, таких как рис, сорго и пшеница, а год спустя список “отредактированных” растений расширился за счет сои, помидоров, апельсинов и кукурузы.

Перечень “откриспрованных” растений и животных продолжал расти. К 2016-му исследователи успели отредактировать ДНК едва ли не во всех организмах – от капусты, огурцов, картофеля и грибов до собак, хорьков, жуков и бабочек. Даже вирусам, этим биологическим объектам на границе живого и неживого – они неспособны самостоятельно размножаться, но тем не менее обладают наследственным материалом, – переписали геномы с помощью CRISPR, то есть той самой бактериальной системы, которая изначально сформировалась для их уничтожения.