Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

13. Пострепликативная репарация

Пострепликативной, как это следует из названия, принято называть репарацию, которая происходит в клетке после завершения процессов репликации. Очевидно, что это может быть не один, а несколько независимых процессов, происходящих в одно и то же время клеточного цикла. Естественно, что все эти процессы были открыты не одновременно, и долгое время под названием «пострепликативная репарация» подразумевался только процесс гомологической рекомбинации, инициируемый однонитевыми брешами, образовавшимися напротив неотрепарированных пиримидиновых димеров. С этого процесса мы и начнем изучение пострепликативной репарации ДНК.

13.1. Пострепликативная, или рекомбинационная, репарация

В 1968 году американцы У. Рапп и П. Ховард-Фландерс исследовали облученные УФ-светом бактерии, у которых был нарушен синтез эндонуклсаз, участвующих в эксцизионной репарации нуклеотидов. Опыты проводили в темноте для того, чтобы не мог осуществиться и процесс фотореактивации. Таким образом, после УФ-облучения в ДНК этих клеток оказывалось много невырезанных перимидиновых димеров. В тот момент, когда ДНК-полимераза, ведущая репликацию, доходила до первого из них, она на 10 секунд застывала на месте. Этот обнаруженный Раппом и Ховардом-Фландерсом факт задержки синтеза был неоднократно подтвержден другими исследователями. Необходимо сознавать, что задержка на 10 секунд весьма значительна, так как репликация у кишечной палочки идет со скоростью 1000 нуклеотидов в секунду. Затем ДНК полимераза каким-то образом ухитрялась перебраться за пиримидиновый димер и возобновить синтез позади повреждения. Тоже самое повторялось и перед следующим димером. Известно, что репликацию ДНК у E.coli осуществляет специальный комплекс из нескольких десятков белков. Каким образом весь этот белковый комплекс может перебраться через повреждение и возобновить реакцию репликации без помощи затравки (короткого участка РНК, без которого синтез ДНК невозможен) до сих пор до конца не ясно. В результате такого перемещения ДНК-полимеразного комплекса и последующего ресинтеза формируется дочерняя ДНК с брешами, то есть участок дочерней нити, иногда длиной в несколько генов, оказывается неудвоенным, причем в родительской нити напротив бреши так и остается нерепарированное повреждение ДНК.

Рисунок 36. Пострепликативная репарация у E. coli.

Такая ситуация может привести клетку к гибели, и чтобы этого избежать, в клетке включается специальный механизм, основанный на рекомбинации, в процессе которой белок RесА ведет гомологичное спаривание нитей. Из изначально свободной от дефектов комплементарной нити матричной ДНК, на которой процесс репликация ДНК был правильно завершен, вырезается участок ДНК, равный по длине участку бреши, и встраивается в брешь. Затем лигазы соединяют концы вставленного фрагмента с концами нормально синтезированного участка дочерней нити. После этого другие ферменты репарации устраняют дефект в исходно поврежденной нити. Одновременно брешь, оставшаяся после вырезания участка из родительской нити, застраивается ДНК полимеразой I. Эта модель, представленная на рис. 36, как мы уже говорили, описывает только один из механизмов пострепликативной репарации.

У эукариот процесс пострепликативной репарации существенно сложнее, причем репаративные реакции могут идти различными путями, один из которых приводит к появлению мутаций (является мутагенным) и, вероятно, связан с ДНК-полимеразами, способными вести синтез на поврежденной матрице. Этот механизм еще иногда называют «проходом» повреждения. В то же время накопленные экспериментальные данные показывают, что существует и механизм зашивания брешей без ошибок, причем преимущественным механизмом является безошибочный обход повреждения.

Очевидно, что есть момент «решения», каким именно путем будет идти пострепликативная репарация.

К настоящему времени сложилось представление, что ключевую роль в процессах пострепликативной репарации и выборе того или иного ее пути у эукариот играет убиквитинирование вовлеченных белков. Поэтому нам кажется необходимым сделать здесь небольшое отступление.

13.2. Убиквитин и убиквитин-связывающие белки

Убиквитин – это крайне консервативный белок, состоящий из 76 аминокислотных остатков и обнаруженный во всех клетках. Он является основным кофактором АТФ-зависимой деградации белков.

Рисунок 37. Убиквитинирование белков.

При активации убиквитина его С-концевые лизины могут связаться с субстратом. Это происходит путем ковалентного связывания через е-NH2 группу лизина белка-субстрата, таким образом, что у большинства связанных с убиквитином белков С-конец одного убиквитина связывается с Lys48 следующего, образуя мультиубиквитиновые цепи. Белки, претерпевающие подобное убиквитинирование, преимущественно проходят деградацияю в составе 26S протеосом. Полиубиквитиновые цепи разбираются на отдельные молекулы собственными концевыми гидролазами. Эти ферменты образуют большое семейство и их роль до конца не ясна.

Белки, связанные с убиквитином, можно разделить на три основные группы: активирующие (Е1), переносящие (связывающие) (Е2) и убиквитин-лигазы (Е3). Количество белков в каждой группе различно у разных видов. Например, у человека только один белок Е1, около 15 белков Е2, а Е3 – множество, причем самой разной структуры.

Е2-белки содержат 16кд домен, лизины которого способны связывать и переносить убивитин на белки-субстраты. Сам перенос осуществляется убиквитин-лигазами Е3. Большинство из Е3 способны к образованию длинных убиквитиновых цепей, скорее всего, в комплексе с Е2 или друг с другом. Интересны несколько классов этих белков. Во-первых, это НЕСТ-домен-содержащие белки (НЕСТ-домен гомолог С-концевого домена онкогена Е6-АР, участвующего в деградации Р53 при вирусном заражении), которые важны для разворота РНК-полимеразы, а также участвуют в регуляции клеточного цикла и мембранных натриевых каналов. Другая группа Е3 – это белки АРС (anaphase-promoting complex). Еще одна убиквитин-лигаза SCF участвует в регуляции клеточного цикла совместно со специфической Е2 – Сdс34. Схема взаимодействия белков в процессе убиквитинрования показана на рис. 37. Гомологом убиквитина является белок SUMO, причем эта гомология затрагивает прежде всего четвертичную структуру, а не просто аминокислотную последовательность (там гомология всего около 20 %). Этот белок содержит такой же глициновый С-конец и способен связываться с субстратом по тому же принципу, что и убиквитин. SUMO взаимодействует с ядерным поровым комплексом, и связывание с ним белков-субстратов способствует их белковому импорту-экспорту из ядра, а не деградации.

Вероятно, главная роль убиквитина и подобных ему белков состоит в «мечении» белков-субстратов и решения их дальнейшей судьбы, что играет ключевую роль во многих клеточных процессах.

13.3. Rad6-зависимая пострепликативная репарация

Процесс пострепликативной репарации (PRR, post replication repair) у дрожжей называется еще Rad6-зависимой репарацией, так как была обнаружена группа белков, эпистатически связанных с Rad6 и вовлеченных в этот процесс. Rad6-зависимый путь PRR является эволюционно консервативным: у E.coli гомолог Rad6 вовлечен в процесс ресинтеза (рестарта репликации) при SOS-ответе, гомологи найдены у S.pombe и мыши, причем участвуют в сходных процессах обхода повреждения. Rad6-зависимый путь контролируется белками Rad6 и Rad18, образующими гетеродимер, способный к связыванию с ДНК и обладающий убиквитин-связывающей активностью.

Гетеродимер Rad6/Rad18 и белок Rad5 необходимы для одного из путей пострепликативной репарации. Rad6 является классическим Е2-убиквитин-связывающим ферментом, образующим множество убиквитиновых цепей через связывание лизином в 48 положении. Rad18 является ДНК-связывающим белком с убиквитин-лигазной активностью. Комплекс Ubc13/Mms2 также является Е2-убиквитин-связывающим ферментом, но формирует убиквитиновые цепи через лизин в 63 положении. Rad5 является ДНК-связывающим белком, который привлекает комплекс Ubc13/Mms2 к ДНК, а также служит связующим звеном между комплексами Ubc13/Mms2 и Rad6/Rad18. Функции этих белков пока точно не определены, но их гомологи существуют и у млекопитающих. Rad6 имеет два гомолога в клетках человека, с которыми взаимодействует человеческий гомолог Rad18 (hRad18). Участие самого hRad18 в пострепликативной репарации доказано. Ген Mms2 считается частью безошибочного пути PRR, контролируемого Rad6, его продукт способен образовывать прочный комплекс с белком Ubc13, который в свою очередь способен к альтернативному убиквитинированию лизина в 63 положении.

Белок Rad18 обладает способностью связываться с однонитевой ДНК, таким образом комплекс Rad6Rad18 способен связаться с остановившейся вилкой репликации, так как там имеется однонитевой «хвост». При этом Rad6 может убиквитинировать белки остановившегося комплекса репликации.

Мутагенный путь пострепликативной репарации основан на способности полимераз семейства Y вести синтез на поврежденной матрице. Это процесс аналогичный SOS-репарации у прокариот. Вероятнее всего, убиквитинирование процессивной ДНК-полимеразы δ необходимо для ее деградации или перемещения, позволяющего полимеразам Y-семейства занять ее место и провести синтез на поврежденной матрице.

Безошибочный путь пострепликативной репарации состоит из одного из вариантов синтеза на поврежденной матрице (Rad30-зависимого) и путей обхода повреждений, для которых необходимы белки Rad5, Mms2, Ubc13, Srs2, а также ДНК-полимераза-δ, PCNA и некоторые белки гомологической рекомбинации. Схема этого процесса предложена на рис. 38.

О низкопроцессивных ДНК-полимеразах эукариот, участвующих в процессе «прохода» повреждении, мы уже подробно говорили при изучении SOS-ответа у E.coli.

Rad5 является членом семейства SWI/SNF, как и CSA, обладая АТФазной активностью. Он может способствовать ремоделированию хроматина и помогать белкам репарации подойти к ДНК, а также участвовать в переключении матрицы при остановке вилки репликации. Это делает его одним из главных игроков.

PCNA может быть моноубиквитинирован Rad6 и Rad18, полиубиквитинирован Rad6, Rad18, Rad5, Mms2, Ubc13, и «сумоирован» Ubc9, что играет важную роль в выборе субпути Rad6– зависимой PRR. Таким образом различные модификации PCNA могут определять тот тип репарации, который будет использован при ресинтезе (рестарте репликации). Связаны ли модификации PCNA с внутри S-фазными чекпойнт-функциями не ясно.

Ген Srs2 является гомологом ДНК-геликазы UvrD E.coli и проявляет антирекомбинационную активность, антагонистическую активности Rad51 – то есть он способен разрушать его активные филаменты. Интересно, что Srs2 способен взаимодействовать с pol32 – субъединицей ДНК-полимеразы-δ. Во время чек-пойнт ответа на повреждение ДНК Srs2 может быть фосфорелирован Mec1 и Rad53 —киназами. Именно этот белок может быть мишенью чек-пойнт-киназ в комплексе белков остановившейся вилки репликации внутри S-фазы. Вероятно, у него есть еще дополнительные функции вне PRR. В то же время Srs2, Mec1и Rad5 могут кооперироваться в осуществлении независимого от рекомбинации Ресинтеза (рестарта репликации). Таким образом, выбор субпути может также зависеть от регуляции клеточного цикла – то есть от чекпойнт-ответа.

Рисунок 38. Два пути пострепликативной репарации у эукариот.

Возможно, что сам Rad51 является ингибитором однонитевого отжига по прямым повторам (вытесняя Rad52). Вероятно, Rad51-зависимую рекомбинацию можно считать репликацией, индуцированной разрывами. Мишенью для Rad51 могут служить не только однонитевые бреши, но и отожженные друг на друге вновь синтезированные сестринские хроматиды остановившейся вилки репликации, так как там есть двунитевые концы, или просто разрушающаяся вилка с двойными концами ДНК.

Роль чекпойнт-сигналов и привлечения факторов репарации в процессах пострепликативной репарации до конца неясно.

14. Репарации поврежденных вилок репликации и ресинтез

Для репарации поврежденных вилок репликации существенна рекомбинация, которая снижает уровень мутагенеза, связанного с «перескакивающими» полимеразами. Доказано существование репликации, зависящей от рекомбинации в таких случаях, как конъюгация и трансдукция у бактерий, а у эукариот при мейозе, поддержании стабильности теломер и немутагенной репарации репликативных вилок. Документально подтверждено существование ресинтеза (рестарта репликации), связанного с рекомбинацией. В УФ-облученных клетках пекарских дрожжей в районе остановившихся вилок репликации образуются Холлидеевские структуры, а в выживших клетках возрастала частота генной конверсии и межгенной мититической рекомбинации. Одновременно было показано, что мутанты Rad6, Rad18 и Rad52 дефектны по пострепликативной репарации. Мутантный фенотип Rad6 и Rad52 при этом полностью соответствуют мутантному фенотипу Reca у E.coli. Вероятно, Rad52 играет ведущую роль в самом процессе рекомбинации, а Rad6 участвует в нем только на уровне регуляции. Нужно помнить, что для возникновения видимой Холлидеевской структуры требуется только отжиг цепей и ничего больше.

Гетеродимер Rad6/Rad18 совершенно необходим для работы любой системы, способной успешно завершать репликацию поврежденной ДНК. Мутанты по обоим этим генам крайне УФ-чувствительны и неповрежденные новосинтезированные нити ДНК в них после УФ-облучения не образуются.

Специфическая для структуры Холлидея геликазная-эндонуклеазная активность, способствующая ее разрешению, связана с комплексами Rad1/XPF и Mus81-Mms4. Одновременно оба эти комплекса способны к распознаванию остановившейся вилки репликации (выглядящей как вилка с «хвостом») и не проявляют сродства к обычным вилкам репликации. Вероятно, комплекс Mus81-Mms4 привлекается в район остановившейся вилки репликации белками чекпойнт-ответа, а его эндонуклеазная активность может участвовать в процессах, направленных на продолжение репликации. Для этого предложено множество моделей.

Белок Mgs1 (WHIP) является еще одним из возможных участников специального субпути PRR. Это ДНК-независимая АТФаза, способная образовывать комплекс с ДНК-полимеразой-δ и геликазой Sgs1 (так же как человеческий WHIP с WRN), появляется в районе остановившейся репликативной вилки и способствует проходу репликативным комплексом зоны повреждения.

14.1. Модель прохода повреждения с переключением матрицы

Схематически эти модели изображены на рис. 39 и 40.

Первый способ, изображенный на рис. 39, основан на том, что при остановке вилки репликации перед повреждением на лидирующей нити, синтез на отстающей может продолжаться и приводить к появлению более длинного фрагмента вновь синтезируемой нити. Происходит разворот вилки с отжигом на сестринской хроматиде и продолжением синтеза лидирующей нити на вновь синтезированной отстающей. Как только лидирующая нить удлиниться так, чтобы перекрыть остановившее продвижение вилки повреждение, вилка разворачивается обратно и матричные нити спариваются со вновь синтезированными. Таким образом синтез продолжается, а повреждение оказывается обойденным.

На рис. 40 показано, что этот процесс может проходить и несколько иначе. При остановке вилки репликации перед повреждением на лидирующей нити, синтез на отстающей может продолжаться и приводить к появлению более длинного фрагмента вновь синтезируемой нити.

Эта вновь синтезированная нить может спариться со вновь синтезированной ДНК на лидирующей нити, так что вновь образованная ДНК на лидирующей нити сможет обойти повреждение. После прохождения поврежденного участка восстанавливается нормальная структура вилки репликации.

Рисунк 39. Модель обхода повреждения с восстановлением репликативной вилки (1).

.

Рисунок 40. Модель обхода повреждения с восстановлением репликативной вилки (2).

14.2. Остановка репликации и ресинтез. Привлечение белков репарации

Как мы уже неоднократно говорили, повреждения ДНК можно разделить на те, которые приводят к мутациям, но не способны остановить движение репликативной вилки, и те массивные повреждения ДНК, которые напрямую останавливают ее репликацию. Мы уже обсуждали возможные пути репарации таких повреждений и последующего ресинтеза. Индуцированная повреждениями ДНК остановка репликации приводит к привлечению многих белков репарации к месту повреждения, то есть к остановленной вилке репликации. Как именно происходит это привлечение до сих пор окончательно не ясно. Во время нормального процесса репликации ДНК PCNA (proliferating cell nuclear antigen) образует скользящий зажим и стимулирует процесс репликации ДНК-полимеразами. «Загрузка» PCNA на ДНК осуществляется так называемым «загрузчиком зажима» (clamp loader), которым является фактор репликации С (RFC). При аресте репликации многочисленные факторы могут выполнять функции PCNA и RFC. Функцию PCNA при репарации ДНК берет на себя, вероятнее всего, «зажим, специфический для поврежденной ДНК» (Rad9-1-1 комплекс), состоящий их белков Rad9, Hus1 и Rad1. Эти белки служат стыковочной платформой для многочисленных репарационных белков. Здесь уместно отметить, что Hus1 под действием ионизирующей радиации перемещается из цитоплазмы в ядро, где соединяется с PCNA и Rad9.

Другой человеческий белок Rad17 связан с хроматином еще до повреждения ДНК. В ответ на повреждение он фосфорелируется белком АТМ и затем способствует присоединению к хроматину комплекса Rad9-1-1. У человека и дрожжей показано непосредственное объединение Rad17 с комплексом Rad9-1-1. Rad17 может замещать большую субъединицу комплекса RFC, образуя новый комплекс с малыми субъединицами RFC, обозначаемый Rad17– RFC. Комплекс Rad17– RFC функционирует как загрузчик зажима для Rad9-1-1 и таким образом указывает генам репарации на сайт повреждения. У дрожжей показано, что высокоошибочная низкопроцессивная полимераза DinB взаимодействует с белками Hus1Rad1, а их совместная ассоциация с хроматином является зависимой от Rad17.

15. Современные представления и знания о механизмах активации чекпойнтов и белках, вовлеченных в разные стадии этого процесса

Повреждения, индуцированные в ДНК действием ионизирующей радиации, влияют на пути активации точек сверки (чекпойнтов), которые останавливают движение клетки в G1 и G2 фазах, и вызывает временную задержку в прохождении фазы S. Чекпойнты совместно с репарацией и апоптозом вовлечены в круговорот, который определяет основной ответ клетки на повреждение ДНК. Активация чекпойнт-ответа обычно включает сенсоры и медиаторы повреждений ДНК, переносчики сигнала и эффекторы. Вероятно, главную роль в чекпойнт-ответе играют белки ATR и ATM, а также CHK1 и CHK2-киназы. Также важна роль лежащих ниже эффекторов, таких как P53 и семейство белков-фосфатаз CDC25. Процессы репарации ДНК и геномной стабильности напрямую связаны с активацией чекпойнтов.

Уже не менее 50 лет известно, что облучение вызывает задержку нормального прохождения клеток по циклу. Причем остановки происходят во всех фазах, хотя в G2 их легче всего обнаружить. Раньше эту задержку рассматривали как пассивный ответ клетки, причиной которого были повреждения в ДНК. Было очевидно, что в клетке инициируются особые процессы, помогающие облученным клеткам каким-то образом бороться с возникшими повреждениями и облегчить их репарацию. В 1980 году Пэйтнер с соавторами показали, что подобная задержка или крайне мала или полностью отсутствует в клетках больных АТ, которые в тоже время являются крайне чувствительными к ионизирующей радиации. Затем были выделены дрожжевые мутанты с повышенной чувствительностью к радиации и отсутствием задержки клеточного цикла. К настоящему времени стало понятно, что существуют механизмы «обзора» генома (genome-surveillance), обычно определяемые термином «чекпойнт повреждений ДНК» (DNA damage chekpoint), лишь одним из проявлений которого является задержка клеточного цикла. Современные научные представления допускают, что единство задержек, вызванных облучением на разных стадиях клеточного цикла, оказывается зависимым от активации отдельного чекпойнта повреждений ДНК.

Параллельно изучались и последовательно выстраивались и сами процессы, необходимые для прохождения клеткой всех фаз клеточного цикла. К настоящему времени подтверждено, что клеточный цикл контролируется независимыми регуляторными переходами, которые приводят ДНК в состояние, способное к удвоению и клеточному делению. Эти переходы завершаются активацией циклин-зависимых киназ (CDKs), действием протеолитических путей и изменением состояния хроматина. CDKs являются основными компонентами белковой машины клеточного цикла и их активность строго регулируется несколькими независимыми путями, включая ассоциацию с соответствующими циклинами, фосфорелирование по определенным серин/треониновым или тирозиновым аминокислотным остаткам и связывание со специфическими белками-ингибиторами. Не удивительно, что CDKs являются также и одними из основных мишеней чекпойнт-ответа. Продвижение по клеточному циклу, опосредованное соответствующей белковой машиной, «проверяется» механизмами «обзора», который следит за тем, чтобы клетки не перешли в следующую фазу, пока все события предыдущей фазы не завершены. Эти механизмы «обзора», известные как чекпойнты клеточного цикла, являются идеологически (концептуально) отличными от чекпойнтов ДНК повреждений. Хотя наше современное знание о молекулярных механизмах различных чекпойнтов выявляет все большее их сходство.

Подобно многим другим областям современной биологии, изучение чекпойнтов питается убеждением, что уточнение их молекулярных механизмов будет способствовать пониманию причин геномной нестабильности и рака, так как любой ген, вовлеченный в чекпойнты ДНК повреждений, важен для стабильности генома иили связан с наследственной предрасположенностью к раку. К тому же нарушение чекпойнт-контроля может быть отличительным признаком опухолевых клеток, поэтому большие усилия прикладываются для поиска агентов, которые могли бы сломать эти нарушенные чекпойнты. Подобные агенты можно было бы использовать в противоопухолевой терапии совместно с другими, например с облучением.