Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

К сожалению, как и в случаях MMR и NER, мутации некоторых генов, участвующих в репарации DSBs, приводят к развитию различных наследственных синдромов. Все они характеризуются повышенной клеточной чувствительностью к действию γ-облучения и химических мутагенов и высоким риском развития онкологических заболеваний.

При описании процесса NHEJ мы уже упоминали тяжелый наследственный синдром иммунодефицита, развивающийся при мутациях гена, кодирующего нуклеазу Artemis. Синдромы повышенной радиочувствительности развиваются и в случаях мутаций в других генах, связанных с процессами нуклеазной расчистки места разрыва – RAD50 (ATLD, AT like disease), NBS1 (Нийменгенский синдром ломкости хромосом) и NHEJ – ligIV (ligIV syndrome).

Кроме ATM в передаче сигнала участвует и другая протеинкиназа из семейсва PI3-киназ (фосфоинозитол-3-киназы) – ATR (ataxia-telangiectasia related), сходная с ней по структуре и хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе. Только в 2003 году было показано, что нарушение репарации ДНК у больных синдромом Секеля, характеризующегося повышенной чувствительностью к ионизирующей радиации, связано с мутацией, инактивирующей ген АТR. ATR включается несколько позднее, пик ее активности наступает через 2–4 часа после повреждения ДНК. При отсутствии АТМ ATR частично берет на себя ее функции. Недавно показано, что ATR образует гетеродимер со специфическим белком ATRIP (ATR interacting protein), что важно для чекпойнт-сигнала, хотя механизм этого влияния остается неизвестным.

Но есть целая группа хорошо изученных заболеваний, от которых страдает достаточно большое число пациентов, при которых мутации несут гены, вовлеченные в процессы гомологической рекомбинации и глобальный клеточный ответ на повреждения ДНК. Эти заболевания мы рассмотрим более подробно, так как основанные на них клеточные модели позволили разобраться в деталях многих процессов.

Тяжелое наследственное заболевание атаксии-телеангиэктазии (АТ) или синдром Луи-Бар характеризуется расстройством движения (атаксией), расширенмием капилляров кожи и роговицы (телеангиэктазией), врожденным иммунодефицитом, нейродегенеративными изменениями, чувствительностью к ионизирующему излучению, резко повышенной предрасположенностью к опухолевым заболеваниям и ускоренным старением. Это заболевание очень подробно описано и является одним из «синдромов нестабильности генома» В различных человечечких популяциях АТ встречается с частотой от 1:40 000 до 1: 200 000 рождений. Гетерозиготное носительство этого заболевания распространено гораздо шире – по различным данным от 2 % до 8 % населения несут мутации, приводящие к АТ, в гетерозиготном состоянии. К тому же это гетерозиготное носительство также, как и сама АТ сопряжено с повышенным риском новообразований.

Традиционно сложилось представление о том, что повышенная чувствительность АТ– клеток к радиации является прямым результатом дефекта репарации повреждений, вызываемых ионизирующей радиацией. Это было самым распространенным объяснением этиологии данного заболевания. Но многочисленные исследования не обнаружили достоверного изменения кинетики ликвидации как одно– так и двунитевых разрывов ДНК в клетках больных АТ по сравнению со здоровыми донорами после облучения. При этом большинство, если не все изученные штаммы клеток АТ, имеют сниженный и растянутый по времени репаративный синтез ДНК после действия ионизирующей радиации.

Долгое время при изучении АТ основным оставалось, основанное на выявленных методом изучения внепланового синтеза ДНК четырех группах комплементации, представление о существовании четырех различных генов. Прогресс в этой области был крайне медленным, несмотря на ярко выраженный клеточный фенотип, который использовали для получения коплементирующей ДНК. Но в 1995 году наконец-то было доказано, что у всех больных АТ поврежден один и тот же ген АТМ, картированный на 11 хромосоме (11q22-23). Этот научный прорыв резко ускорил изучение атаксии-телеангиэктазии. Особенно интересным оказался С-концевой домен белка АТМ, содержащей 400 аминокислот. Эта область показывает явное соответствие сиквенсу домена 100кД каталитической субъединицы особого белка – сигнального переносчика-медиатора – фосфатидилинозитол-3' киназы (PI-3 киназы) человеческих клеток и соответствующего ей дрожжевого белка Vps34.

Ген АТМ кодирует белок с молекулярным весом 350.6 кД, содержащий 66 экзонов. Это открытие подтвердило наличие только одного гена АТМ и показало, что описанные ранее различные группы комплементации АТ являются артефактом и свидетельствуют только о большом индивидуальном разнообразии данного заболевания на клеточном уровне. К настоящему времени обнаружено около 80 мутаций, приводящих к инактивации гена АТМ и развитию у пациентов атаксии-телеангиэктазии, и несколько меньшее число характерных для различных популяций полиморфизмов, не влияющих на активность белка АТМ. Таким образом к настоящему времени сложилось представление о том, что высокая вариабельность степени выраженности различных клинических признаков атаксии-телеангиэктазии все же основана на мутациях в одном гене, продукт которого вовлечен во множество белок-белковых взаимодействий. Именно от этих взаимодействий и зависит характер и тяжесть заболевания в каждом конкретном случае.

К настоящему времени сложилась следующая картина, описывающая роль АТМ в клетке. Протеинкиназа АТМ является переносчиком сигнала на начальном этапе клеточного ответа на появление двунитевых разрывов ДНК. Она действует с самых первых минут после повреждения, фосфорелируя целый спектр белков-мишеней и запуская таким образом сразу несколько различных сигнальных путей. Преимущественная активация того или иного пути и приводит к различному протеканию репарационных процессов в клетке. Пик АТМ-зависимого ответа наступает через полчаса после действия повреждающего агента.

Рисунок 27. Белки – мишени пртеинкиназы АТМ

До сих пор не совсем ясно, каким образом активируется сама АТМ, обычно находящаяся в клетке в неактивной гомодимерной форме. При появлении двунитевых разрывов ДНК две молекулы АТМ взаимно фосфорелируются и гомодимер распадается на две активные протеинкиназы. Не ясно до конца и то, каким именно образом гомодимер ATM воспринимает сигнал о повреждении ДНК. Вероятно, неактивная АТМ связывается с белками системы репарации неспаренных оснований MSH2 и MSH6. Можно предположить, что система MMR распознает повреждения, вызванные ионизирующей радиацией, образуя молекулярные «строительные леса», которые позвляют АТМ фосфорелировать СНК2, активируя таким образом чек-пойнт S-фазы. То есть для быстрой реакции АТМ на облучение необходима и нормальная активность системы MMR. Вероятнее всего, прямого взаимодействия АТМ с ДНК нет. Она фосфорелирует гистон Н2АХ, что привлекает белки BRCA1 и NBS1 (являющийся частью комплекса MRN и прямой мишенью АТМ, то есть главным переносчиком сигнала с АТМ на MRN), которые АТМ также фосфорелирует. Основные мишени АТМ показаны на рис. 27. Существующие данные утверждают, что именно АТМ определяет ранний чекпойнт-ответ, а ATR действует позднее, когда уже идет репарация повреждений ДНК, как вызванных ионизирующей радиацией, так и ультрафиолетовым изличением или остановкой вилок репликации

Регуляторная роль АТМ в передаче сигналов в клетке после действия ионизирущей радиации крайне высока. В зависимости от того, какой именно белок Ku70 или АТМ будет действовать в первые минуты после образования двунитевого разрыва будет осуществляться тот или иной путь воссоединения концов (NHEJ или HHR соответственно). То есть АТМ контролирует именно путь воссоединения двунитевых разрывов с помощью гомологической рекомбинации.

Белки BRCA1 и BRCA2, гетерозиготное носительство мутаций в генах которых приводят к наследственным формам рака груди, также вовлечены в процесс репарации DSB. Многими авторами показано, что они выявляются в фокусах репарации методами иммунопреципитации. Эти белки не являются гомологами и выполняют в клетках различные функции. Мыши, нокаутные по этим генам гибнут еще во время эмбрионального развития.

На схеме строения BRCA1 (1863 аминокислоты) и BRCA (3418 аминокислот), изображенной на рис. 28, видны ключевые домены обоих белков. Это неродственные белки. BRCA1 имеет BRCТ-мотив в С-конце (вероятно, служащий для белок-белковых взаимодействий и организации репарационных ферментов в комплексы), SQ-кластер, в котором расположены сайты фосфорелирования этого белка белками ATM и ATR, и ринг-домен на N-конце, также служащий для белок-белковых взаимодействий.

Для BRCA2 характерен очень большой 11 экзон, содержащий 8 BRC-повторяющихся мотивов, необходимых для связывания белка RAD51. Фрагмент BRCA2, содержащий аминокислотные остатки 788-1064, образует комплекс с RAD51, и с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания удалось показать, что оба белка локализованы in vivo в одних и тех же элементах синаптонемного комплекса.

Мыши, нокаутные по этим генам гибнуть еще во время эмбрионального развития.

Рисунок 28. Схематическое изображение белков BRCA1 и BRCA2.

BRCA1 и BRCA2 обнаружены только у высших эукариот, что говорит о роли этих белков в организации сложных мультибелковых комплексов, участвующих во все более усложняющихся реакциях увеличивающихся геномов и способных вовлекаться в разнообразные клеточные процессы и связывать их между собой.

Продукт гена BRCA1 (опухолевого гсна-супрессора) обладает ярко выраженной способностью к образованию комплексов с другими белками. Многочисленные белки репарации ДНК – BRCA1, MSH2, MSH6, MLH1, ATM, BLM и комплекс RAD50-MRE11-NBS1 могут быть обнаружены при совместной иммунопреципитации с ним в рамках единого комплекса, называемого BRCA1-associated surveillance complex (BASC). По современным представлениям BRCA1 совместно с комплексом Mre11-RAD50-NBS1 (MRN) являются основными белками – сенсорами, которые участвуют в распознавании двунитевых разрывов ДНК. BRCA1 взаимодействует с большим числом других белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, и служит якорем и координатором для дальнейшей сборки уже упомянутого белкового комплекса BASC, и, вероятно, одновременно является адаптором, предоставляющим дополнительные мишени для фосфорелирования киназам-переносчикам сигнала.

Многие белки, участвующие в передаче сигнала о повреждении ДНК и называемые медиаторами, содержат два повторяющихся домена, обнаруженных впервые в С-конце белка BRCA1 и названных поэтому BRCТ-доменами. Их обычно называют BRCТ-содержащими белками, они вовлечены в чекпойнт-ответ, распознают повреждения ДНК и привлекают другие белки, которые облегчают передачу сигнала вниз по сигнальному пути и репарацию ДНК. Это TopBP1 (topoisomerase II binding protein I), 53BP1 (P53 binding protein I) и MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein I), белок Rad9 дрожжей, известный своей ролью в контроле клеточного цикла. BRCТ-домены имеют и уже упоминавшиеся ДНК-полимеразы λ и μ.

В тоже время белок BRCA1 способен к убиквитин-лигазной активности, которую он проявляет в комплексе с особым белком BARD1 (BRCA1-assosiated RING-domain protein 1). Белок BARD1, связываясь с белком Р53 и принимая участие в его стабилизации, является одним из триггеров апоптоза. Во время S-фазы клеточного цикла белки BRCA1, BARD1 и RAD51 находятся в единых комплексах, выявляемых как “BRCA1 nuclear dots”, и при повреждении ДНК в этой фазе мигрируют в зону репаративной реакции.

Наследственные мутации в другом супрессорном гене, BRCA2, ответственны в 50 % случаев за предрасположенность к раннему развитию рака молочной железы у женщин. Мышиные эмбрионы с дефектным геном BRCA2 обладают повышенной чувствительностью к γ-лучам и погибают на ранних стадиях развития. С-концевой фрагмент (36 аминокислотных остатков) белка BRCA2 мыши (всего 3328 остатка) взаимодействует с N-концевым районом белка mRad5l мыши (43 аминокислотных остатка). Гены, кодирующие белки BRCA2 и mRad5I, экспрессируются в эмбрионах одновременно, поэтому очевидна функциональная значимость этого взаимодействия.

Рисунок 29. Взаимодействие между белками BRCA2 и hRAD51.

На рис. 29 показано, как именно RAD51 человека взаимодействует с районом BRC повтора, где происходит взаимопроникновение между мономерами RAD51 и BRCА2. Предполагается, что при этом взаимодействии мономеры RAD51 выстраиваютсяв одну линии на области BRC повтора, в то время как «хвостовой» С-конец белка (800 аминокислот) BRCA2 человека связывается с однонитевой ДНК. Этот хвост отделен от района BRC-повтора областью, сотоящей из трех олигонуклеотид-связывающих доменов (ОВ1ОВ2ОВ3), способных связываться с онДНК и «башней» между ОВ2 и ОВ3, содержащей трехспиральный узел, и так образует целый комплекс, способный смещать RPA и заменять его RAD51-филаментом. Причем надо заметить, что строение ОВ2ОВ3 доменов достоверно сходно со строением белка RPA.

Обсуждая роль рекомбинации в стабильности клеточного генома, нельзя обойти вниманием и участие в этих процессах геликаз семейства RecQ.

Гомологи геликазы RecQ из Е. coli обнаружены практически у всех организмов. Их строение показано на рис. 30.

RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III играют важную роль не только в гомологической рекомбинации, но и в других клетчных процессах, таких как репликация и контроль клеточного цикла. Как уже говорилось, именно RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III способны проводить требующие топологических изменений ДНК некросссоверные разрешения Холлидеевской структуры. Такое разрешение процессов митоточеской рекомбинации у высших эукариот позволяет избежать возникновения разрывов в донорной ДНК и таким образом не допустить хромосомных перестроек в случае если в пороцесс гомологической рекомбинации будут вовлечены некгомологичные хромосомы или негомологичные участки гомологичных хромосом.

У человека в процессах репарации двунитевых разрывов ДНК крайне важны белки WRN и BLM, которые также являются гомологами RecQ-геликазы E.coli, и связаны с развитием таких тяжелых синдромов, как синдром Вернера (ускоренное старение взрослых) и синдром Блюма соответственно. Оба эти синдрома характеризуются признаками ускоренного старения и повышенным риском опухолеобразования. Дефект другой RecQ-подобной геликазы – RecQ4 – приводит к развитию еще одного крайне редкого заболевания – синдрома Расмунда-Томсона.

Рисунок 30. Сравнительное строение RecQ-подобных геликаз у различных видов.

Больные, страдающие синдромом Блюма (BS) характеризуются крайне малым весом при рождении и остановкой роста, мужским гипогонадизмом, сниженной фертильностью и ранней менопаузой у женщин, предрасположенностью к диабету и новообразованиям. На лице под воздействием света развивается характерная телеангиэктазия в форме «бабочки», голова больных удлинена, у них резко снижен иммунитет и они легко подвержены инфекциям. В основной популяции больные BS крайне редки, но в популяции евреев-ашкенази частота заболевания достигает 1: 58 000. Эта болезнь является аутосомным рецессивным заболеванием. Исследования клеточных штаммов от пациентов с BS показали, что у них существенно длинее, чем в нормальных клетках время клеточного цикла, при этом за одно и тоже время клетки BS способны синтезировать вдвое меньше ДНК, чем контрольные и удлинение вновь синтезированной нити ДНК происходит медленнее. Накапливающиеся же промежуточные продукты репликации имеют размер 20кБ, что достоверно больше, чем фрагменты Оказаки. При этом клетки BS сохраняют нормальный уровень ДНК-полимераз.

В клетках BS в культуре наблюдается большое количество спонтанных разрывов и перестроек и повышенный уровень соматической рекомбинации. Очень высоко количество особых хромосомных аберраций – квадрирадиальных фигур, названных так за то, что хромосомы располагаются в них в четырех направлениях.

В клетках BS наблюдается также повышенный уровень спонтанных мутаций, причем этот эффект затрагивает как кодирующие участки ДНК, так и некодирующие повторы (т. е. транскрибируемую и нетранскрибируемую ДНК в равной степени).

В 1993-94 годах ген синдрома Блюма был картирован и сиквенированием и получил название BLM (Bloom-mutated). Он расположен на 15 хромосоме – 15q26.1 и кодирует белок в 1417 аминокислот с молекулярной массой 159 кД. При изучении этого белка была обнаружена его гомология с тремя уже известными геликазами. Участок 649-1041 содержит семь консервативных геликазных доменов идентичных аналогичным участкам человеческого RесQL (44 %), Saccharomyces cerevisia SGS1 (43 %) и Escherichia coli RecQ (42 %) белков. Все эти белки относятся к RесQ-геликазам. RесQ-белок Е. coli обладает ДНК-зависимой АТФ-азной и ДНК-геликазной активностями и может перемещать однонитевую ДНК в направлении 3'-5'. Также он вовлечен в пострепликативную репарацию УФ-повреждений. Дрожжевой белок SGS1 способен к взаимодействию с дрожжевыми Top2p и Top3p топоизомеразами. Продукт человеческого гена RесQL, выделенного из клеток HeLa, проявляет ДНК-зависимую АТФ-азную, ДНК-геликазную активности, а также способность к 3'-5' ДНК транслокациям. По аналогии BLM должен также обладать подобными свойствами.

В области 588–661 также были обнаружены три коротких мотива, подобных тем, которые описаны среди филогенетического многообразия большой субъединицы РНК полимеразы II. Роль этих мотивов неясна. Никакой другой гомологии в описанной аминокислотной последовательности не обнаружено, хотя негеликазные участки также имеют необычную структуру. В них очень много кислых, основных и полярных аминокислот, причем 13 % N-концевой последовательности и 14 % C-концевой составляют остатки серина. Функция столь сложных частей описанного белка остается пока неизвестной. Хотя возможно сделать несколько предположений. Эта негеликазная часть белка BLM близка по составу к негеликазной части уже упомянутого нами дрожжевого белка Sgs1 – самого близкого к BLM и по размеру. Мутанты по этому гену характеризуются медленным ростом, нерасхождением хромосом в митозе и ошибками их сегрегации в мейозе, а также повышенной частотой рекомбинации. Повышенная частота хромосомных перестроек, нарушение репликации и пониженная топоизомеразная активность характерны и для клеток больных BS. Можно предположить, что негеликазная часть этих белков связана именно с поддержанием стабильности хромосом в клетке.

При анализе последовательностей BLM от 10 различных клеточных линий BS было обнаружено 7 мутаций, четыре из которых приводили к остановке синтеза мРНК и образованию укороченной формы белка в 185, 271, 515 и 739 аминокислот, то есть без геликазной области. Причем последняя из этих мутаций наблюдалась у всех (в данном исследовании их было 4) пациентов евреев-ашкенази. Было высказано предположение, что почти все больные синдромом Блюма в популяции евреев-ашкенази несут одну и ту же мутацию. Еще две миссенс мутации обнаружены в консервативной области гомологичной RесQ и одна замена цистеина на серин в С-конце. Не совсем ясно, каким образом подобная мутация приводит к появлению BS фенотипа. При этом можно предположить, что белок BLM не является необходимым для сохранения жизни индивидуума, так как у больных этот белок полностью инактивирован. Вероятно, какие-то другие факторы в клетке способны частично замещать утерянную BLM активность.

BLM фосфорелируется белком ATM, он играет важную роль в разрешении холидеевской структуры и способен связываться с RAD51 и с BRCA1, входя в состав так называемого BASC (BRCA1 associated genom surveiiance complex) – комплекса, по современным представлениям являющегося сенсором повреждений генома.

Синдром Вернера или прогерия взрослых (WS) – достаточно редко встречающееся аутосомное рецессивное заболевание, характеризующееся всеми симптомами старения в более раннем возрасте, было впервые описано Вернером в 1904 году. Больные рано начинают выглядеть старообразно, еще в возрасте до 20 лет резко седеют и теряют волосы, имеют кожные изменения, подобные таковым при склеродерме, ранние морщины, «старческий» голос – все это позволяет говорить об ускоренном старении. WS характеризуется также широким спектром патологии, обычно связываемой с возрастными изменениями. Это атеросклероз, остеопороз, диабет, катаракта, различные типы доброкачественных и злокачественных опухолей.

Болезнь активно развивается в возрасте от 20 до 40 лет, обычно больные умирают от сердечно-сосудистой недостаточности или рака, средний возраст смерти – 47 лет. Также при этом заболевании наблюдается маленький рост, гиперпигментация, гиперкератоз, сухость кожи, телеангиэктазия, "птичье" лицо, гипогонадизм и пониженная фертильность у лиц обоего пола. Исследования на клеточном уровне подтверждают ускоренное старение у больных WS. Известно, что популяция фибробластов в культуре способна к ограниченнму числу удвоений, причем клетки, взятые от более молодых индивидуумов, обладают более высокой репликативной способностью, чем клетки особей старшего возраста. Число подобных удвоений для каждого вида животных различно и носит название числа или лимита Хейфлика. Для человека лимит Хейфлика равен примерно 50–60. Было проведено сравнение клеток WS с клетками здоровых доноров, как такого же, так и более старшего возраста. Клетки больных WS растут значительно медленнее, раньше демонстрируют морфологические изменения, характерные для "стареющих" клеточных культур, и значительно быстрее исчерпывают свой пролиферативный потенциал – обычно после 10–20 удвоений популяции. При этом наблюдается большее сходство с клетками, взятыми от пожилых доноров. Вероятно, именно с этим связано характерное для синдрома Вернера состояние кожных покровов.

Пониженная способность к репликации связана с геномной нестабильностью. Повышенный уровень хромосомных перестроек наблюдается как in vitro, в культурах фибробластов WS, так и in vivo, в фибробластах и лимфоцитах больных. Также было показано увеличение уровня соматических мутаций в клетках WS., существенно расширившие наши знания об этом заболевании. Ген WS, названный исследователями WRN, был картирован на 8 хромосоме в районе р12-21. и секвенирован. Белок, кодируемый этим геном, состоит из 1 432 аминокислот и в своем центральном домене имеет семь ранее описанных мотивов, характерных для суперсемейства ДНК и РНК геликаз. Присутствие последовательности DEAH и участка связывания АТФ подтверждает, что этот белок является функциональной геликазой.

Геликазный домен WRN имеет достоверную гомологию с другими геликазами – RecQ E. coli, Sgs1 S. cerevisiae, RECQL человека. При этом как С, так и N конец не обнаруживают гомологии ни с какими ранее описанными белками. Обычно геликазы работают в комплексе с другими белками и именно С и N концы отвечают за связывание с ними. При этом оказалось, что любая мутация, вне зависимости от того, затрагивает она геликазную область или нет, приводит к полной потерей белком своей функции. Первые четыре мутации, описанные при синдроме Вернера, были выявлены именно в С-конце. Эти мутации были обнаружены у 83 % японских пациентов, они приводили к синтезу несколько укороченного белка с интактным геликазным доменом. После дальнейшего поиска мутаций и изучения дополнительно нескольких семей больных были обнаружены еще 5 мутаций. Две из них находились в N-конце и приводили к явно укороченному белку, сохранившему только часть N-концевого домена, а три остальные располагались в геликазной области и нарушали ее строение. Ген WRN исследован очень подробно, в нем выделены 35 экзонов размером от 68 пар оснований (14 экзон) до 768 (35 экзон), геликазная область занимает 14–21 экзоны. До сих пор остается неясным, каким образом мутации гена WRN приводят к такому сложному системному заболеванию, как синдром Вернера.

Белок WRN является не только геликазой но и 3’-5’-экзонуклеазой, он способен связываться с RPA, Ku, P53. Фосфорелирует его DNA-PK. Вероятно, он вовлечен не только в HHR, но и в NHEJ.