Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

9.2. Однонитевой отжиг (SSA, single strand annealing)) по прямым повторам

В дополнение к каноническим системам репарации путем гомологической рекомбинации (HRR) и негомологического воссоединения концов (NHEJ) есть еще один неконсервативный путь, называемый однонитевым отжигом по прямым повторам. Главное в этом процессе – сплайсинг двух концов ДНК по прямым повторам в двунитевых областях несколько отдаленных от концов DSB, который приводит к сохранению только одной копии повтора и делетированию всей последовательности между повторами. Мы рассмотрим SSA до репарации DSB путем гомологической рекомбинации, и не будем подробно останавливаться на белках, вовлеченных в процесс HR.

SSA обычно начинается с формирования нуклеазой или геликазой однонитевых выступающих концов на двунитевом разрыве ДНК. Затем следует отжиг гомологических последовательностей на открытых нитях, обрезание «лишних» концов и лигирование. Весь процесс характеризуется разными уровнями возможной гомологии – от микрогомологиий до гомологичных последовательностей, содержащих сотни оснований. В настоящее время это – самый сложный для объяснения момент SSA (может быть существует несколько независимых путей). Общая схема этого пути репарации показана на рис. 24.

Первый шаг таков – концы ДНК расщепляются эндонуклеазами, скорее всего – входящими в комплекс MRN (matrix rearrengement nucleases), например, MRE11, благодаря ее хорошей способности выравнивать ДНК и щепить ее только по направлению 3’-5’ и останавливаться, как только 5’-концы разных нитей смогут гомологически спариться. При этом образуются такие же длинные концы, как и при первом шаге HR. Необходимыми для процесса SSA являются геликазы WRN и BLM (Bloome syndrome mutated). 3’-концы, устойчивые к MRE11 и WRN, могут быть расщеплены ДНКазой III, основной 3’-5’ экзонуклеазой млекопитающих.

Рисунок 24. Репарация путем однонитевого отжига по прямым повторам (SSA)

При поиске гомологии по прямым повторам выступающий конец онДНК покрывается белком RPA, а на него надевается гептамер белков RAD52, который способствует распознаванию гомологии и объединению между комплементарными концами. Как только один из выступающих концов обнаружит гомологию с соседней нитью, гомологи спарятся (отожгутся) друг с другом, а лишние концы будут «съедены» знакомой нам по системе NER нуклеазой ERCC1/XPF (RAD1/RAD10 у дрожжей)

В отличие от классического пути репарации двунитевых разрывов с помощью гомологической рекомбинации, SSA не нуждается ни во второй, донорной двунитевой молекуле ДНК, ни в белке RAD51, но нуждается в белке RAD52. Сшивание, вероятно, ведет лигаза I. Процесс SSA может разделяться на несколько различных путей в зависимости от необходимой длины прямого повтора, по которому будет проходить отжиг. Возможно, что в тех лучаях, когда для SSA достаточно микрогомологии, в процесс вовлечен гетеродимер Ku. Но многие исследователи утверждают, что SSA по микрогомологии может проходить и без участия Ku, то есть без активации нуклеазы-геликазы WRN. Вероятно, сам процесс SSA является поиском более удобного и быстрого пути репарации двунитевых разрывов, чем гомологическая рекомбинация, который вела природа в процессе эволюции. Так что SSA можно рассматривать как варианты перехода между HRR и NHEJ – при протяженной гомологии – этот процесс ближе к HRR, а при микрогомологии – к NHEJ. Процесс SSA описан в первую очередь у дрожжей Schizosaccharomyces pombe.

9.3. Репарация путем гомологической рекомбинации (HRR)

Репарация двунитевых разрывов путем гомологической рекомбинации (HR) считается безошибочным и, как уже не раз говорилось, осуществляется во время поздней S-фазы или G2-фазы. Общая схема этого процесса в клетках эукариот показана на рисунке. Необходимо обратить внимание, что на завершающем этапе HR может осуществляться двумя принципиально различными способами. Первый связан с разрешением классической холлидеевской структуры либо путем кроссинговера, либо путем генной конверсии, сопровождающимся образованием разрывов и в донорной, и в реципиентной ДНК и последующим, реальным (физическим) обменом соседними участками двунитевой ДНК. При репарации путем HR по второму механизму разрывы в донорной ДНК не образуются, а идет инициированный свободным концом ДНК ограниченный синтез в районе повреждения, а затем вновь синтезированная нить вытесняется и отжигается со вторым свободным концом в реципиентном дуплексе. Таким образом, даже если рекомбинация произойдет между негомологичными хромосомами или негомологичным участкам гомологичных хромосом, то это не приведет к появлению хромосомных перестроек. Это очень важно для высших эукариот, так как их геном состоит на 90 % из повторяющихся последовательностей, опасность рекомбинации между которыми достаточно велика.

В процесс репарации путем гомологической рекомбинации вовлечено большое число белков: RAD51, RAD52, RAD54, BRCA1, BRCA2, RAD51-паралоги: RAD51b,c,d, XRCC2, XRCC3 и комплекс MRN. Кроме этих белков, непосредственно участвующих в самом процессе рекомбинации, есть немало факторов, служащих триггерами клеточного ответа на повреждения ДНК, что приводит к изменению параметров клеточного цикла и запуску репарационных реакций. Таким триггерами являются протеинкиназы ATM (ataxia-teleangiectasia mutated), ATR (ataxia-teleangiectasia related), DNA-PK (DNA-dependent protein kinase). Все они являются гомологами PI-3-киназы (фосфатидилинозитол-3' киназы). Известно, что PI-3 киназа активно участвует в передаче сигналов в клетке и опосредует клеточный ответ на действие различных факторов роста, триггерных факторов клеточной дифференцировки и инсулин.

Запускает процесс HRR протеинкиназа АТМ, которая каким-то образом, вероятнее всего через конформационные изменения ДНК, «чувствует» DSB. Затем она переходит в активную форму путем автофосфорелирования по серину в 1981 положении (Ser-1981) и, может быть, связывается с DSB. Активированная АТМ фосфорелирует гистон Н2АХ, что привлекает белки BRCA1 (breast cancer 1) и NBS1 (Niejmegen breakage syndrome, Нийменгенским синдромом ломкости хромосом), которые АТМ также фосфорелирует. NBS1 является частью комплекса MRN (NBS1/RAD50/MRE11) и прямой мишенью АТМ, то есть главным переносчиком сигнала с АТМ на MRN-комплекс. Белок BRCA1 служит якорем и координатором для дальнейшей сборки репарационного комплекса.

Рисунок 25. Репарация двунитевых разрывов путем гомологической рекомбинации (HRR).

Комплекс MRN (обладающий 3’-5’-экзонуклеазной активностью), скорее всего совместно с другими экзонуклеазами (обладающими 5’-3’-активностью) ращепляет ДНК для создания у двунитевого разрыва выступающих концов, которые нужны для их перекрывания в процессе рекомбинации. MRE11, вероятно играет в этом комплексе главную роль, так как обладает одновременно и экзо(3’-5’) – и эндонуклеазной (со сродством к днДНК) активностями. В состав MRN кроме NBS1 и MRE11 входит еще и АТФаза RAD50, раскручивающая ДНК. Общая схема этого пути репарации показана на рис. 25.

BRCA1 привлекает к разрыву BRCA2, который облегчает загрузку белка RAD51 (гомолог RecA) на одетую RPA (гомолог SSB-белка) нить ДНК. То есть у эукариот RAD51 вытесняет RPA с нити в комплексе с BRCA2. Участвующие в реакции паралоги RAD51 в свою очередь привлекают белки RAD52 и RAD54, может быть с помощью WRN и BLM геликаз. Так формируется активный 3’-конец ДНК, ведущий процесс гомологического спаривания и обмена нитей. RAD52 помогает RAD51 образовывать промежуточные комплексы при обмене нитей. Мономеры RAD52, как и в процессе SSA, образуют гептамерное кольцо, способное надеваться как на однонитевую, так и на двунитевую ДНК. RAD54 обладает АТФазной активностью и, взаимодействуя с геликазами, изменяет топологическую структуру ДНК. Эти топологические изменения, препятствуя суперскручиванию ДНК, облегчают RAD51 и RAD52 ее «распрямление» в районе DSB и способствуют их взаимодействию с другими белками репарации. Предполагается, что в некоторых случаях RAD54 может являться именно тем белком, поведение которого приводит к выбору пути репарации между SSA и HRR.

Известно, что в этом ДНК-белковом комплексе также обнаружен антионкоген Р53, способysq связываться с белками BRCA1, RAD51, WRN и BLM.

Геликазы WRN и BLM в процессе синапсиса внедряются в образовавшиеся холидеевских структуры. Именно в этот момент решается, каким образом эти структуры будут разрешены – с кроссинговером или без него. То есть эти геликазы, вероятнее всего, способны «открутить» донорную ДНК после завершения репаративного синтеза от места спаривания без ее разрывов. В эукариотических клетках существует и специфическая для структуры Холлидея геликазная-эндонуклеазная активность, способствующая ее разрешению, которая может быть аналогична RuvABC-активности Е. coli. У S. cerevisiae выделен комплекс Mus81-Mms4, который способен к правильному разрешению Холлидеевской структуры. Белок Mus81 был идентифицирован по его взаимодействию с белком Rad54. Он имеет гомологию с субъединицами структурно-специфической эндонуклеазы ERCC1/XPF (Rad1/Rad10), принимающей участие в NER. Также в разрешении Холлидеевских структур при HRR принимают участие паралоги белка Rad51 (XRCC2 и XRCC3, о которых мы подробнее поговорим ниже).

До сих пор точно не известно, какие ДНК-полимеразы и лигазы участвуют в процессе HRR.

Вероятно, роль HRR более значительна в эмбриональных клетках, чем в клетках взрослого организма. Об этом свидетельствует то, что нокаутные по основным генам HRR мыши погибают еще на эмбриональных стадиях, а клетки, мутантные по этим генам, вполне жизнеспособны

Завершая изучение процессов репарации DSBs, необходимо остановиться на механизмах, которые их запускают. К настоящему времени накоплены многочисленные экспериментальные данные, указывающие на то, что для репарации DSBs необходимо ремоделирование хроматина. Это ремоделирование происходит при строго ассоциированном с образованием DSB специфическом фосфорилировании С-концевого серина-139 вариантного гистона Н2АХ. Гистон Н2АХ (replacement histone) является одним из известных вариантов корового гистона Н2А, который, в отличие от основного Н2А и других коровых гистонов, может быть встроен в хроматин в течение всех фаз клеточного цикла, а не только во время S-фазы. Мегабазные участки хроматина, покрывающие DSB, можно легко визуализировать в ядрах или экстрактах облученных клеток как фокусы фосфорилированного по серину-139 гистона Н2АХ (названного γ-Н2АХ) с помощью специфических антител на фосфорилированный короткий пептид, соответствующий С-концу Н2АХ. Эти фокусы могут служить маркерами DSBs и способствовать изучению их индукции и процессинга. Фосфорилирование гистона Н2АХ происходит в первые же минуты после образования DSB после γ-облучения, достигает максимума через 30–60 минут и способствует разрыхлению хроматина и эффективному связыванию белка Кu с образующимися концами ДНК. В то же время нужно помнить, что в нормальных клетках млекопитающих только около 5 % нуклеосом содержит гистон Н2АХ, а их основная часть содержит обычный коровый гистон Н2А, который при образовании DSB не фосфорилируется. Дефосфорилирование гистона γ-Н2АХ в клетках млекопитающих достоверно коррелирует с быстрой репарацией основной массы DSB системой NHEJ в течение первых 1.5–2 часов после γ-облучения. Однако небольшая часть фокусов γ-Н2АХ остается в ядрах в течение длительного времени, вплоть до 24 часов. В этих фокусах постепенно накапливается комплекс MRN и белок BRCA1, что указывает на возможную роль γ-Н2АХ и в репарации DSB путем HR.

Вероятно, ATM-зависимое фосфорилирование гистона Н2АХ все же не является необходимым условием самой репарации, а является лишь звеном в механизме, останавливающем клеточный цикл в ответ на повреждения ДНК (DNA damage checkpoint).

В клетках высших эукариот гистон Н2АХ фосфорилируется протеинкиназой ATM и ее инактивация приводит к нарушению этого фосфорилирования в первые минуты после облучения. Но в радиочувствительных клетках пациентов, дефектных по киназе ATM и страдающих наследственным заболеванием атаксия-телеангиэктазия (AT), фокусы γ-Н2АХ после облучения все же выявляются. По-видимому, эти фокусы ассоциированы с сайтами репликации ДНК, так как в остановившихся в местах повреждения ДНК репликативных вилках фосфорилирование гистона Н2АХ проводит другая протеинкиназа – ATR.

В геномах высших эукариот присутствуют многочисленные повторяющиеся последовательности ДНК. У человека, например, такие повторы занимают более 40 % всего генома. И этого следует, что при образовании DSBs вероятность одновременного образования нескольких разрывов по гомологичным повторам достаточно высока. Это может привести к возникновению хромосомных перестроек за счет неравной рекомбинации между повторами, локализованными на разных хромосомах. Впрочем, вклад рекомбинации между негомологичными хромосомами в процессе HRR относительно невелик. Подсчитано, что чаще всего – примерно в 100 раз чаще, чем другими способами, – репарация путем HR происходит при гомологическом взаимодействии сестринских хроматид в поздней S– или G2– фазе клеточного цикла. Однако и в этом случае необходим контроль неравных сестринских обменов, возможных при неправильном совмещении близко расположенных повторов.

Впервые необходимость существования механизмов защиты от рекомбинации ДНК по повторам в клетках высших эукариот была осознана тем же самым М. Радманом, который открыл SOS-ответ у прокариот. Он предположил, что клетка избегает рекомбинации между повторами благодаря некоторой дивергенции их нуклеотидных последовательностей. Такая дивергенция при попытках рекомбинации ведет к образованию большого количества неспаренных нуклеотидов, распознаваемых системой MMR, которая и подавляет рекомбинацию. Эта гипотеза нашла экспериментальное подтверждение: в клетках мышей система MMR примерно в 10 раз снижала репарацию DSB путем HR даже при небольшой (1.5 %) дивергенции последовательности нуклеотидов. В тоже время способность системы MMR подавлять рекомбинацию между реальными повторами в геномах высших эукариот имеет некоторые ограничения, природа которых неясна. Практически во всех известных случаях редкой внутримолекулярной гомологической рекомбинации между Alu-повторами в геноме человека степень дивергенции последовательностей была более 5 %. Одновременно в геноме мышей и человека имеется много достаточно стабильных дупликаций с очень высокой степенью гомологии (более 98 %).

Вторая гипотеза возможного подавления рекомбинации между повторами основана на том, что основной фермент поли-АДФ-рибозилирования PARP-1 (полимераза поли-АДФ-рибозы 1) способен быстро связывать образовавшиеся DSBs. Автомодификация PARP-1, то есть осуществляемое им самим поли-АДФ-рибозилирование, ведет к синтезу отрицательно заряженных нитей поли-АДФ-рибозы рядом с разрывом ДНК. Эти нити или подавляют сборку рекомбинационного комплекса, или просто электростатически отталкивают способный участвовать в рекомбинации второй дуплекс ДНК. Таким образом возможная рекомбинация подавляется еще до выяснения степени гомологии между повторами.

Косвенным подтверждением этой гипотезы является то, что ферментоы поли-АДФ-рибозилирования появляются в течение биологической эволюции одновременно с появлением в геномах большого количества повторов, но до сих пор остается неясным, может ли сама PARP-1 (или другие ферменты этой группы) специфически распознавать разрывы, локализованные именно в повторах. Существуют экспериментальные данные, что PARP-1 может активироваться при взаимодействии с известным репрессором транскрипции YY1, распознающим в геноме человека ретропозоны семейства Alu. Этот репрессор играет важную роль в негативном контроле некоторых ретровирусов и способен модифицировать хроматин с помощью гистоновых деацетилаз. Впрочем, активность YY1 как транскрипционного репрессора не обязательно связана с его способностью активировать PARP-1.

Роль PARP-1 и поли-АДФ-рибозилирования в подавлении рекомбинации между повторами не согласуется с данными о том, что у мышей, нокаутных по гену PARP-1, нет резкого возрастания числа хромосомных аберраций, хотя частота сестринских обменов хроматид (СХО, SCE) несколько повышена. Не исключено, что другие ферменты поли-АДФ-рибозилирования дублируют важные антирекомбинационные функции. Подробнее о роли PARP-1 в процессах репарации мы поговорим ниже.

Третья гипотеза, объясняющая подавление гомологической рекомбинации между повторами, предполагает создание в области повторов особой локальной структуры хроматина, обеспечивающей надежную изоляцию концов ДНК при образовании двойных разрывов. Кепирование теломер может служить хорошо изученным примером такой изоляции. У позвоночных животных теломеры состоят из тандемных повторов (TTAGGG)n, длина которых на каждой теломере может достигать 30 тысяч пар нуклеотидов. Кепирование теломер осуществляется сложными белковыми комплексами, состоящими из белков, препятствующих слиянию теломер за счет HR и контролирующих теломеразу – (TTAGGG)n-синтезирующий фермент. Главными белками этих теломерных комплексов у млекопитающих являются белки TRF1 и TRF2 (telomere repeat binding factor 1 и 2). TRF1 и TRF2 специфически распознают повторы (TTAGGG)n и связываются с ними благодаря присутствию в этих белках особого Муb-подобного ДНК-связывающего домена. Основную двунитевую часть теломер покрывает белок TRF1, который является негативным регулятором их длины. Самый дистальный короткий (150 нуклеотидов) однотяжевый участок теломерной ДНК (overhang) сворачивается благодаря белку TRF2 в теломерную петлю и оказывается спрятанным внутри теломерного комплекса. Поэтому этот однонитевой конец не может «атаковать» гомологичные мишени на других хромосомах. Таким образом, TRF2 нужен для подавления слияний теломер, так как частота таких слияний повышается при ингибировании его экспрессии.

Было показано, что TRF1 также специфически взаимодействует с одной из субъединиц (р86) белка Ки, и это взаимодействие препятствует латеральному параллельному спариванию двунитевых ДНК, содержащих повторы (TTAGGG)n, обгаруженное в опытах in vitro. Сам по себе гетеродимер Ku не может латерально связываться с двунитевой теломерной ДНК, но очень эффективно распознает любые внутренние DSB и после этого может инициировать процесс NHEJ, подавляя при этом возможность инициации HR. Белок Ки изолирует внутренний двунитевой разрыв от рекомбинационных белков, непосредственно связываясь с его концами. На теломерные повторы антирекомбинационная активность белка Ки направляется распознающим их сиквенсспецифическим белком TRF1.

В подавлении рекомбинации белоком Ки при латеральном связывании с теломерной ДНК, вероятно, принимает участие взаимодействующая с ним ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK).

Схема защиты теломер представлена на рис. 26. Tank1 и 2 – теломерные человеческие полимеразы поли-АДФ-рибозы, Tin2 – TRF1-intracting nuclear protein 2, белки Rap1(repressor-activator protein 1) и Pot1 (protection of telomere 1) защищают однонитевую часть теломеры и препятствуют работе теломеразы.

Рисунк 26. Организация теломеры. Теломерная ДНК, покрытая специфическими белками.

Впрочем, нужно учитывать, что теломеры представляют собой специализированные субхромосомные образования. Вопрос, работает ли сиквенсспецифический механизм зашиты ДНК от рекомбинации по повторам на обычных внутренних (интерстициальных) хромосомных повторах, остается открытым. У многих видов позвоночных, например, у китайского хомячка, в большом количестве выявляются внутренние повторы (TTAGGG)n, образующие большие блоки теломерного «гетерохроматина». Была выявлена ассоциация с этим гетерохроматином белка TRF1. Вероятно, на интерстициальных блоках (TTAGGG)n белок TRF1, взаимодействуя с гетеродимером Ки, способствует подавлению неравной гомологической рекомбинации между этими повторами.

Еще одна гипотеза предполагает не собственно зашиту от рекомбинации по повторам, а как бы «экранирование» этого процесса. Разрешение структуры Холлидея в процессе репарации двунитевых разрывов путем гомологической рекомбинации у млекопитающих обычно происходит без внутреннего разрешения хиазмы, то есть без разрывов, а просто через разворачивание этой структуры геликазами и вытеснение донорной ДНК от места репаративной реакции. Это принципиальное отличие HRR от процесса гомологической рекомбинации в мейозе, когда разрывы и их последующее воссоединение обязательны. Таким образом, рекомбинация по повторам, даже если она и пройдет по повторам в негомологичных хромосомах, будет незаметна, так как не сможет привести к каким-либо хромосомным перестройкам.