Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

15.1. Генеральные концепции и основные игроки

Чекпойнты повреждений ДНК определяются как система взаимодействующих путей, работающих совместно, распознавая повреждения в ДНК и вызывая клеточный ответ. Процесс передачи сигнала и участвующие в нем белки формально разделяются на сенсоры, переносчики и эффекторы, как показано в табл. 7. Сенсоры прямо или опосредованно распознают повреждения ДНК, служат сигналом этих нарушений и инициируют каскад биохимических реакций. Переносчиками обычно являются протеинкиназы, которые изменяют и усиливают сигнал о повреждениях от сенсоров, фосфорелируя другие киназы или нижележащие белки– мишени. Эффекторные белки включают самые последние нижележащие мишени протенкиназ – переносчиков сигнала. Эффекторный уровень чекпойнта повреждений ДНК пересекается с машиной клеточного цикла. В таблице приведены белки, которые сейчас считаются основными сенсорами и переносчиками. Впервые мы употребляли эти термины, описывая процессы репарации двунитевых разрывов ДНК.

До сих пор остается неясным самый первый шаг в распознавании ДНК-повреждений. Первоначально кандидатами на роль первичных сенсоров были признаны два белка, способные непосредственно активироваться при связывании с одно– и двунитевыми разрывами ДНК. Это, соответственно, полимераза поли(АДФ) – рибозы PARP и ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK. Однако вскоре стало ясно, что эти белки не яляются необходимыми для инициации глобального ответа клетки на повреждения, и имеют только локальное значение, хотя DNA-PK, вероятно, каким-то образом способствует восстановлению S-фазы после задержки.

В работах на бактериях, а затем на эукариотических клетках было показано, что однонитевая ДНК способна инициировать сигнал для некоторых путей репарации. Но это не стыкуется с представлением о том, что чекпойнт-сигналы связаны с двунитевыми разрывами ДНК, то есть инициируются двунитевой ДНК и/или связанными с ней изменениями конформации хроматина. Если это так, то те пути репарации, при которых образуются протяженные участки двунитевой ДНК должны генерировать более сильный чекпойнт-ответ, чем те, при которых количество двунитевый ДНК ограничено. То есть, негомологическое воссоединение концов будет давать более слабый сигнал, чем гомологическая рекомбинация, при которой в процесс репарации вовлечены более протяженные участки двунитевой ДНК.

Таблица 7. Белки чекпойнт-ответа клетки на повреждение ДНК.

В настоящее время работы на дрожжевых моделях выявили два белковых комплекса – кандидата на роль сенсоров: Rad17-RFC и 9-1-1, о которых мы говорили, изучая остановку репликации при повреждении ДНК. У этих комплексов есть функциональные гомологи в системе репликации ДНК и их функции частично подобны таковым при чекпойнт-ответе. Rad17-RFC комплекс состоит из Rad17и четырех небольших субъединиц репликативного комплекса RFC (RFC2, RFC3, RFC4, RFC5), состоящего из 5 субъединиц. RFC распознает и связывается с узлом однонитевой /двунитевой ДНК и способствует «загрузке» на ДНК гомотримерного белка, обладающего «зажим»-подобной структурой, необходимого для усиления процессивности ДНК-полимераз δ и ε. Это подтверждает точку зрения, что Rad17-RFC комплекс служит «загрузчиком» комплекса 9-1-1 на поврежденную ДНК. 9-1-1 комплекс состоит из субъединиц RAD9, HUS1 и RAD1, которые взаимодействуют между собой и образуют PCNA-подобную структуру, которая «загружается» на ДНК как скользящий зажим, так же как и PCNA. Есть предположение, что 9-1-1 комплекс также увеличивает количество вовлеченной в реакцию двунитевой ДНК для того, чтобы усилить чекпойнт-ответ. К сожалению, до сих пор остается неясным, как именно RAD17-RFC и 9-1-1 комплексы вовлечены в процесс инициации сигнала на двунитевых разрывах и вообще функционируют во время хорошо известных путей репарации двунивых разрывов ДНК.

Другие белки, такие как комплекс Mre11-RAD50-NBS1 и BRCA1 участвуют в распознавании именно двунитевых разрывов ДНК. BRCA1, вероятно, является адаптором, предоставляющим дополнительные мишени для фосфорелирования киназам-переносчикам сигнала, он взаимодействует с большим числом белков, вовлеченных в процессы репарации ДНК, и собирает белковый комплекс, вероятно, участвующий в инициации и передаче сигнала (BASC – BRCA1 associated genom surveillance complex). Каковы основные функции BRCA1 – сенсорные или трансдусерные – до сих пор неясно.

Белки, называемые медиаторами, прототипом которых является дрожжевой RAD9, участвуют в передаче сигнала. Они содержат два повторяющихся домена, обнаруженных в С-конце белка BRCA1 и названных поэтому BRCТ-доменами. BRCТ-содержащие белки найдены у млекопитающих, но имеют функции, сходные с таковыми дрожжевого RAD9. Среди подобных белков описаны BRCA1, TopBP1 (topoisomerase II binding protein I), 53BP1 (P53 binding protein I) и MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein I). Все эти белки вовлечены в чекпойнт-ответ, они распознают повреждения ДНК и привлекают другие белки, которые облегчают передачу сигнала вниз и репарацию ДНК.

Две активно изучаемые киназы из семейсва PI3-киназ (фосфоинозитол-3-киназы) ATM и ATR работают непосредственно сразу же после сенсоров повреждений. АТМ играет решающую роль в чекпойнтах повреждений ДНК, контролируя начальное фосфорилирование многих ключевых белков общего ответа, например таких, как Р53, MDM2, BRCA1, CHK2, MDC1 и NSB1. При отсутствии АТМ ее функции частично берет на себя ATR, сходная с ней по структуре и хуже изученная, так как нокаутные по этому гену мыши гибнут в эмбриогенезе, а клетки в культуре нежизнеспособны. Ассоциированный с ATR человеческий синдром (синдром Секеля) выявлен всего два года назад.

Не ясно до конца, каким именно образом ATR и ATM активируются сами (взаимное фосфорилирование АТМ в гомодимере) в ответ на различные воздействия, и как они помогают другим белкам связываться с ДНК (по принципу Ku и DNA-PK). Недавно показано, что ATR образует гетеродимер со специфическим белком ATRIP (ATR interacting protein I), что важно для чекпойнт-сигнала, хотя механизм этой важности остается неизвестным. Может быть подобный партнер существует и у АТМ.

Современные данные утверждают, что именно АТМ определяет ранний чекпойнт-ответ, а ATR действует позднее, когда уже идет репарация ДНК повреждений, как вызванных радиацией, так и ультрафиолетом или остановкой репликативных вилок.

Следующим шагом в генерации чекпойнт-ответа является активация СНК1 и СНК2 киназ (checkpint kinase 1 and 2). Эти структурно неродственные киназы имеют частично перекрывающуюся специфичность, то есть часто фосфорилируют одни и те же белки. СНК2 фосфорилируется АТМ, что приводит к ее активации. СНК1 фосфорилируется по серину-345 ATR в ответ на действие ультрафиолета или гидроксимочевины. Таким образом в процессе формирования чекпойт-ответа АТМ функционально связана с СНК2, а ATR – с СНК1.

15.2. Молекулярные механизмы G1-чекпойнта

Движение по клеточному циклу вызывается активацией двух ключевых регуляторных киназ – CDK4 и CDK2, ассоциированных с циклинами D и Е. Фосфорелирование этими киназами белков-мишеней приводит к переходу клетки в фазу S, что требует одновременной инактивации ингибиторов, таких как RB (ретинобластома) и активации киназ-промоторов S-фазы, таких как CDC45. Онкоген myc может служить в этой системе транскрипционным фактором, и одновременно с RB, повышать количество и активность комплекса циклин Е-CDK2 киназы, который приводит к инициации репликации путем конечной активации CDC45-киназы. Именно комплекс циклин Е-CDK2 киназа является мишенью двух ветвей процесса, индуцированного повреждениями ДНК и приводящего к задержке клеточного цикла в фазе G1.

Все это подробно показано на рис. 41. G1-чекпойнт при повреждении ДНК имеет две различающиеся по своей кинетике ветви. Причем обе фазы реакции используют ATM/ATR и CHK1/CHK2 киназы.

Первая, острая фаза реакции направлена на то, чтобы заблокировать циклин Е– CDK2-киназу в неактивном состоянии, что достигается ингибированием или протеосомной деградацией фосфатазы CDC25. Затем следует более длительный и глубокий G1-арест, также связанный с инактивацией комплекса циклин Е– CDK2 киназа, что достигается благодаря стабилизации белка Р53 и его последующей – относительно более медленной – работе как транскрипционного фактора, активирующего синтез соответсивующих белков, в первую очередь – Р21. Вероятно, именно и только Р21 является мишенью Р53, важной для G1-чекпойнта при повреждении ДНК. Одновременно различными путями разрушается комплекс между Р53 и его ингибитором MDM2, что также усиливает эту реакцию. Последующая активация транскрипции MDM2, опосредованная тем же Р53, является дополнительным путем регуляции активности Р53.

Хотя бытует представление, что чекпойнты после повреждения ДНК нужны для репарации, но нет никаких данных, что G1-чекпойнт как-либо способствует репарации двунитевых разрывов. Вероятнее всего, роль G1-чекпойнта в поддержании клеточной стабильности в том, что путем Р53-опосредованного апоптоза элиминируются клетки, содержащие ДНК-повреждения.

Рисунк 41. Схема G1-чекпоцнта, возникающего в ответ на повреждение ДНК.

15.2. Молекулярные механизмы S-чекпойнта

В отличие от G1 или G2-чекпойнтов, задержка в S-фазе относительно короткая и может затрагивать только часть генома. Длительность G1 или G2-чекпойнтов связана с процессами репарации ДНК и апоптоза. Отсутствие задержки в S-фазе обычно называется радиорезистентным синтезом ДНК (характерным, напрмер, для АТ-клеток).

В отличие от G1-чекпойнта, в S-чекпойнте не участвуют гены Р53 и Р21. То есть активация и стабилизация Р53 в S-фазе не приводит к изменению его активности как транскрипционного фактора, а может быть связана только с его ролью в процессах репликации ДНК и репарации, спаренной с транскрипцией. Деградация CDC25, приводящая к тому, что комплекс циклин Е– CDK2 киназа остается в неактивной форме и не может вызвать дальнейшее продвижение по клеточному циклу, происходит примерно так же, как и при G1-чекпойнте. ATM-CHK2-CDC25-CDC45 образуют систему быстрого ответа для подавления различных связанных с клеточным циклом процессов, включая репликацию ДНК. АТМ– зависимый ответ достигает максимума через полчаса после воздействия, а ATR-CHK1-CDC25 ветвь ингибирования достигает максимума через 2–4 часа, хотя мишенью является тот же самый серин-123 фосфатазы CDC25А.

Все это подробно показано на рис. 42.

Дополнительными мишенями АТМ являются BRCA1, MRE11-NBS1-RAD50-комплекс, а также недавно описанный новый белок MDC1, содержащий BRCT-повтор. Представляется, что эти белки каким-то недостаточно ясным образом вызывают промежуточные задержки S-фазы. MDC1, например, может быть медиатором тонких реакций, присходящих вокруг гистона H2AX, и привлекать другие белки к месту ДНК-повреждения. Есть также данные о прямом взаимодействии белка MDC1 с CHK2.

В некоторых работах показана такая же связь СНК2 с белками BRCA1 и NBS1. Вероятно, эти белки, как и MRE11, играют какую-то роль в восстановлении репликации ДНК при данном чекпойнте.

Рисунок 42. Схема S-чекпойнта, возникающего в ответ на повреждения ДНК.

15.3. Молекулярные механизмы G2-чекпойнта

Временная остановка клеточного цикла в ответ на облучение является одним из первых описанных эффектов радиации. G2-арест в этом контексте рассматривался, как пассивный пороцесс – следствие наличия поврежденной ДНК. Сейчас мы приходим к представлению, что G2-чекпойнт является наиболее активным ответом клетки, играющим серьезную роль в репарации ДНК. Ключевым эффектором этого процесса является необходимая для перехода клетки в митоз CDC2 (CDK1) киназа, активирующаяся при ее ассоциации с циклином B. Это отличие данного чекпойнта от G1 и S-чекпойнтов и утверждение его центральной роли в регуляции клеточного цикла.

Все это подробно показано на рис. 43. G2-арест требует изменения множества регуляторных процессов, вовлеченных в нормальный переход клетки из G2 в М: блокирование киназных функций самой CDC2, отсутствие или перемещение циклина В, а также изменение активности других белков, влияющих на регуляторный комплекс CDC2-циклин В. Основным событием, контролирующим вхождение в митоз, является снятие ингибирующего фосфорилирования с CDC2 по тирозину в 15 положении и триптофану в 14, для чего необходима активная фосфатаза. Таким образом, G2-арест ингибирует это дефосфорилирование, то есть ключевым его событием является регуляция активности фосфатазы CDC25C. Так, активация АТМ приводит к активации СНК2 через фосфорилирование триптофана в 68 положении. Активная CHK2 в свою очередь фосфорилирует CDC25C по серину в 215 положении, что приводит к блокированию ее функций. Фосфорилированная форма фосфатазы CDC25C связывается с белком 14-3-3σ, что поддерживает ее каталитическую неактивность и способствует переходу в цитоплазму и секвестрированию. Вторая ветвь G2-чекпойнта опосредуется через ATR/CHK1 активацию. При этом пути одновременно фосфорилируется-выключается белок CDC25А, а также фосфорилируется серин-549 белка Wee1, что облегчает его связывание тем же белком 14-3-3σ и приводит к усилению ингибиторной активности киназ по отношению к CDC2. Это придает второй ветви большую гибкость в контроле и консолидации G2-ареста.

Сами пореждения ДНК тоже могут регулировать активность CDC2 через циклин В. В некоторых клеточных линиях после облучения резко падает уровень мРНК циклина В, возможно из-за ее повышенной нестабильности, причем этот эффект определяет протяженность G2-ареста.

Также нужно иметь ввиду, что циклин В во время G1 и S фаз имеет цитоплазматическую локализацию и перемещается в ядро только к началу митоза. Также есть данные, что белок 14-3-3σ приводит к секвевтрированию циклина В в цитоплазме в ответ на повреждение ДНК.

Рисунок 43. Схема G2-чекпойнта, возникающего в ответ на повреждение ДНК.

Недавно были описаны еще два белка – регулятора CDC25C, принимающих участие в G2-чекпойнте, названные PLK1 и PLK3 (Polo-like kinase). Белки этого семейства принимают активное участие в митозе, включая вход и выход из него. У них всех есть крайне консервативный карбоксильный домен, имеющий два блока очень высокой гомологии, названные поло-боксами. PLK1 является позитивным регулятором CDC25C-активности в необлученных клетках и, специфически фосфорелируя ее, способствует вхождению в митоз. PLK3, напротив, активируется АТМ в ответ на повреждение ДНК, взаимодействует с CDC25C, фосфорелируя ее по серину-216, что приводит к ингибировангию ее активности Еще одной возможностью остановить вход в митоз при наличии повреждений в ДНК является взаимодействие белка PCNA c Р21, CDC25C и комплексом CDC2-циклин В, но не одновременное, а последовательное. Показано, что связывание Р21 и CDC25C с комплексом PCNA-CDC2-циклин В является совершенно особым и не позволяет CDC25C дефосфорелировать CDC2 для активации митоза. В дополнение к этому, Р21 может блокировать особую киназу САК (CDКs activating kinase), которая активирует CDC2 путем фосфорелирования триптофана в 161 положении. Участие Р21 в G2-ответе указывает на то, что в нем участвует и Р53. Роль Р53 в поддержании G2-ареста состоит в том, что он активирует транскрипцию трех вовлеченных в него белков: GADD45. P21 и 14-3-3σ и подавляет транскрипцию CDC2 и циклина В.

И, наконец, есть данные о вовлеченности в G2-арест BRCA1, опосредованно через ATM/ATR или напрямую, через активацию CHK1, но механизм этого остается неясным.

Таким образом, к настоящему времени стало ясно, что G2-реакция клетки на облучение зависит от фазы цикла, в которую это произошло. Одновременно становится понятным, что G2 чекпойнт-ответ разделяется на два молекулярно различных пути. Один начинается сразу же после облучения, захватывает клетки, облученные непосредственно в G2-фазе и является АТМ-зависимым, проходящим и независимым от дозы. Он приводит к резкому снижению митотического индекса. Второй, который развивается позже, в клетках, облученных на более ранних стадиях клеточного цикла, является АТМ-независимым, зато зависимым от дозы и приводит к накоплению клеток в фазе G2.

15.4. Чекпойнты, вызванные повреждениями ДНК и репарация двунитевых разрывов

Широко распространенное мнение о том, что чекпойнты способствуют репарации ДНК кажется очевидным, но это никогда не было строго доказано. Представляется ясным, что чекпойнт – это не только «период ожидания» внутри клеточного цикла. Для того, чтобы оценить репарацию потенциально летальных повреждений, были использованы различные экспериментальные подходы, затрагивающие время задержек в клеточном цикле. Рассматривая чекпойнты, вызванные повреждением ДНК, и процессы репарации ДНК, можно попытаться объединить их с основными событиями нормального клеточного цикла. Дискуссия обычно ведется вокруг двунитевых разрывов ДНК и их репарации, но может быть распространена и на другие типы ДНК-повреждений. То есть, регулируемые переходы из фазы в фазу клеточного цикла, связанные с чекпойнтами, должны приводить ДНК в состояние, удобное для репарации двунитевых разрывов. Двунитевые разрывы ДНК могут индуцироваться во всех фазах клеточного цикла, но их репарация оптимально происходит только в некоторых, так как на них могут накладываться изменения хроматина, связанные с прохождением клеточного цикла. Таким образом чекпойнт-ответ может быть полезен в нескольких направлениях: (1) оставить время для репарации в тех фазах клеточного цикла, в которых двунитевые разрывы ДНК образовались; (2) позволить частичный процессинг повреждений и допустить переход в следующую фазу, в которой эти повреждения ДНК будут оптимально репарированы; (3) препятствовать угрожающему изменению конформации хроматина, которое может усложнить правильную репарацию.

Нужно напомнить, что репарация двунитевых разрывов в основном (1:1500) происходит путем негомологического воссоединения концов, и лишь небольшая часть DSBs удаляется из генома крайне важным для понимания радиочувствительности клеток методом гомологической рекомбинации. Негомологическое воссоединение концов – процесс быстрый, 75 % разрывов зашиваются в течение первых 20 минут, к тому же этот процесс активен во всех фазах клеточного цикла, включая S-фазу. Неприятно, но очевидно, что этот процесс нельзя рассматривать как зависимый от чекпойнт-ответа на повреждения, так как сам чекпойнт-ответ достигает максимума только через 1–2 часа. Итак, репарация двунитевых разрывов путем негомологического воссоединения концов является чекпойнт-независимым процессом.

С другой стороны, накоплено много данных, подтверждающих зависимость от чекпойнт-ответа репарации путем гомологической рекомбинации. В ней участвуют многие белки, вовлеченные в чекпойнт-ответ, к тому же медленное протекание этого процесса соответствует времени чекпойнт-ответа.

В настоящее время предложена модель-идея, что негомологическое воссоединение концов – это только первый шаг процесса репарации двунитевых разрывов, цель которого просто сохранить целостность генома, несмотря на низкую точность. За ним следует процесс гомологической рекомбинации, цель которого восстановить, так как это принципиально важно, точную последовательность нуклеотидов вокруг разрыва. Эта вторая фаза репарации таким же образом может восстанавливать точность всех репарационных процессов. По этой (весьма спекулятивной) теории, репарация двунитевых разрывов ДНК – процесс многоступенчатый, начинающийся с синапсиса концов и завершающийся восстановлением точной последовательности ДНК. Быстрый начальный шаг NHEJ крайне чувствителен к изменениям конформации хроматина, которые происходят при вхождении клетки в S-фазу и в митоз, и могут приводить к разделению концов, усложняя их правильное воссоединение. Последующие шаги чекпойнт-ответа, кажется, более тесно связаны с дальнейшими ступенями репарации и могут приводить ДНК в состояние, при котором репарация путем гомологической рекомбинации будет идти более эффективно. В тоже время они могут блокировать биохимические процессы, связанные с репликацией ДНК и делением.

Заключение

В течение всего курса изучения репараци ДНК главной задачей представлялось создание общей картины взаимодействия большого числа (больше 150) генов и кодируемых ими белков в процессах поддержания стабильности передающейся по наследству информации и предотвращения появления мутаций. Новая парадигма – представление о динамических изменениях молекулы ДНК при ее повреждении и репарации позволяет глубже понять происхождение и эволюцию живых организмов, их способность приспосабливаться к изменениям окружающей среды.

Детальное знание процессов репарации ДНК, а также кинетики и молекулярных основ чекпойнт-ответа клетки на повреждения ДНК, могут быть продуктивно применены как в различных областях теоретической биологии, так и в прикладных исследованиях, например, при выработке стратегии сочетанной терапии опухолей, включая различные способы подавления чекпойнт-ответа после радиотерапии.

В завершение приведем сводную таблицу генов, вовлеченных в процессы репарации, мутации в которых могут приводить к тяжелым наследственным заболеваниям человека