Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

Мы уже несколько раз упоминали это заболевание раньше. Было показано, что по многим признакам CS можно рассматривать как один из большой группы так называемых транскрипционных синдромов, особенно когда речь шла о больных, генетически связанных с ХР. В тоже время синдром Коккейна во многих случаях не имеет никакой связи с ХР, и будет нами здесь представлен как независимое заболевание. Этот редкий синдром был описан в середине тридцатых годов Коккейном. Считается аутосомным рецессивным генетическим заболеванием, описан в семьях, часто проявляется в результате родственных браков.

Больные страдают карликовостью в результате задержки роста и развития с самого раннего возраста. Среди наиболее часто встречающихся признаков – фоточувствительность, глухота, атрофия зрительного нерва, удлиненные по отношению к туловищу конечности, большие уши и нос, глубоко запавшие глаза и ускоренное старение. Пациенты умирают в возрасте около 12 лет. В тех редких случаях, когда они доживают до 18–20 лет, у них в отличие от ХР нет выраженной предрасположенности к опухолям (как и у TTD). Необычная чувствительность этих больных к солнечному свету позволила сделать предположение о наличии дефекта в репарации УФ-повреждений ДНК. Фибробласты больных CS показывают резко пониженную выживаемость после УФ-облучения по сравнению с клетками здоровых доноров. Эта чувствительноть к ультрафиолету коррелирует с повышенной чувствительностью к химическим агентам, считающимся УФ-миметиками. Например, к N-ацетокси-N-2-ацетил-2-аминофлюорену или 4-нитрохинолину. Некоторыми авторами описана также и чувствительность к гамма-облучению. При этом обычно клетки больных синдромом Коккейна не чувствительны к гамма-миметикам (алкилирующим агентам в том числе).

При облучении клеток нормальных доноров ультрафиолетом мы наблюдаем немедленное подавление валового синтеза ДНК в степени, зависимой от дозы, а затем полное восстановление исходного уровня в течение 5–8 часов. В клетках больных синдромом Коккейна, как и больных пигментной ксеродермой, наблюдается явный дефект этого восстановления. В растущих клетках CS также наблюдается подавление синтеза РНК УФ-облучением, но восстановление идет несколько быстрее, чем в случае ДНК синтеза. Этот феномен дефектного восстановления синтеза РНК после УФ-облучения обычно используется как диагностический критерий для дискриминации синдрома Коккейна. Этот дефект коррелирует с наличием карликовости, умственной осталости и чувствительности к солнечному свету.

Больные синдромом Коккейна, как и пигментной ксеродермой, относятся к нескольким различным группам комплементации, основными среди которых являются две – А и В. При этом надо отметить, что те редкие случаи, когда мы наблюдаем признаки синдрома Коккейна у больных пигментной ксеродермой групп B, D и G, не относятся к этим двум группам комплементации, а рассматриваются отдельно и обозначаются как XPB/CS; XPD/CS и XPG/CS. Таким образом, к настоящему времени у синдрома Коккейна описано 5 различных групп комплементации.

Ген CSA клонирован и кодирует белок, относящийся к древней группе белков, часто называющихся семейством с WD-повторами, WD-40-повторами или GH-WD-повторами. Белки этого семейства не обладают какими-либо каталитическими свойствами, но способны служить передатчиками сигналов внутри клетки. Мне бы хотелось остановиться на них немного подробнее. Эти белки получили свое название из-за того, что внутри каждого белка имеется от 4 до 8 высококонсервативных аминокислотных последовательностей, содержащих от 23 до 41 аминокислот и фланкированных с одной стороны GH (Gly-His), а с другой – WD (Trp-Asp). Таких белков обнаружено 27 (CSA – 28-ой), причем функция 20 из них уже ясна, хотя бы приблизительно. Впервые WD-повтор был обнаружен в β-субъединице GTP-белка, или, как их теперь обычно называют, G-белка, который передает сигнал через плазматическую мембрану; и был назван β-трансдуцин-повтором. Этот белок усиливает связывание α-субъединицы G-белка с рецепторами гормонов и другими внутриклеточными сигнальными молекулами, способствуя объединению в тройной комплекс рецептора и G-α-β-γ. Эта способность G-β облегчать объединение различных белков и образование мультибелковых комплексов может служить ключом к пониманию функций и других белков, содержащих WD-повторы. Например, особая роль в объединении макромолекул во время сплайсинга мРНК (белок Prp4), модификации мРНК (белок CstF), транскрипции (TafII80; TUPI). Аналоги G-β субъединицы были описаны и у других организмов, включая дрожжи и диактиостилиум, и показали очень высокую степень консерватизма между последовательностями повторов, находящихся в одинаковом положении внутри белка (у G-β-белка этих повторов 5 и они обозначаются повтор 1 G, повтор 2 G и т. п.). Таким образом, мы видим, что эти белки сохраняют свои последовательности не менее 1 миллиона 200 тысяч лет, которые отделяют эволюционно человека от диктиостилиума и дрожжей. Подобная же картина наблюдается и в других группах WD-белков.

Таким образом, все описаные до сих пор группы белков с WD-повторами показывают крайне высокую степень эволюционного консерватизма, сравнимую только с таковой у гистонов (взаимодействующих с широким кругом различных белковых и ДНК-овых последовательностей) и кальмодулинов (взаимодействующих с большим числом несвязанных энзимов, регулирующих обмен ионов Са++). Из этого можно сделать вывод, что и у белков, содержащих WD-повторы, их функции были определены по меньшей мере более 1.200 миллиона лет назад. Способность же этих белков к многомерному связыванию с другими белками указывает на их значение в физиологическом объединении различных клеточных процессов.

Белок CSA содержит 396 аминокислот и имеет молекулярную массу приблизительно 44 кД. Ген, кодирующий этот белок, был картирован на 5 хромосоме – 5р14-р12. Этот белок образует комплекс с белком CSB и белком р44, входящим в состав того же самого транскрипционного комплекса TFIIH, что и белки XPB и XPD. Отвечает за это связывание N-конец белка, так как даже обрезанный CSA белок, содержащий только N-конец с 146 или 187 аминокислотными остатками был способен взаимодействовать и с CSB и с р44.

Ген, кодирующий белок CSB, был определен несколько раньше также с помощью функциональной комплементации чувствительности к ультрафиолету клеток одного из штаммов грызунов, дефектного по гену ERCC6. Он оказался способным исправлять клеточный фенотип клеток от больных CSB. Таким образом была доказана идентичность двух генов – CSB и ERCC6. У человека этот ген картирован на 10q11.2 и кодирует полипептид, содержащий 1493 аминокислоты с молекулярной массой около 169 кДа. Этот белок имеет несколько специфических областей. Например, последовательность между 356–394 аминокислотными остатками содержит 60 % глутамина и аспаргина, включая 10 кислых остатков подряд. Подобные кислые районы были обнаружены во многих ядерных белках, связывающихся с хроматином или с гистонами. Наиболее интересной чертой этого полипептида является участок, содержащий около 400 аминокислот (527–950), в его середине. Этот участок охватывает согласованную группу нуклеотидов, высококонсервативную и характерную для обширного семейства белков, обозначаемых как SWI/SNF семейство. На сегодняшний день известно 29 членов этого семейства. Внутри каждого белка этого семейства тот самый участок приблизительно в 400 аминокислот состоит из очень консервативных коротких последовательностей аминокислот, прерываемых более протяженными менее консервативными последовательностями, которые варьируют по размерам у разных членов семейства. Вначале таким образом были описаны два суперсемейства ДНК и РНК геликаз. При более подробном исследовании этой гомологии, было выдвинуто предположение о существовании по крайней мере 8 подсемейств, одно из которых включает человеческий полипептид CSB и его дрожжевой гомолог Rad26. Другое подсемейство включает дрожжевой полипептид Swi2/Snf2, который является ДНК-зависимой АТФ-азой, входящий в состоящий из по крайней мере 11 субъединиц мультибелковый комплекс, вовлеченный в активацию транскрипци у дрожжей (SWI/SNF комплекс), и его гомологи у человека и дрозофилы. Третье подсемейство включает белок дрозофилы ISWI, который тоже является частью мультибелкового комплекса, называемого NUFR, принимающего участие в транскрипции. АТФ-азная активность комплекса предположительно связана с ISWI белком. Предполагают, что оба эти комплекса могут быть "молекулярными машинами", вызывающими активацию транскрипции с помощью механизмов, вовлеченных в ремоделирование хроматина. Вероятно, в суперсемействе SWI/SNF содержатся АТФ-азные субъединицы различных хроматин-ремодулирующих комплексов (каждому соответствует свое подсемейство SWI/SNF белков), основной функцией которых является нарушение структуры хроматина для различных операций с ДНК, не обязательно именно для транскрипции. Участие подобного хроматин-ремодулирующего комплекса в репарации ДНК выглядит вполне естественным. В белке CSB присутствует также и геликазный мотив, но данные о его геликазной активности пока экспериментально не подтверждены. CSB белок также имеет общие последовательности с фактором, связывающим транскрипцию и репарацию E.coli (TRCF). К настоящему времени сложилось представление, что CSB белок является функциональным гомологом TRCF и что он (по-видимому, вместе с белком CSA) играет особую роль в привлечении белков эксцизионной репарации в район остановившейся транскрипции и/или их взаимодействии с РНК-полимеразным комплексом. Об этом мы подробнее будем говорить при обсуждении пострепликативной репарации.

Существует много наблюдений, подтверждающих представление о сопряженном дефекте репарации и транскрипции при синдроме Коккейна. Во всех случаях, когда это заболевание диагностировалось, на клеточном и молекулярном уровне наблюдались мутации в генах, кодирующих белки либо прямо входящие в состав транскрипционного комплекса TFIIH, либо взаимодействующие с ним. К тому же все тяжелые симптомы этого заболевания невозможно объяснить только с точки зрения репарации ДНК, тогда как их реальной причиной могут быть сниженный уровень и нарушение последовательности транскрипции в онтогенезе.

К настоящему времени известны так же многочисленные, связанные с TCR, синдромы повышенной чувствительности к УФ-облучению (UVS-S), но неясно, какие именно гены и белки отвечают за них. Пациенты с синдромами чувствительности к УФ-излучению (UVS-S) являются чувствительными к солнечному свету, но не имеют никаких неврологических дефектов или дефектов развития. Сравнительные исследования показали, что UVS-S отличаются от пигментной ксеродермы (ХР) и синдрома Коккейна (CS) и не комплементируются с ними. Клетки UVS-S имеют некоторые характеристики, совпадающие с CS, включая нормальную GGR репарацию УФ-фотопродуктов, низкую выживаемость клонов и дефектное восстановление синтеза РНК после УФ-облучения. Эти наблюдения позволили утверждать, что клетки UVS-S, как и клетки больных CS, являются дефектными по системе репарации циклобутановых димеров, спаренной с транскрипцией (TCR). В результате сравнения репарации разных генов в клетках здоровых доноров, CSB и UVS-S, было показано, что гены UVS-S необходимы для TCR пиримидиновых димеров и, вероятно, других массивных ДНК-повреждений. Возможным различием между CSB и UVS-S пациентами является то, что гены, ответственные за возникновение UVS-S не необходимы для TCR повреждений, возникших в результате окисления активными формами кислорода. К тому же обнаружено, что репарация пиримидиновых димеров в обеих нитях была медленнее у пациентов с дефектом системы TCR, чем в нетранскрибируемой нити здоровых доноров. Из-за отсутствия системы TCR комплексы глобальной репарации задерживаются повреждениями в геномных областях вокруг отдельных единиц транскрипции. Это показывает, что наши представления о тонких механизмах TCR пока далеко не полны и этот процесс сложнее, чем нам представлялось ранее.

6. Репарация, связанная с рекомбинацией

В некоторые репарационные процессы кроме репликации – синтеза новой ДНК на месте вырезанного поврежденного участка – вовлечена и рекомбинация. Прежде чем перейти к подробному описанию этих репарационных процессов, остановимся вкратце на самом втором Р ДНК-метаболизма – рекомбинации.

7. Рекомбинация

Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации элементов – носителей генетической информации. Чаще всего мы говорим о рекомбинации при описании процесса кроссинговера, во время которого рекомбинация между гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза.

Рекомбинация может происходить и в соматических клетках, где она проявляется обычно в виде обменов сестринских хроматид, которые не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Это связано с тем, что рекомбинация происходит между взаимно соответствующими парами оснований, так что ни один нуклеотид не добавляется и не удаляется из рекомбинантных хромосом. Также рекомбинация бывает часто вовлечена и в процессы репарации.

Существуют три типа рекомбинации: 1) общая, или гомологическая, 2) сайт-специфическая, 3) случайная, или негомологичная.

Рекомбинация, включающая обмены между гомологичными последовательностями ДНК, называется общей или гомологической рекомбинацией, и именно она будет главным предметом нашего интереса, так как именно гомологическая рекомбинация ДНК вовлечена в различные репаративные процессы. Подробное ее описание будет дано ниже, а пока остановимся кратко на двух других типах рекомбинации, происходящей под контролем ферментов, опознающих специфические последовательности нуклеотидов, присутствующие на одной или двух рекомбинирующих молекулах. С помощью этого типа рекомбинации бактериальные вирусы и мобильные элементы перемещаются по геному.

7.1. Сайт-специфическая рекомбинация

Этот тип рекомбинации связан с обменом между специфическими последовательностями и характерен для прокариот и дрожжей. Сайт-специфическая рекомбинация обычно происходит при интеграции фаговых геномов в бактериальную хромосому. В результате рекомбинации обмениваются специфические последовательности фаговой и бактериальной ДНК, обнаруживающие короткие – 100–150 нуклеотидных пар – участки гомологии. Ферменты, вовлеченные в это событие, действуют только на особую пару последовательностей-мишеней. Сайт-специфическая рекомбинация была открыта в результате исследований механизма перемещения бактериофага λ по хромосоме E.coli. В интегрированном состоянии вирус внедрен в бактериальную хромосому и реплицируется как часть ДНК клетки-хозяина. Когда вирус проникает в клетку, на матрице вирусного гена синтезируется фермент λ-интеграза. Этот фермент и катализирует сайт-специфическую рекомбинацию. Процесс начинается с того, что молекулы интегразы плотно связываются со специфическими последовательностями на кольцевой хромосоме фага. Затем получившийся ДНК-белковый комплекс связывается со сходными, но не идентичными последовательностями на бактериальной хромосоме, сближая таким образом бактериальную и фаговую хромосомы. Затем интеграза делает надрезы в молекулах ДНК, формируя маленький участок сочленения гетеродуплекса. Интеграза напоминает ДНК-топоизомеразу в том отношении, что она формирует ковалентную связь с ДНК в тех же местах, где и разрывает ДНК. У бактерий топоизомераза I и гираза являются ключевыми ферментами, определяющими степень суперскрученности ДНК при ее ответе на стрессовые внешние воздействия – такие как повышение температуры, изменении рН и оксидативный стресс. Топоизомераза I катализирует две основные реакции – разрезание и воссоединение однонитевой нормально спаренной ДНК для релаксации ее суперскрученности при репликации или транскрипции. Множество эндогенных факторов действуют на эти две реакции разобщающее и приводят к образованию и накоплению ТорI-разрешающего комплекса, который является переходным к образованию двунитевыфх разрывов ДНК со всеми вытекающими последствиями.

Тот же самый механизм сайт-специфической рекомбинации приходит в действие, только в обратном направлении, когда фаг λ вырезается из сайта интеграции.

7.2. Случайная рекомбинация

Рекомбинация между негомологичными последовательностями нуклеотидов происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих – довольно часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных.

Многие мобильные последовательности ДНК, включая вирусы и транспозоны, кодируют интегразы (другое название – транспозазы), которые позволяют их ДНК встраиваться в хромосомы с помощью механизма, отличающегося от сайт-специфической рекомбинации, которую использует бактериофаг λ. Так же, как и λ-интеграза, эти ферменты опознают специфические последовательности ДНК в соответствующем мобильном элементе, встриивание или вырезание которого они катализируют. В отличие от интегразы фага λ, эти интегразы/транспозазы не требуют специфических последовательностей ДНК в хромосоме-мишени и не формируют сочленения гетеродуплекса. Вместо этого они образуют надрезы с обоих концов линейной последовательности мобильного элемента, а затем катализируют взаимодействие этих концов ДНК с ДНК-мишенью, разрывая в ней фосфодиэфирные связи. Так как это разрезание происходит в разных нитях не прямо друг напротив друга, а с «зазором» в несколько нуклеотидов, то в результате в рекомбинантной молекуле ДНК образуются две короткие однонитчатые бреши, по одной на каждом конце мобильного элемента. На завершающем этапе процесса рекомбинации эти бреши застраиваются ДНК-полимеразой. Таким образом в ДНК клетки-хозяина образуются короткие дуплицированные прямые повторы, прилежащее к месту инсерции мобильного элемента. Такие фланкирующие прямые повторы являются отличительной чертой случайной, или транспозиционной рекомбинации. Мы еще вернемся к процессу негомологической рекомбинации при описании негомологического воссоединения двунитевых разрывов ДНК. Там же будет и приведен соответствующий рисунок.

7.3. Гомологичная рекомбинация

Основным способом рекомбинации, безусловно, является гомологическая или общая рекомбинация. Она происходит между двумя дуплексными молекулами ДНК и является необходимым элементом не только процесса мейоза, но и репарации и репликации. Следует подчеркнуть, что ферменты, участвующие в этом процессе, могут использовать в качестве субстрата любую пару гомологичных последовательностей.

Рекомбинация между хромосомами в мейозе подразумевает физический обмен частями, происходящий по принципу «разрыв и воссоединение», в ходе которых две несестринские хроматиды рвутся и затем воссоединяются. Когда хромосомы начинают расходиться, их контакты между собой остаются в виде так называемых хиазм. Традиционно считается, что хиазмы представляют собой отражение существования кроссинговера, хотя формальных доказательств этой связи до сих пор не получено.

У прокариот известны ферменты, вовлеченные в каждый этап рекомбинации, и кодирующие их гены, имеющие название rec (recombination). Мутации этих генов фенотипически проявляются в неспособности к рекомбинации. Идентифицировано около 20 таких генов. У Е. coli описаны два механизма гомологичной рекомбинации. Один – RecA-зависимый, то есть основанный на уникальных свойствах АТР-зависимой синаптазы – белка RecA, другой – recA-независимый, ключевым ферментом которого является АТР-независимая аннилаза – белок RecT. Белок RecT отжигает комплементарные участки ДНК взаимодействующих молекул так, что становится возможной репарация двунитевых разрывов ДНК. Но мы остановимся подробно на RecA-зависимой рекомбинации, так как именно этот тип рекомбинации оказался тем механизмом, эволюция которого привела к появлению особой системы репарации двунитевых разрывов у эукариот. У Е. coli в рекомбинацию, проводимую белком RecA, вовлечено более 20 белков. Рекомбинация инициируется переходом белка RecA в активную форму RecA*, представляющую собой тройной комплекс RecA::ATP::oнДHK, образующийся при полимеризации отдельных молекул RecA на онДНК в присутствии АТР. То есть онДНК выступает в качестве «затравки» процесса. Гомологическая рекомбинация может быть инициирована как двунитевыми разрывами ДНК так и однонитевыми брешами. Существует много доказательств того, что даже единственной бреши только в одной цепи молекулы ДНК достаточно для инициации общей рекомбинации. Химические препараты или облучение, приводящие к образованию однонитевых разрывов, будут стимулировать рекомбинацию. В принципе, инициировать рекомбинацию в клетке может любая онДНК. Однако в нормальной клетке баланс ферментов таков, что образующиеся в ходе репликации однонитевые пробелы (между фрагментами Оказаки) не являются рекомбиногенными.

Рисунок 15. Белок RecA организует трехнитчатую структуру ДНК.

Дальнейшее развитие процесса гомологической рекомбинации у E.coli протекает следующим образом. Нить ДНК, покрытая белком RecA, растягивается, филамент RecA::ATP::oнДHK имеет спиральную структуру и способен втягивать внутрь своей спирали молекулы днДНК партнера с образованием трехнитевои структуры, в которой и разыгрывается основной акт рекомбинации – переключение комплементарного спаривания, приводящее к «переносу» одной из нитей вошедшей ДНК на онДНК, находящуюся внутри филамента. Как видно, небольшой по размеру белок RecA (у бактерий его молекулярная масса составляет 38 кДа) полифункционален: он взаимодействует с АТР, образует филамент на онДНК, взаимодействует с днДНК, осуществляет гомологичный синапс молекул ДНК и перенос нити, как это показано на рис. 15. В ходе взаимодействия с АТР и онДНК белок претерпевает конформационные изменения, а в реакции переноса нити он использует свою ДНК-зависимую АТРазную активность, которая особенно необходима при взаимодействии областей ДНК с несовершенной гомологией.

Рекомбинационный процесс условно может быть разбит на три стадии: предсинаптическую, синаптическую и постсннаптическую. Первая включает подготовку ДНК-субстрата, инициирующего реакцию рекомбинации, то есть онДНК. Рассмотрим реакцию гомологической рекомбинации, инициированную наличием двунитевого разрыва, то есть конца двунитевой ДНК. Как правило, конец днДНК атакует нуклеаза RecBCD, которая за счет своей сильной геликазной активности (скорость расплетания ДНК до 1 т. п. нуклеотидов в секунду, процессивность до 30 т. п.н.) раскручивает ДНК вплоть до специфического рекомбинационного сайта "chi" (crossover hot spot instigation), наxодящегося в строго определенной ориентации (5'-GCTGGTGG). При этом фермент RecBCD действует как частощепящая с З'-конца и как редкощепящая с 5'-конца экзонуклеаза. Связываясь с участком chi, нуклеаза RecBCD модифицирует субъединицу RecD, теряя при этом 3'– и, наоборот, активируя 5'-экзонуклеазную активность, под действием которой и образуется онДНК с З'-концом. Эта онДНК покрывается белком RecA, что создает рекомбинационно активный филамент RecA::ATP::oнДHK с атакующим З'-концом, как это показано на рис 16 (Ланцов, 2001). RecBCD обладает несколькими важными для рекомбинации активностями, которые, однако, проявляются лишь при взаимодействии с участком chi, что превращает "ДНК-деградазу" RecBCD в "рекомбиназу". В случае инактивации этого фермента его заменяют 5'-3'-экзонуклеазы RecE или RecJ, которые совместно с геликазой RecQ способны создавать онДНК с З'-концом.

Однонитевые участки ДНК, покрытые белком SSB, могут стать субстратом рекомбинационной реакции только при условии, что белок SSB будет вытеснен белком RecA. Однако такого рода события являются, скорее, исключением, так как сродство к онДНК у белка SSB выше, чем у RecA. Предполагается, что в клетке белок RecA пассивен и "складирован" в пачки, образуемые путем бокового взаимодействия его филаментов, и что он "рекрутируется" при рекомбинационной репарации путем взаимодействия с молекулой АТР и последующей полимеризации на онДНК для создания тройного активного комплекса RecA::ATP::oнДHK. Вероятно, белок RecВ способен заранее привлекать белок RecA к месту возможного образования свободного 3’-конца и способствовать его преимущественной загрузке на однонитевую ДНК до того, как с ней успеет связаться белок SSB. В случае, когда этого не происходит, для связывания с онДНК белок RecA использует специализированные комплексы белков модуляторов RecF, RecO и RecR. Только так RecA может вытеснить уже связанный с однонитевой ДНК белок SSB и полимеризоваться на онДНК. В норме у клеток дикого типа в ходе репликации такие замещения репликационного белка SSB рекомбинационным RecA возможны лишь в редких случаях; при этом модуляторный комплекс RecOR, обладая сродством к онДНК, помогает связыванию RecA с этой ДНК, а другой комплекс RecFR со сродством к днДНК ограничивает полимеризацию белка RecA участком онДНК.

Рисунок 16. Взаимодействиебелка RecA с белками RecBCD

В белке RecA имеется несколько сайтов связывания с ДНК, поэтому он может удерживать одинонитевую и двунитевую цепи ДНК вместе. Эти сайты позволяют белку RecA катализировать многоступенчатую реакцию (называемую синапсисом) между двунитевой молекулой ДНК и гомологичными районами однонитевой, как показано на рис. 17 (Ланцов, 2001).

Рисунок 17. Связывание белка RecA с однонитевой и двунитевой ДНК.

Первым шагом в синапсисе является спаривание комплементарных последовательностей нуклеотидов. В результате образуется особая трехнитевая структура ДНК. Затем короткий гетеродуплексный участок, в котором нити из двух различных молекул начали спариваться, увеличивается из-за «миграции ветви» с образованием D-петли (deplacement loop). «Миграция ветви» может происходить в любой точке, где две одиночные цепи ДНК, имеющие одинаковые последовательности, конкурируют за возможность спариваться с одной и той же комплементарной нитью. Неспаренный участок одной из одиночных нитей заменяется спаренным районом другой, двигая точку ветвления. Спонтанное движение ветви равновероятно в любом направлении. Поскольку белок RecA катализирует однонаправленное движение ветви, это создает район гетеродуплекса длиной в несколько тысяч пар оснований. Такое расширение спаренного участка за счет миграции ветви ДНК осуществляется геликазами RuvAB и/или RecG. «Миграция ветви» приводит к вытеснению лишней нити ДНК, которая, в свою очередь, спаривается с комплементарной нитью партнера по рекомбинации, что приводит к образованию структуры Холлидея – четырехнитевой структуры ДНК, у которой две нити одной полярности находятся в перекресте. В этой структуре две гомологичные молекулы ДНК, которые раньше были спарены, теперь удерживаются вместе за счет сформировавшихся обменов между двумя из четырех цепей: по одной из каждой молекулы ДНК. Структура Холлидея имеет две особенности: 1) точка обмена между цепями может быстро мигрировать вперед и назад; 2) она состоит из двух пар цепей – одна пара пересекающихся и одна пара непересекающихся.

Третья стадия – "разрешение структуры Холлидея". Эту стадию осуществляет топоизомеразный комплекс RuvABC. Вначале эндонуклеаза RuvC (субъединица этого топоизомеразного комплекса) вносит координированные разрывы в нити ДНК одной полярности, затем разрывы зашиваются, молекулы ДНК расходятся и процесс перетасовки генетического материала завершен.

Таким схематически представляется процесс RecA-зависимой рекомбинации у бактерий. Подобным же образом его пытаются представить и у S. cercvisiae, отыскивая функциональные аналоги или даже гомологи. Главная роль гомологической рекомбинации у эукариот (кроме мейоза) – это воссоединение двунитевых разрывов ДНК и участие в пострепликативной репарации. Двунитевые разрывы ДНК являются самыми опсными для развития тяжелых генотоксических эффектов – разрывов хромосом, их перестроек и клеточной гибели. У высших эукариот один нерепарированный двунитевой разрыв в важном гене может привести к гибели клетки путем апоптоза.

Рекомбинационную репарацию (это словосочетание является по сути синнимом гомологической рекомбинации у эукариот) этих разрывов контролирует ряд генов, принадлежащих к эпистатической группе RAD52, среди которых особое место принадлежит гену RAD5I, так как его продукт структурно и функционально гомологичен бактериальному белку RecA. Другие гены, принадлежащие к этой группе, также кодируют белки структурно сходные с белком RecA. К их числу относятся гены Dmc1, Rad55 и Rad57 (последний, правда, кодирует белок более сходный с белком Rad51, чем с RecA). Но только Rad51 обладает способностью катализировать АТР-зависимое гомологичное спаривание и обмен нитей ДНК в реакции переноса нити in vitro подобно тому, как это делает RecA. Так же, как RecA требует присутствия в реакции белка SSB, Rad5l требует присутствия его эукариотического аналога – фактора репликации RPA. Вероятно, подобно RecA, RAD51 функционирует в комплексе с другими белками, облегчающими его взаимодействие с однонитевой и двунитевой ДНК. Такой комплекс с Rad51 могут, например, образовывать белки Rad52, Rad54, Rad55 и Rad57. В кроссоверном разрешении холидеевских структур в клетках высших организмов могут принимать участие различные эндонуклеазы, в том числе XPF. При некроссоверном разрешении, при котором также нужны топологические изменения ДНК, их могут проводить RecQ-подобные геликазы вместе с топоизомеразой III. Подробно процесс гомологической рекомбинации у высших эукариот мы рассмотрим при описании процессов репарации двунитевых разрывов.

Белки, подобные Rad5l дрожжей, выявлены у грибов, у растений, птиц и млекопитающих, включая человека. У млекопитающих они найдены в мейотическом хроматине и в составе синаптонемального комплекса.