Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

В начале 80-х годов Филипп Ханавалт сформулировал представление о преимущественой репарации ДНК. Это явление заключается в более быстром удалении цикдобутановых пиримидиновых димеров и некоторых других типов повреждений оснований из транскрипционно активных генов по сравнению с транскрипционно молчащими участками генома. Окончательное понятие (на сегодняшний день) преимущественной репарации таково: во многих, но не во всех, транскрипционно активных генах транскрибируемая (матричная) нить репарируется быстрее, чем нетранскрибируемая (кодирующая) нить (нить-специфическая репарация); и транскрибируемая часть генома репарируется быстрее, чем молчащая. Существование эксцзионной репарации нуклеотидов, спаренной с транскрипцией, как раз и является доказательством этой гипотезы.

У E.coli обнаружен мутант mdf (mutation frequency decline) с нарушением NER. Оказалось, что этот ген кодирует белок, названный TRCF (transcription repair cupling factor), который «убирает» комплекс РНК-полимеразы вместе с транскриптом с ДНК, если тот остановиться перед повреждением, способствуя таким образом репарации данного повреждения. То есть вся система репарации, спаренной с транскрипцией, отличается от описанного нами ранее процесса NER только одним этим фактором.

Такие белки, как фактор связывания транскрипции и репарации (transcription Repair Cupling Factor, TRCF), явно вовлеченные в объединение транскрипции и эксцизионной репарации в то же время не являются белками, абсолютно необходимыми для транскрипции самой по себе.

TCR убирает различные повреждения, останавливающие продвижение РНК-полимеразы на транскрибируемой нити транскрибируемого гена. Дефект этого пути репарации приводит к Синдрому Коккейна (СS), при этом при данном заболевании вообще резко снижен уровень транскрипции и его относят к так называемым «транскрипционным синдромам», а не только к «репарационным синдромам». Именно с этим связано то, что уровень опухолеобразования у больных синдромом Коккейна не повышен, по сравнению с контролем – клеткам просто не хватает транскрипционной активности для поддержания опухолевых, активно пролиферирующих клеток. Хотя есть предположение, связывающее это явление с повышенным уровнем апоптоза. Для TCR основными необходимыми белками являются CSА, CSB, XPB, XPD (члены TFIIH) и XPG. CSB, но не CSA непосредственно связывается с РНК-полимеразой II (хотя не совсем понятно, как именно) и таким образом активирует соответствующую ветвь NER, что приводит к отсоединению остановившегося комплекса RNApolII от поврежденной ДНК. TCR и GGR могут быть объединены белком CSB, вероятно, он работает как «фактор, разделяющий транскрипцию и репарацию». CSB использует свою способность к транслокации ДНК для того, чтобы отделить комплекс RNApolII от остановленной вилки транскрипции. После обработки клеток таким агентом, как цисплатин или после УФ-облучениия наблюдается CSA и CSB-зависимая убиквитинирование RNApolII комплекса, облегчающая его перемещение и последующий протеолиз.

У дрожжей описаны дополнительный фактор Def1, взаимодействующий с Rad26 (гомолог CSB), ответственный за убиквитинирование и протеолиз RNApolII в тех случаях, когда повреждение не может быть отрепарировано. Есть ли гомолог этого фактора у человека – неясно. Для восстановления транскрипции RNApolII должна снова оказаться в гипофосфорелированной форме (только так она связывается с ДНК), количество которой резко падает после УФ-облучения. Может быть, при участии комплекса TFIIS, RNApolII комплекс не отходит от ДНК, а лишь перемещается назад на 20–35 нуклеотидов от повреждения, что позволяет ему вернуться к прерванной работе после завершения процесса репарации. Вероятно, в TCR принимают участие еще два фактора – человеческий гомолог фактора 2 (HuF2, TTF2) и АТФ-зависимфй фактор терминации RNAPII, которые также помогают убирать остановившиеся перед повреждениями РНК-полимеразы I и II. Возможно, в этот процесс вовлечен и один из белков MMR – MSH2.

Современные представления о различных системах эксцизионной репарации и их взаимосвязи могут быть хорошо отражены на рис. 13, где представлена схема, предложенная Г.Спивак, которая даже выделяет TCR в отдельный тип эксцизионной репарации нуклеотидов, а GGR считает синонимом NER.

На схеме показано, что при NER (GGR) повреждения распознаются комплексом XPC-HHR23 и, в некоторых случаях ДНК-связывающей активностью, контролируемой белком ХРЕ. Субъединицы комплекса TFIIH XPB/XPD геликазы вместе с белком ХРА и PCNA открывают ДНК вокруг повреждения. Инцизия эндонуклеазами XPG и XPF-ERCCI предшествует эксцизии олигонуклеотида, содержащего повреждение. Брешь заполняется ДНК полимеразами δ или ε, причем реакция требует присутствия RFC, PCNA и RPA. ДНК лигазаI завершает реакцию восстановления непрерывности ДНК. При BER гликозилаза, которая может быть стимулирована XPG, распознает повреждение и удаляет основание. Получившийся АР-сайт распознается АР-эндонуклеазой (АРЕ) или АР-лиазой (в некоторых случаях АРЕ и АР-лиазная активности совмещены в одном и том же белке.) Продукт действия АРЕ или АР-лиазы содержит 5’ или 3’ терминальный остаток, к которому и прилагается ДНК-полимеразная активность полимеразы β или, соответственно, еще одна АРЕ-активность.

Рисунок 13. Схематическая модель путей эксцизионной репарации ДНК у эукариот. Объяснение в тексте.

Однонуклеотидная брешь заполняется ДНК-полимеразой β, а синтез длинного участка (6-14 нуклеотидов) обычно проводят полимеразы ε/δ, PCNA, RFC и FENI. Лигаза I или комплекс лигазаIII/XRCCI завершают репарационную реакцию.

Распознавание повреждения при TCR является очень сложным, оно инициируется в момент остановки РНК-полимеразы II перед повреждением, затем TFIIH и XPG призываются в тоже место, возможно, в зависимости от природы препятствия. Дополнительные факторы, необходимые для всех типов повреждений, обозначены пятиугольниками, для массивных аддуктов – треугольниками, для поврежденных оснований – ромбами. В случае, если транскрипционный комплекс убирается или переносится, репарация протекает по пути NER, BER или другому специальному пути. Обратите внимание, что в распознавании повреждений при TCR принимают участие белки системы MMR – hMSH2, hPMS2, hMLH1.

Система эксцизионной репарации нуклеотидов, как мы уже отмечали, была подробно изучена благодаря обнаружению у человека связанных с ней генетических заболеваний. Клинические и клеточные дефекты ХР, CS и TTD были многократно описаны в различных обзорах и мы позволим себе остановиться на них достаточно коротко.

Само название – ксеродерма – было введено в медицинский обиход Гебра и Капоши в 1870 году на основе их клинических наблюдений. Определение «пигментная» было добавлено позже, в 1883 году тем же Капоши. Больные ХР имеют крайне выраженную чувствительность кожи к солнечному свету и большую частоту различных кожных изменений, таких как веснушки, изменения пигментации, сухость, кожные рубцы и множественные кожные раки, включая меланомы и карциномы. Причем средний возраст появления первой опухоли у больных ХР) – 8 лет (исследовано 186 случаев в США), в отличие от больных с подобными же опухолями, но без ХР, у которых первая опухоль появляется приблизительно в 50 лет (данные по 29 757 описанным случаям). В том же 1883 году Альберт Нейсер описал у части пациентов неврологические нарушения, которые могли быть объяснены как результат ранней гибели нейронов. В частности, один из возможных синдромов, при котором сочетаются клинические признаки пигментной ксеродермы с неврологическими нарушениями, был описан де Сантисом и Каччионе и получил соответствующее название в медицинской литературе. Таким образом, надо отметить, что неврологические нарушения достаточно часто сопровождают ХР (примерно 20 процентов всех описанных больных). Ткани глаза, такие как роговица, хрусталик и сетчатка особенно часто бывают повреждены, поскольку они постоянно подвергаются воздействиюх УФ-лучей. Из 337 описанных больных только у 9 не оказалось офтальмологической патологии. Также резко повышена вероятность появления карцином слизистой оболочки рта – в 20 000 раз по сравнению со средними значениями в популяции. Есть сообщения о нарушениях иммунной системы. Это подтверждается и случаями, когда ХР сопровождается нарушениями в костном мозге, что может отражать повышенную чувствительность клеток гемопоэтического ряда к эндогенным ДНК-повреждающим агентам. ХР распространена во всем мире, но ее частота различна в разных странах – например, в Европе и США эта цифра приблизительно составляет 1 случай на 250 000, а в Японии – 1 на 40 000. В охватывающем 830 описанных клинически с 1874 по 1982 год случаев обзоре у большей части части пациентов болезнь была диагносцирована в 12 лет, приблизительно равное число случаев у мужчин и женщин. Причем кожные проявления, такие как веснушки чувствительность к солнечному свету, отмечались уже с 1–2 лет. Родственные браки родителей отмечены приблизительно у 30 процентов больных. Во всех известных случаях болезнь передается как наследственной рецессивное аутосомное заболевание.

Клинические и клеточные нарушения могут быть самой различной силы тяжести. Клеточные исследования показывают, что культивируемые фибробласты, лимфоциты и кератиноциты ХР больных являются гиперчувствительными по критериям выживаемости и мутагенеза к воздействию УФ-лучей и химических мутагенов и канцерогенов, образующих с ДНК прочные соединения. Они обычно сохраняют нормальную чувствительность к ионизирующей радиации, алкилирующим агентам и химическим веществам, вызывающим повреждения, которые могут быть отрепараированы системой BER.

Методом слияния с различнми мутантными клеточными линиями были описаны 7 групп комплементации, то есть 7 различных типов этого заболевания. Эти формы имеет большие различия как по клиническим проявлениям, так и по репарационной способности на клеточном уровне. Кроме этого, были описаны больные (приблизительно 20 %) у которых не удалось обнаружить дефекта NER на клеточном уровне. Эта форма заболевания была названа ХР-вариант, XPV. Остановимся поподробнее на молекулярных дефектах, описанных у различных групп комплементации ХР. Различные группы комплементации также встречаются в разных странах с различной частотой.

Группа ХРА. Эта группа чаще всего встречается в Японии. Клетки в культуре показывают крайнюю чувствительность к ультрафиолетовым лучам, внеплановый синтез ДНК сотавляет 2–5 процентов от нормы. Продукт гена ХРА имеет два цинковых пальца и является ДНК-связывающимся белком, причем эта способность к связываю резко – в 1000 раз! – повышается в клетках, облученных ультрафиолетом. Этот белок локализован в ядре; с помощью сайт-направленного мутагенеза было показано, что для эксцизионной репарации небходим С-конец и один из цинковых пальцев, тогда как N-конец такой роли не играет. Также было показано, что белок ХРА взаимодействует с продуктом гена ERCC1. Это подтверждает, что ХРА белок может направлять комплекс ERCC1/XPF к поврежденному участку ДНК. В Японии 80 % больных имеют одну и ту же мутацию, находящуюся в акцепторном сайте сплайсинга третьего интрона. Это приводит к изменению рамки считывания и полностью инактивирует белок. Люди, гомозиготные по данной мутации имеют очень тяжелые симптомы заболевания.

Группа ХРВ. Это очень немногочисленная группа больных, совмещающая в себе признаки пигментной ксеродермы и синдрома Коккейна. Характеризуется крайне тяжелым течением заболевания и ярко выраженными дефектами на клеточном уровне. Внеплановый синтез ДНК составляет 3–7 % от нормы. Продуктом гена ХРВ (ERCC3) является субъединица TFIIH – фактора транскрипции РНК-полимеразы II – размером 89 КД, имеющая несколько различных активностей, в том числе АТФ-зависимую геликазную активность. Для этого белка найдены и описаны гомологи у дрожжей. Мутации в этом гене могут быть различными. У первого описанного больного, имевшего очень тяжелые признаки одновременно ХР и CS, выявлен дефект сплайсинга последнего интрона, из-за чего весь С-конец выпадает из рамки считывания. Два брата из второй семьи, у которых признаки обоих заболеваний были более сглажены, имели простую миссенс мутацию T-C, с заменой Phe на Ser в положении 99.

Группа ХРС. Это одна из самых распространенных групп комплиментации пигментной ксеродермы. Болезнь протекает по классическому типу с разной степенью выраженности симптомов. На клеточном уровне показана чувствительность к УФ-облучению, но несколько меньшая, чем в группах А и В. Уровень внепланового синтеза ДНК составляет 5-20 % от нормы. Белок ХРС участвует в распознавании повреждений.

Группа ХPD. Эта группа характеризуется тем, что пациенты имеют тяжелые неврологические симптомы, а у двух больных есть одновременно признаки XP и CS. К тому же в последнее время было установлено, что ряд больных TTD (тиотриходистрофией) имеют мутации в том же гене – ХРD. Как и ген ХРВ, он кодирует одну из субъединиц фактора транскрипции TFIIН, размером приблизительно 87 КД. Белок RAD3/rad15/XPD имеет семь доменов, что типично для ДНК-геликаз. RAD3 и XPD белки имеют АТФ-зависимую ДНК-ДНК и ДНК-РНК геликазную активность и действуют в направлении 5' к 3' той нити, вдоль которой они перемещаются, то есть в направлении противоположном действию RAD25/XPB. Естественно было поставить вопрос о том, могут ли быть связаны столь различные симптомы, как при ХР, XP/CS и TTD с различной локализацией мутаций в гене XPD. К сожалению, почти все определенные мутации в клетках больных были локализованы в С-конце белка, вне зависимости от внешних признаков заболевания. Было невозможно ясно разделить «ХР-область» и «TTD-область». При этом идентичные мутации не были найдены одновременно у больных с ХР и TTD симптомами. ХР всегда считалась результатом нарушений эксцизионной репарации. Столь отличные признаки тиотриходистрофии (ломкость волос, связанная с недостаточностью обмена серы, задержка умственного и физического развития, чешуйчатая кожа и необычное лицо) были просто удивительны. Недавнее открытие, что продукты всех трех генов, дефекты в которых приводят к этому заболеванию – XPB, XPD и TTDA – являются субъединицами транскрипционного фактора TFIIH, приводят нас к выводу, что симптомы TTD являются не результатом дефекта эксцизионной репарации ДНК, но небольшим дефектом транскрипции, который и оказывает столь специфическое действие на развитие организма. К сожалению, остается непонятным, почему у больных TTD не развиваются дополнительно клинические признаки ХР. До сих пор ни один подобный больной не описан.

ХРЕ группа. Это группа больных с классическими признаками ксеродермы, достаточно мягко выраженной симптоматики. На клеточном уровне их чувствительность ниже, чем у других групп, а уровень внепланового синтеза ДНК достигает 40–50 % от нормы. Белок ХРЕ участвует в распознавании повреждений.

Группа ХРG. Это достаточно редко встречающаяся группа комплементации, с тяжелым протеканием болезни и неврологическими дефектами. На клеточном уровне показана промежуточная чувствительность между группами А и Е, уровень внепланового синтеза ДНК не превышает 2 процентов. ХРG белок имеет размер приблизительно в 134 кД, его дрожжевой гомолог – Rad2. Оба эти белка являются эндонуклеазами, вовлеченными в специфическую инцизию поврежденного участка во время эксцизионной репарации. Нуклеаза ХРG надрезает нить, содержащую свободный 3'-конец от вилки. Недавно были описаны два неродственных случая с типичными тяжелыми симптомами синдрома Коккейна, при которых биохимический дефект соответствовал ХРG группе, ранее не ассоциировавшейся с CS. Это расширяет наши представления о возможном пересечении дефектов XP и CS. Таким образом, сейчас уже 3 из 7 групп комплементации ХР могут иметь внешние признаки CS.

Группа ХРF. Это немногочисленная группа, описанная преимущественно в Японии (сейчас появились сообщения о выявлении подобных больных в Израиле). Пациенты имеют классическое проявление болезни, обычные дефекты на клеточном уровне и сохраняют примерно 20 процентов от нормального внепланового синтеза. Это также как и ХРG эндонуклеаза, но работающая в прочном комплексе с другим белком – ERCC1 (у дрожжей соответственно комплекс Rad1/Rad10). Этот нуклеазный комплекс действует в направлении противоположном XPG-эндонуклеазе. То есть эти две нитеспецифические нуклеазы способны надрезать ДНК с разных сторон от поврежденного основания, ERCC1/ERCC4(XPF) или Rad1/Rad10 надрезает ДНК со стороны 5', а XPG или Rad2 – со стороны 3'.

ХР-вариант. Как уже отмечалось, среди пациентов, имеющих характерные признаки пигментной ксеродермы, примерно 20 процентов не отличаются от нормы на клеточном уровне по признаку выживаемости клеток после ультрафиолетового облучения и сохраняют нормальный уровень внепланового синтеза ДНК. Пиримидиновые димеры в этих клетках удаляются с той же скоростью и эффективностью, как и в клетках здоровых доноров, это подтверждается нормальным уровнем исчезновения участков, чувствительных к эндонуклеазе, специфичной к пиримидиновым димерам. Сам термин ХР-вариант и был предложен специально для таких случаев, когда при внешних признаках болезни невозможно обнаружить дефектов в эксцизионной репарации ДНК. При этом клетки ХР-вариант показывают явную недостаточность репликации поврежденных участков ДНК. О молекулярном дефекте при этой группе комплементации мы поговорим позже.

Прежде чем перейти к синдрому Коккейна, остановимся кратко на тиотриходистрофии. Это заболевание передается как аутосомное рецессивное. Для него в первую очередь характерна специфическая ломкость волос, связанная с уменьшением содержания в них низкомолекулярных богатых серой белков. Под микроскопом такие волосы выглядят как «тигриный хвост», составленный светлыми и темными поперечными полосами. С таким названием TTD была описана впервые в 1968 году. При этом белки с низким содержанием серы, выделенные из волос индивидуумов с TTD, сохраняют свой молекулярный вес и остальные биохимические свойства. Белков же с высоким содержанием серы не только меньше по количеству по отношению к контролю, но и они содержат меньше цистеина и имеют сильно измененный аминокислотный состав. Тогда же были описаны синдромы, связанные с TTD, включающие одновременно еще и такие признаки как ихтиозис, повреждение интеллектуальных функций, пониженную плодовитость и маленький рост. Названы они были по первым буквам английских обозначений IBIDS. У некоторых больных также наблюдалась и повышенная фоточувствительность, из-за чего в название была добавлена еще одна буква – PIBIDS. В тоже время надо всегда помнить, что этих больных очень немного, поэтому нет полного согласия при описании клинических проявлений синдрома. Таким образом, существует представление, что эти и, возможно, некоторые другие синдромы, включая синдром Коккейна, представляют спектр заболеваний с перекрывающимися клиническими признаками, связанных сходным патогенетическим механизмом – дефектом транскрипции особой группы генов. Необходимо отметить, что больные TTD в отличие от ХР не имеют повышенной предрасположенности к раку кожи.

Фоточувствительность проявляется примерно в половине случаев TTD, в которых одновременно показан дефект эксцизионной репарации нуклеотидов после УФ-облучения. Причем в большинстве этих случаев дефект репарации соответствует дефекту XPD и ХРВ. С этим выводом согласуется и то, что пациенты с TTD, не сопровождающейся фоточувствительностью, не демонстрируют дефекта эксцизионной репарации. Некоторые же из описанных больных TTD с фоточувствительностью дефекта генов группы ХР не имеют.

В последнее время активно изучался ген XPD от различных групп пациентов, как с пигментной ксеродермой, так и с тиотриходистрофией. На основе этого изучения была выдвинута гипотеза "транскрипционного синдрома". Сам ген XPD, как и его крайне консервативный дрожжевой гомолог Rad3, является мультифункциональным, с определеной ролью как в эксцизионной репарации так и в РНК-полимераза-II– зависимой транскрипции. Таким образом, можно предположить, что TTD (а также и некоторые другие болезни, связанные с повреждениями эксцизионной репарации ДНК) могут иметь своей причиной дефектную транскрипцию. Основной идеей данной модели является то, что некоторые мутации в гене XPD (и, возможно, в других генах с двойным участием в репарации и транскрипции), при которых не полностью подавляется их основная транскрипционная функция, могут тем не менее изменять эффективность транскрипции какой-то части генов и, в некоторых случаях, – способность гена XPD поддерживать нормальную эксцизионную репарацию. Эта часть генов может быть специфически определена как гены особенно нуждающиеся в высоком уровне экспрессии или высоко чувствительные к ее очередности во времени. Вероятно, этим могут быть объяснены дефекты развития у пациентов TTD, CS и некоторых ХР. Возможная схема этого процесса, изображенная на рис. 14, предложена Брайтоном с соавт.

На рис. 14 показаны различные возможности проявления мутаций в одном из белков, входящих в человеческий основной транскрипционный комплекс TFIIH, содержащий несколько субъединиц, в том числе белок XPD, который показан на 14А между двумя стрелками. 14В – Некоторые мутации инактивируют только ту функцию белка, которая связана с эксцизионной репарацией, и приводят к типичной ХР, сопровождающейся повышенным риском рака кожи. 14С – Другие мутации могут подавлять репарационную функцию и/или менять уровень транскрипции одного или нескольких специфических генов, приводя к клиническим и клеточным симптомам TTD, включая и уменьшение предрасположенности к раку кожи.

Клиническое разнообразие TTD может быть объяснено зависимостью от генов, затронутых в каждом конкретном случае.

Дальнейшие исследования этого транскрипционного комплекса показали, что при его введении в клетки от различных больных только в трех группах наблюдается коррекция дефекта эксцизионной репарации. Таким образом стало ясно, что кроме ХРВ и ХРD белков еще один, пока окончательно не определенный компонент TFIIH, может лежать в основе заболевания TTD. Эта группа больных была определена как TTDA.

Из этих экспериментов видно, что существуют по меньшей мере три группы комплементации фоточувствительной формы TTD. Первая – это TTDA, связанная с дефектом одной из субъединиц TFIIH, но не XPB и XPD. Вторая – определена как форма TTD, ассоциированная с дефектом в ХРВ гене, а третья – с мутацией в гене XPD. Нефоточувствительная форма TTD, не имеющая дефекта в эксцизионной репарации, показывает нам вероятное наличие еще одной, четвертой группы комплементации у этого заболевания. Хотя существует и некоторая вероятность, что у больных этой группы мутации в генах XPB, XPD и TTDA могут не затрагивать репарационную функцию, а только изменять транскрипцию.

Рисунок 14. Транскрипционная гипотеза. Объяснения в тексте.

После обсуждения транскрипционной гипотезы, хотелось бы кратко остановиться на связи TTD c раковыми заболеваниями. Хорошо известно, что все больные ХР, включая XPB и XPD группы имеют выраженную предрасположенность к раку кожи (а также и, вероятно, другим формам рака). С другой стороны большинство, если не все, больные фоточувствительной формой TTD имеют клеточный дефект эксцизионной репарации и повышенную частоту мутаций и при этом не предрасположены к раку кожи. Этот парадокс существенно поколебал основную идею о том, что дефект эксцизионной репарации нуклеотидов, повышенная мутабильность и предрасположенность к опухолям являются патогенетически связанными событиями. Транскрипционная гипотеза позволяет нам высказать еще одно предположение, почему у больных с дефектом эксцизионной репарации, таких как TTD, мы не наблюдаем рака кожи. Вероятно, что среди генов, чья транскрипция нарушена из-за дефекта в TFIIH, один или несколько могут кодировать белки, определенный уровень содержания которых необходим для развития неопластической трансформации, то есть измененный уровень экспрессии этих генов может иметь противоопухолевый эффект.