Текст книги "Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие"

Иногда в результате мейоза получаются три копии материнского аллеля и только одна копия отцовского, что свидетельствует об изменении одной копии отцовского аллеля, конвертации ее в материнский. Это явление называется генной конверсией. Оно часто происходит в связи с событиями общей рекомбинации и репарации ДНК.

Мы уже упоминали, что в ходе мейоза между гомологичными материнской и отцовской хромосомами образуется сочленение гетеродуплекса в участках кроссинговера. Если эти участки хромосом несколько различаются, в районе сочленения могут произойти нарушения спаривания нуклеотидов (mismatch). Эти нарушения будут исправляться системой репарации неспаренных оснований – MMR. В результате мы будем наблюдать явление генной конверсии. Генная конверсия может также произойти по ряду других механизмов, но все они требуют осуществления какого-то варианта общей рекомбинации, по которому две гомологичные молекулы ДНК располагаются вместе. Так как в процессе конверсии производятся дополнительные копии фрагментов ДНК, то при этом необходим ограниченный синтез ДНК. Опыт показывает, что обычно только малые участки ДНК испытывают генную конверсию и в большинстве случаев изменяется лишь часть гена.

Рисунок 18. Генная конверсия.

Генная конверсия может происходить и в митотических клетках, но значительно реже. Один из весьма вероятных механизмов генной конверсии как в мейотических, так и в митотических клетках показан на рисунке.

8. SOS-ответ у E.coli

Ошибки в ДНК возникают в результате неточной работы всех трех различных систем: подбора оснований полимеразами (base selection), редакторской 3'-5'-экзонуклеазы (proofreading) и репарации неправильно спаренных оснований (mismatch correction). Все это называется «спонтанный мутагенез», так как ошибки ДНК-полимеразы присущи самому организму, а не индуцируются извне. Однако, как известно, частоту мутаций можно значительно повысить, если организм обработать каким-либо ДНК-тропным агентом, например химическим веществом, ионизирующим или ультрафиолетовым излучением. Этот эффект называется индуцированным мутагенезом, а его механизм зависит от природы повреждения азотистого основания в ДНК. Все дефекты в ДНК удобно разбить на два класса: модифицированные азотистые основания, не блокирующие работу ДНК-полимеразы; и летальные дефекты, блокирующие работу ДНК-полимеразы. В первом случае ДНК-полимераза узнает дефектное основание и ставит напротив него комплементарное звено (например, при окислении аминогруппы цитозина, комплементарного гуанину, образуется азотистое основание с кетогруппой в четвертом положении, комплементарное аденину, в результате возникает транзиция G → А). Подобного типа дефекты носят исключительно мутагенный характер, а мутагены, индуцирующие в ДНК такие дефекты, широко используются на практике (например, производные алкилирующих соединений типа М-метил-N'-нитpo-N-нитрозогуанидина, метилметансульфоната, бисульфита и многих других).

Более сложная ситуация возникает, если в ДНК индуцируются летальные дефекты, блокирующие ДНК-полимеразу, например апуриновые/апиримидиновые сайты (abasic site или АР-сайты), циклобутановые пиримидиновые димеры (Руг-Руг) и др. В этом случае в клетке возникает особое состояние, получившее название SOS. Ключевыми элементами SOS-системы являются белки RecA и LexA. RecA уже известен нам по процессу рекомбинации (вспомним, что RecA – ключевой белок процесса гомологичной рекомбинации, способствующий формированию особого R-триплекса с гомологичным участком ДНК и переносу нити ДНК с одной молекулы ДНК на другую). LexA – репрессор группы генов (их количество около 30–40), входящих в состав SOS-регулона. LexA связывается со специфическим десятичленным палиндромом в регуляторных областях генов SOS-регулона и таким образом препятствует их транскрипции. Чем выше совершенство каждого данного палиндрома, тем крепче связан с ним репрессор LexA.

Белок RecA выполняет несколько функций. Во-первых, он имеет высокое сродство к однонитевой ДНК, поэтому при взаимодействии с онДНК образуется растянутый филамент RecA: ДНК (один мономер RecA на каждые 4 н. ДНК). Во-вторых, RecA в этом комплексе активируется (активированный RecA обозначают обычно RecA*) и приобретает свойства весьма специфической протеазы, деградирующей белок-репрессор LexA (точнее, ускоряющей авторасщепление белка LexА, то есть он может быть назван его копротеазой). В результате разрушения LexA открываются гены SOS-регулона, из которых два гена, umuD и umuС, имеют прямое отношение к индуцированному мутагенезу.

Здесь же отметим специфическую активность RecA* по отношению к белку UmuD. При взаимодействии RecA* с UmuD с N-конца UmuD отщепляются первые 24 аминокислотных остатка и образуется белок UmuD', который принимает непосредственное участие в SOS-мутагенезе.

Итак, в SOS-индуцированных клетках Е. coli в области повреждения формируется особая структура ДНК: вплоть до дефектного нуклеотида расположена двунитевая ДНК, с З'-ОН-концом последнего правильного нуклеотида которой связана ДНК-полимераза III, затем идут дефектный нуклеотид в матричной нити и однонитевая ДНК в виде филамента (RecA*: ДНК). Есть еще два уже упомянутых белка – UmuD' и UmuC, которые образуют комплекс (UmuD')₂UmuC. Основная задача этого комплекса – «проскочить» сложный дефект и, желательно, без потерь, то есть без формирования бреши напротив дефекта. Подобный вариант синтеза и носит наименование TLS (translesion synthesis). Как правило, TLS сопровождается включением во вновь синтезируемую нить нуклеотида, некомплементарного исходному основанию в матрице. В результате возрастает выживаемость клетки (SOS-репарация) и возникает мутация (SOS-мутагенез). Этот процесс схематически показан на рис. 19 (Сойфер, 1997).

Рисунок 19. SOS-ответ у Escherihia coli.

При реконструкции этого процесса в системе in vitro было показано, что очищенный комплекс (UmuD')₂UmuC в присутствии белков RecA, ATP и всех четырех dNTP самостоятельно ведет синтез ДНК, причем напротив G (перед дефектом) ставит С (dCTP, комплементарный синтез), а напротив X ставит случайный нуклеотид, то есть что этот комплекс является самостоятельной ДНК-полимеразой типа «error-prone», названной ДНК-полимераза V. Эффективность TLS (но не комплементарного синтеза) принципиально зависит от белка RecA и значительно усиливается при добавлении в смесь белка, связывающего однонитевую ДНК (SSB), и вспомогательных субъединиц ДНК-полимеразы III. В комплексе (UmuD')₂UmuC собственно полимеразной активностью обладает UmuC, а субъединица (UmuD')₂ является ее активатором. Показано, что механизм SOS-мутагенеза позволяет клетке заменить мутацию со сдвигом рамки (инсерция или делеция нуклеотида), как правило, инактивирующую ген, на более «мягкую» по последствиям мутацию замещения (транзицию или трансверсию).

В 1999 г. получены новые данные и по механизму мутагенеза на неповрежденной матрице ("non-targeted''-мутагенез). Известно, что "non-targeted''-мутагенез наблюдается при введении в SOS-индуцированные клетки неповрежденной матрицы. Показано, что белок DinB (ген dinB относится к группе SOS-генов) отвечает за "non-targeted''-мутагенез на ДНК бактериофага λ, а сверхпродукция этого белка приводит к появлению у клетки мутаторного фенотипа. Белок DinB также обладает полимеразной активностью. Он получил наименование ДНК-полимераза IV: эта полимераза не содержит редакторской экзонуклеазной активности и обладает гомологией с белками семейства UmuC. Таким образом, в клетках Е. coli к настоящему время обнаружены пять ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I (репарирующая) обнаружена А. Корнбергом в 1956–1958 годах, ДНК-полимеразы II и III (реплицирующая) выявлены в 1970–1971 годах, а ДНК-полимеразы IV и V– в 1999 году. Долгое время оставалась непонятной роль ДНК-полимеразы II (кодирующий ее ген polB/dinA также относится к группе SOS-генов). Недавно было показано, что ДНК-полимераза II играет ключевую роль в ресинтезе ДНК. Известно, что при УФ-облучении бактерий репликация хромосомы блокируется, а затем через определенное время восстанавливается. Процесс восстановления репликации и называется ресинтезом, или "replication restart". Блокирование репликации определяется двумя факторами: SOS-индуцией umuDC (именно UmuD, но не UmuD'), которые на первой стадии действуют как регуляторы чекпойнтов клеточного цикла (подробнее о чекпойнт-контроле мы будем говорить ниже), увеличивая тем самым время, необходимое для более полного проведения эксцизионной репарации ДНК; и комплексом (UmuD')₂UmuC, участвующим в процессе пострепликативной репарации ДНК. Каким именно образом ДНК-полимераза II восстанавливает синтез бактериальной хромосомы, остается пока неясным.

Рисунок 20. Роль интенсивности SOS-сигнала в процессе ответа клетки.

Помимо установления основных принципов действия SOS-системы in vitro, в последнее время получен ряд новых, принципиально важных результатов по регуляции SOS-системы in vivo. Оказалось, например, что белок UmuD расщепляется сериновой АТР-зависимой Lon-протеазой, а процессированный белок UmuD', у которого удалены с N-конца 24 аминокислотных остатка, в том числе фрагмент 15-FPLF, являющийся мишенью для Lon-протеазы, расщепляется (в комплексе с геликазой UvrD) другой клеточной сериновой АТР-зависимой протеазой ClpXP. К тому же белки RecA и LexA также являются членами SOS-регулона. В результате после SOS-индукции в бактериальной клетке довольно быстро восстанавливается уровень белков SOS-peгулона, характерный для необработанных клеток.

Интенсивность SOS-ответа клетки зависит от степени повреждения ДНК, так как только большое количество однонитевой ДНК позволяет активироваться RecA белку в количестве, достаточном для открытия SOS-регулона. Эта зависимость представлена на рис. 20 (Ланцов, 1999). Так как белок RecA связывается c LexA в том же сайте, в котором происходит его связывание с двунитевой ДНК, то при запуске SOS-ответа белок RecA не активирует процесс гомологической рекомбинации. В норме при гомологичной рекомбинации SOS-ответ также выражен слабо.

Каким же образом RecA* делает выбор между запуском SOS-ответа и инициацией гомологичной рекомбинации? Вероятно, все зависит от ситуации в клетке: быстрая диссоциация белка SSB от онДНК, то есть быстрое формирование комплекса белка RecA с онДНК приведет к SOS-ответу, который индуцирует также и синтез ряда рекомбинационных ферментов. Медленное формирование тройного комплекса завершается только гомологичной рекомбинацией со слабой SOS-индукцией. Скорость сборки комплекса зависит и от рекомбиногенной активности самого белка RecA.

На рис. 20 ясно видно, каким образом выраженность SOS-ответа зависит от количества повреждений ДНК.

8.1. Низкопроцессивные ДНК-полимеразы эукариот

У эукариот также обнаружены полимеразы, способные вести синтез на поврежденной матрице. Некоторые из них принимают самое активное участие в пострепликативной репарации, о которой мы будем говорить ниже. Номенклатура этих ДНК-полимераз была крайне не упорядочена до последнего времени. Только в 2001 году был достигнут некоторый консенсус, результаты которго представлены в табл. 5.

Например, полимераза эта (Polη) была описана разными авторами как polη, polΗ, hRad30, XPV. Эта полимераза не является малоточной, хотя и не обладает корректорской активностью. Точность ее репликации 10^-2-10^-3. Полимераза каппа (Polκ) является гомологом PolIV E.coli. Это высокоошибочная ДНК-полимераза, но в отличие от других подобных полимераз она может модулировать свою процессивность и встраивать больше, чем 25 нуклеотидов во время синтеза на поврежденной матрице. Полимераза йота (Polι) является гомологом Rad30 дрожжей и показывает уровень ошибочного встраивания 10^-2. Полимераза зета (Polζ) состоит из двух субъединиц REV3 и REV7, которые работают совместно с REV1.

Кроме синтеза на поврежденной матрице многие из этих ДНК-полимераз способны к прямому устранению повреждения. Так, человеческая полимераза лямбда (Polλ) имеющая 32 % гомологии с polβ, обладает лиазной активностью, способна вставлять нуклеотиды в маленькие бреши со свободной 5’-фосфатной группой и, вероятно, принимает участие в BER.

Меньше известно о полимеразе сигма (Polς, TRF4) (topoisomerase I related function), участвующей в когезии сестринских хроматид.

Таблица 5. Низкопроцессивные ДНК-полимеразы эукариот.

О полимеразе тета (Polθ) можно сказать только то, что она является гомологом гена mus308 дрозофилы, кодирующего ДНК-геликазу-полимеразу, вовлеченную в репарацию межнитевых сшивок.

Полимераза мю (Polμ) играет важную роль в соматическом гипермутагенезе иммуноглобулиновых генов и участвует в синтезе ДНК во время V(D)J рекомбинации и негомологического воссоединения концов. Человеческая Polμ также имеет высокую гомологию с терминальной дезоксинуклеотид-трансферазой, то есть способна к присоединению нуклеотида к концу нити ДНК без матрицы… Все это говорит о большой плейотропности функций данной группы энзимов. В табл. 5 показано, какие нуклеотиды способна поставить данная полимераза напротив повреждения.

Рисунок 21. Синтез ДНК на поврежденной матрице.

Именно эта группа ДНК-полимераз ответственна за множественные мутации, возникающие при остановке репликации, вызванной повреждениями ДНК под действием различных агентов, и последующем ресинтезе (рестарте). Было несколько попыток связать деятельность этих полимераз с SOS функциями UmuDC у прокариот и, основываясь на этом, создать картину SOS – ответа у эукариот, Вопросов, к сожалению, до сих пор больше, чем ответов.

На рис. 21 изображена работа ДНК-полимеразы η, мутация в гене которой приводит к замещению ее полимеразой ι и развитию вариантной формы пигментной ксеродермы (XPV).

9. Репарация двунитевых разрывов

Двунитевые разрывы ДНК (DSB, double strand breaks) являются наиболее тяжелыми повреждениями геномов эукариот и при отсутствии их репарации почти всегда приводят клетку к гибели. В частности, гибель клеток после действия ионизирующей радиации преимущественно связана с нерепарированными DSB, а также с хромосомными перестройками, возникающими при их неправильной репарации. DSB могут возникать спонтанно или после воздействия на клетку ионизирующей радиации и некоторых химических мутагенов.

В ядрах клеток эукариот находятся специфические для каждого вида наборы хромосом, причем одна хромосома содержит одну линейную молекулу ДНК. ДНК каждой хромосомы фланкирована особыми повторяющимися последовательностями, которые называются теломерами и составлены из большого числа тандемно расположенных блоков (TTAGGG)n. Между теломерами каждой хромосомы находятся экспрессирующиеся гены, «молчащие» последовательности ДНК, а также один особый небольшой эпигенетически заданный участок (центромера), необходимый для правильной сегрегации данной хромосомы в митозе, так как именно к нему прикрепляются нити веретена деления. Теломеры являются единственными «легально дозволенными» двунитевыми концами ДНК в клетке. Появление в молекуле ДНК нерепарированного DSB приводит к нарушению ее непрерывности и к образованию ацентрического хромосомного фрагмента, теряющегося при митозе. Если же процесс репарации DSB пройдет неточно и захватит не те концы, которые принадлежат одному и тому же разрыву, то в клетке появятся хромосомные перестройки, которые могут приводить к ее малигнизации. Каким образом это происходит, показано на рис. 22 (Томилин, 2002).

Одной из функций гомологической рекомбинации, которая, как мы уже говорили, возможна не только в мейотических, но и в соматических клетках позвоночных, является особый путь репарации двунитевых разрывов ДНК.

Рисунок 22. Воссоединение двунитевых разрывов ДНК.

Рекомбинационный механизм репарации DSB в дрожжах был впервые предложен в 1973 г. В. Г. Королевым и Л. М. Грачевой. Тогда предполагалось, что это – единственный возможный механизм репарации DSB, по своему генному контролю совпадающий с обычной гомологической рекомбинацией, однако оставалось неясным, работает ли такой механизм в соматических клетках позвоночных животных. Но к настоящему времени стало ясно, что рекомбинация не является основным способом репарации двунитевых разрывов. Репарация DSB путем гомологической рекомбинации (HRR, homologous recombination repair) происходит достаточно редко, так как для нее необходима вторая неповрежденная копия двунитевой ДНК, содержащая участок с нуклеотидной гомологией к поврежденному участку. При этом один из концов DSB внедряется в неповрежденную копию и инициирует обычный процесс генетической рекомбинации, так что понятия гомологической рекомбинации и рекомбинационной репарации у высших эукариот практически являются синонимами.

Главная опасность рекомбинационной репарации DSB в клетках позвоночных состоит в том, что их геномы содержат большое число повторов, по которым возможны «неправильные» гомологические взаимодействия, приводящие к хромосомным перестройкам за счет неравной рекомбинации. Неравная рекомбинация может и не приводить к хромосомным перестройкам, так как особенно эффективно гомологическая рекомбинация протекает путем генной конверсии между сестринскими хроматидами в поздней S-фазе и G2-фазе клеточного цикла. На механизмах, препятствующих неравной HR и появлению хромосомных перестроек между повторами мы остановимся отдельно.

Другими системами распознавания и репарации DSB в клетках эукариот являются прямое негомологическое воссоединение концов ДНК (NHEJ, nonhomologous end-joining) и отжиг по прямым повторам (SSA, single strand annealing). С них мы и начнем изучение репарации двунитевых разрывов.

9.1. Репарация двунитевых разрывов ДНК путем негомологического воссоединения концов (NHEJ)

Как мы уже отмечали, главной задачей систем репарации DSB является необходимость восстановления непрерывности поврежденной хромосомы, то есть сшивания именно тех двух концов ДНК, которые появились вследствие одного и того же DSB. Для этого их нужно быстро фиксировать в ядре и изолировать от возможного взаимодействия с концами, образованными другими DSBs, не мешая при этом правильному процессингу концов ДНК и их сшиванию лигазой. Важно понимать, что появление столь серьезного повреждения ДНК как образование DSB, часто сопровождается сопутствующими повреждениями азотистых оснований и сахарофосфатного каркаса ДНК. Такие повреждения должны быть удалены с концов ДНК с помощью нуклеаз до их сшивания ДНК-лигазами. Из этого следует, что при NHEJ в местах воссоединений почти всегда (кроме редких случаев образования «чистых» двойных разрывов, не требующих нуклеазной расчистки) образуются микроделеции, то есть такая репарация является по самой своей природе неточной. Но геномы высших эукариот в основном (более чем на 90 %) состоят из некодирующих последовательностей, и неточность NHEJ редко приводит к вредным мутациям, хотя и может вносить свой вклад в микроделеционный полиморфизм ДНК. Кроме того, нужно иметь в виду, что клетка способна эффективно репарировать лишь небольшое число DSB (несколько десятков), и количество микроделеций, возникающих при NHEJ, относительно невелико.

В принципе при воссоединении «неправильных» концов ДНК репарация DSB путем NHEJ может приводить и к большим делециям и транслокациям. Вероятнее всего, это происходит при большом количестве DSB, то есть у репарации путем негомологического воссоединения концов есть какая-то своя система отбора и сравнения тех концов, которые должны быть объединены для «правильного» воссоединения, но при избытке повреждений она с этой задачей не справляется.

На рис. 23 видно, что первым к месту разрыва подходит гетеродимер Ku, состоящий из прочно связанных друг с другом белков Ku70 (70кд) и Ku80(86кд). Он образует ассиметричное кольцо, которое надевается на свободный конец ДНК, как гайка на болт, цепляется за ДНК, и может продвигаться в глубину, позволяя связываться с длинным ДНК-концом другим белкам.

Рисунок 23. Репарация путем негомологического воссоединения концов (NHEJ)

Обычно гетеродимер Ku покрывает 16–18 н.п. Вероятно, именно два гетеролимера Ku, связавшиеся с разными концами одного и того же DSB, удерживают эти концы вместе на начальной стадии репаративной реакции и способствуют их «правильному» воссоединению.

Затем к комплексу присоединяется каталитическая субъединица протеинкиназы DNA-PKcs. Это белок размером 350Кд, обладающий протеинкиназной активностью, также имеющий открытый канал, в котором может быть связано 12 н.п. двойной спирали ДНК. По некоторым данным, она присоединяется к ДНК после Ku и сдвигает гетеродимер вглубь от конца молекулы ДНК. По другим данным, DNA-PKcs имеет четкую границу связывания с ДНК на уровне 30 н.п. от конца. Вероятнее всего, происходит и то и другое – этот белок «перекрывает» собой гетеродимер Ku. Образование комплекса Ku с DNA-PKcs необходимо для включения киназной активности DNA-PK. Собственно так и образуется особый гетеротример – ДНК-зависимая протеинкиназа. Критичным для ее активации является денатурация концов ДНК, с которыми связывается DNA-PKcs, и вовлечение нескольких нуклеотидов однонитевого фрагмента в канал ее голофермента. Активированная DNA-PK способна фосфорелировать большую группу белков, включая сам гетеродимер Ku и нуклеазу Artemis.

Активированная DNA-PKcs также способна автофосфорелироватся, что приводит к ее диссоциации от ДНК. У мышей мутации в гене, кодирующем DNA-PKcs, приводят к появлению животных с фенотипом SCID (several cobine immunodeficiency), иначе называемых «голыми» мышами.

Белок XRCC4 был выделен как фактор, ответственный за радиочувствительность и дефект V(D)J рекомбинации в клеточной линии китайского хомячка ХR-1. Этот белок имеет круглую «голову» и длинный (120Å) спиралевидный хвост. Обычно он образует гомотетрамер, в котором с каждого конца лежат по две «головы», соединенные четырьмя взаимодействующими хвостами. В репаративных реакциях XRCC4 всегда образует прочное соединение с лигазой IV, которая связывается с ним примерно в середине спирального хвоста. Эти белки формируют сложный комплекс, усиливающий ферментативную активность (например, лигирование) каждого из его участников. При этом кажется вероятным, что белок XRCC4 играет в этом комплексе структурирующую роль, так как одновременно он связывается и с белками KU и с DNA-PKcs.

Нуклеазами, участвующими в NHEJ, являются WRN (Werner syndrome nuclease), Artemis и MRE11 (meiotic recombination exonuclease, дрожжевой гомолог называется RAD58). MRE11 и WRN обладают 3’-5’ экзонуклеазной активностью и «предпочитают» протяженные 3’-концы, при этом гетеродимер Ku активирует активность WRN, а DNA-PK ее подавляет. В тоже время WRN обладает и ДНК-геликазной активностью, важной для процесса репарации с помощью гомологической рекомбинации (HR). Artemis обладает 5’-3’ экзонуклеазной активностью, но после фосфорелирования DNA-PK приобретает еще и эндонуклеазную, которая позволяет ему расплетать шпилечные петли, убирая выступающие 5’-концы и укорачивая 3’. Мутации, инактивирующие этот белок приводят у человека к крайне тяжелому наследственному синдрому радиочувствительности, сопряженной с иммунодефицитом (RS-SCID syndrome), подобному SCID у мышей.

Образование DSB после ионизирующего излучения почти всегда сопровождается фрагментацией ДНК при участии свободных радикалов, и позиционное расхождение между разрывами на отдельных нитях составляет не менее двух нуклеотидов. Это приводит к появлению выступающих частично комплементарных концов и однонуклеотидной бреши на каждой нити. Разрывы обычно имеют 5’-фосфатный (гидроксильный) конец, в то время как 3’-конец блокируется фосфатными или дезоксирибозными фрагментами и обычно представляет собой 3’-фосфогликолат (—PO4CH2COOH; PG). То есть для успешной репарации предварительно необходимо убрать блокирующую 3’-конец PG группу. Процесс NHEJ с этим успешно справляется, но именно по этой причине он обычно сопровождается микроделециями. И только тупые концы могут воссоединяться практически без вырезания концевых нуклеотидов.

Ферменты, способные убирать 3’-PGs идентифицированы. Это апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза APE1, а также белки TDP1 и PNKP, которая не только «приводит в порядок» 3’-конец, но в тоже время может фосфорелировать 5’-гидроксильные концы, причем это фосфорелирование одновременно проходит на обеих нитях ДНК. Данная реакция происходит в первые же минуты и не нуждается в полностью собранном репарационном комплексе. Более того, присоединение DNA-PKcs блокирует реакцию вымывания 3’-PGs, что заставляет нас предположить наличие фермента, сходного по действию с ранее описанными, но способного работать в контексте всего репарационного комплекса. После ограниченного расплетания двунитевой ДНК в месте разрыва и «зачистки» на образующихся концах происходит их сопоставление по участкам микрогомологии (1–3 нуклеотида).

Зашивание бреши ведет ДНК-полимераза μ (Polμ), одна из полимераз семейства Х, включающего ДНК-полимеразы μ, β и λ. Главное их различие между собой состоит в том, что полимераза μ образует прочный комплекс с XRCC4/LigIV, а полимераза β на это не способна. Polμ имеет домен, крайне сходный с таковым терминальной трансферазы, которая способна к добавлению нуклеотида к цепи при отсутствии матрицы в процессе V(D)J рекомбинации. То есть оба эти фермента вовлечены сходным образом в белковые комплексы, ведущие воссоединение концов, но в различных ситуациях. При этом клетки, дефектные по гену polμ не являются гамма-чувствительными, что говорит о том, что есть и другая полимераза, вероятнее всего – Polλ, способная полноценно замещать Polμ в реакции застройки брешей, так именно она (как и Polμ), а не репарационная полимераза β, имеет С-мотив, сходный с таковым белка BRCA1 (BRCT-motif). Этот мотив необходим для взаимодействия полимеразы с XRCC4 с образованием единого комплекса KU/Polμ/XRCC4/LigIV. Представлятся вероятным, что гетеродимер Ku остается связанным с ДНК вплоть до завершения процесса лигирования.

DNA-PKcs участвует в двух основных реакциях – во-первых, она способна удерживать рядом концы двунитевого разрыва, играет в этом удержании главную роль и делает это значительно лучше, чем гетеродимер Ku. Во-вторых, она способна к автофосфорелированию. Причем у нее есть по меньшей мере 5 сайтов автофосфорелирования, и это автофосфорелирование крайне функционально значимо. (Мутации хотя бы в одном из 5 известных сайтов приводят к повышению радиочувствительности). Вероятно, таким образом модулируется активность DNA-PK во время различных стадий репарационной реакции. К тому же DNA-PK фосфорелирует и другие белки репаративного комплекса. Складывается представление, что она связывается с концами ДНК и удерживает их до тех пор, пока не будет сформирован весь репаративный комплекс и не будут найдены «партнеры» по объединению. В тот момент, когда две молекулы DNA-PKcs от разных частей DSB вступают в контакт, они взаимно фосфорелируют друг друга и диссоциируют от репарационного комплекса, или, по крайней мере, отодвигаются от места реакции. В-третьих, DNA-PK может быть необходима для фосфорилирования нуклеазы Artemis, то есть для активации ее способности открывать шпильки во время V(D)J рекомбинации и вырезания выступающих концов во время репарационной реакции NHEJ.

На рис. 23 нужно особо отметить, что комплекс XRCC4/LigIV привлекается в репарационную реакцию еще до того, как Polμ проведет репаративный синтез. Это свидетельствует о необходимости структурного взаимодействия между Polμ и XRCC4 и о вовлечении комплекса XRCC4/LigIV в сам процесс заполнения бреши. Гетеродимер Ku выравнивает выступающие концы ДНК обеих молекул, а глобулярные «головы» белка XRCC4 связываются благодаря своему ДНК-связывающему мотиву несколько дистальнее Ku, и таким образом определяют положение лигазы IV, которая свяжется с центральной частью С-концевого хвоста XRCC4 для последующего лигирования концов. На каждой нити работает тример, состоящий из 2 молекул XRCC4 и одной LigIV. Причем этот тример образуется до того, как DNA-PKcs диссоциирует от репарационного комплекса. Сами DNA-PKcs также прочно связаны с С-хвостами XRCC4 на разных сторонах разрыва, и при их синапсисе, взаимном автофосфорилировании и диссоциации от ДНК четыре молекулы XRCC4 образуют тетрамер, сплетаясь хвостами. Последним на отрепарированной ДНК остаются два объединившихся (или расположенных прямо друг за другом) гетеродимера Ku.

Мы описали первым именно этот процесс репарации двунитевых разрывов потому, что, не нуждаясь в партнере для рекомбинации, он может протекать в любой фазе клеточного цикла, и к тому же используется клеткой в 1500 раз чаще, чем HRR.