Текст книги "Экспертиза молочного сырья"

4.4. Определение массовой доли белков 44
  ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка. ГОСТ 25179-90 «Молоко. Методы определения белка»


[Закрыть]

Белки – высокомолекулярные органические соединения, построенные из аминокислот. К основным белкам молока относятся казеин, глобулин и альбумин. Содержание белков в коровьем молоке колеблется от 2,8 до 3,8 %, в среднем, оно составляет 3,2 %, в том числе казеина около 82 %, на долю сывороточных белков приходится 15-22 % от общего количества белков молока. Молочные белки имеют важное пищевое и технологическое значение, от количественного содержания белков зависит выход сыра, творога и других белковых продуктов. Для контроля содержания белков в молоке применяют следующие методы: – метод Кьельдаля. Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля с серной кислотой. По количеству освобождающегося при этом азота в виде аммиака, определяемого титрованием, вычисляют содержание азотистых веществ.

– колориметрический метод. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки, связывать кислые красители (амидо черный) вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается обратно пропорционально количеству белка. После удаления осадка измеряют оптическую плотность раствора оставшегося красителя и по эмпирической формуле определяют массовую долю белка в молоке.

– метод формольного титрования. Метод основан на реакции щелочных аминогрупп белка с формалином, при этом образуется метиламиновая кислота и, соответственно, повышается титруемая кислотность молока, по приросту которой определяют массовую долю белка в молоке.

– рефрактометрический. Метод основан на установлении разности показателя преломления луча света, проходящего через молоко и выделенную из него (после осаждения казеина хлористым кальцием) сыворотку.

– расчетный. При выводе расчетной формулы для определения белка в молоке (Б_м) исходили из постоянства соотношения между составными частями молока. Белок: лактоза: зола = 9: 13: 2.

Определение массовой доли белков в молоке колориметрическим методом

Методика может быть реализована на универсальных фотоколориметрах типа КФК (2М, 3М, 5М), СФ-16 со светофильтрами для выделения спектральной области 590-600 нм, а также приборах «Про-Милк МК-2» фирмы Foss-Electric (Дания) и «Про-о-Мат-Ш» фирмы Funke-Gerber (Германия).

Приборы и реактивы. Весы лабораторные, рН-метр лабораторный, центрифуга молочная с частотой вращения 1000 об/мин., баня водяная с температурой 60-80 °C, термометр ртутный, кюветы кварцевые рабочей длины 10 мм, стаканчики химические стеклянные вместимостью 50 и 100 см³, пробирки стеклянные, фильтровальная бумага или фильтры бумажные (розовая лента), пипетки вместимостью 1, 2 и 20 см³, колбы мерные вместимостью 200 и 2000 см³, колбы химические вместимостью 500 и 750 см³, раствор сине-черного красителя в цитратной буферной смеси (рН 2,3).

Приготовление реактивов. Реактив 1 (буферный раствор). Взвешивают 31,7 г лимонной кислоты и 8,4 г (12-водного) или 3,4 г безводного ортофосфата натрия. Реактивы помещают в колбу и добавляют в нее 400 см³ дистиллированной воды. Содержимое нагревают до температуры около 70 °C, перемешивают до полного растворения и охлаждают до 20^оС.

Реактив 2 (раствор красителя). Навеску 4,6 г красителя «амидо черный 10 Б» помещают в колбу и добавляют в нее 200 см³ воды, нагревают до 70 °C и перемешивают до растворения красителя. Раствор отфильтровывают через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см³. Фильтр промывают водой до удаления следов красителя. Затем в эту колбу переносят реактив 1. Содержимое колбы охлаждают и доливают водой до метки, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое путем многократного переворачивания колбы. Если рН раствора не соответствует 2,3 ± 0,1, то добавляют, соответственно, концентрированную серную кислоту или гидроксид натрия.

Техника анализа. В стеклянную пробирку пипеткой вносят 1 см³ молока, приливают 20 см³ раствора красителя, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают ее содержимое, переворачивая пробирку от 2 до 10 раз, не встряхивая. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 20 мин. Затем отбирают пипеткой 1см³ надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают содержимое. Аналогичным способом разбавляют рабочий раствор красителя в 50 раз. Он должен иметь оптическую плотность 0,82 ± 0,02, если она не соответствует данному значению, то добавляют буферный раствор или раствор красителя.

На фотоэлектроколориметре или спектрофотометре в кювете с длиной рабочей грани 10 мм при 590-600 нм измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленной надосадочной жидкости. Массовую долю белка (%) вычисляют по формуле (34.3):

Б = 7,78 D – 1,34 (4.3)

где D – оптическая плотность;

7,78 и 1,34 – эмпирические коэффициенты.

Определение массовой доли белков методом формольного титрования

Метод применяют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22°Т. Консервирование проб молока не допускается.

Приборы и реактивы. Пипетки вместимостью 20 и 50 см³, пипетки градуированные вместимостью 1 и 5 см³, стаканы химические или колбы вместимостью 150-200 см³, бюретка для титрования вместимостью 25 см³. Гидроксид натрия 0,1 н и 40 %-ный растворы, приготовленные на прокипяченной дистиллированной воде, 2 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина, формалин технический 37-40 %-ный (нейтрализованный), 2,5 %-ный раствор сульфата кобальта, вода дистиллированная, свободная от углекислого газа.

Нейтрализация формалина. К 50 см³ формалина добавляют 3-4 капли раствора фенолфталеина и затем по каплям приливают сначала 40 %-ный, а в завершение 0,1 н раствор гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания.

Приготовление эталона окраски. В колбочку для титрования или химический стакан отмеривают 20 мл молока и добавляют 0,5 мл 2,5 %-ного сульфата кобальта.

Техника анализа. В химический стакан или колбу для титрования пипеткой отмеривают 20 см³ молока и добавляют 0,25 см³ (10-12 капель) раствора фенолфталеина, а затем оттитровывают 0,1 н раствором гидроксида натрия из бюретки до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 см³ нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин вторично титруют до такой же окраски, как и при первом титровании.

Массовая доля (%) общего количества белков в молоке равна количеству 0,1 н раствора щелочи, израсходованного на титрование в присутствии формалина, умноженному на коэффициент 0,959 (4.4):

Б = 0,959 • N (4.4)

где N -количество щелочи, пошедшей на титрование.

Определение массовой доли белков рефрактометрическим методом

Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометрах типа АМ и ИРФ-464.

Приборы и реактивы. Рефрактометр, водяная баня закрытого типа, электроплита, центрифуга молочная, пипетки вместимостью 5 см³, флаконы для лекарственных средств типа ФО вместимостью 10 см³, 4 %-ный раствор кальция хлористого, вода дистиллированная.

Проведение анализа. В 3 флакона отмеривают по 5 см³ молока и добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают содержимое. Флаконы помещают в водяную баню так, чтобы уровень воды достигал половины высоты флаконов, закрывают крышкой, доводят до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают воду через отверстия в крышке и наливают в баню холодную воду для охлаждения. Флаконы энергично встряхивают и разрушают белковый сгусток. После чего их помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят 1-2 капли на измерительную призму рефрактометра. Закрывают измерительную призму осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Снимают показания оптической плотности сыворотки (Б_с) по шкале «Белок» не менее 3 раз и вычисляют среднее арифметическое. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой. Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и также снимают показания (не менее 3 раз) по шкале «Белок» – Б_м. Массовую долю белка в молоке Б (%) вычисляют по формуле (4.5):

Б = Б_м – Б_с (4.5) где Б_м и Б_с – оптическая плотность молока и выделенной из него безбелковой сыворотки.

Определение массовой доли белков расчетным методом (приблизительно)

Б_м = 0,075 Ж_м + 0,098 А + 0,085 (4.6)

где Ж_м – массовая доля жира в молоке, %;

А – плотность молока, °А;

0,075, 0,098, 0,085 – эмпирические коэффициенты.

4.5. Рефрактометрический метод определения лактозы в молоке

Данным методом на рефрактометрах типа АМ-2, ИРФ, РЛ или РЛП возможно определение лактозы в молочной сыворотке.

Метод основан на способности безбелковой сыворотки, преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы.

Приборы и реактивы. Рефрактометр типа АМ-2, ИРФ или РЛ-2, водяная баня с навинчивающейся крышкой для флаконов, медицинские флакончики с резиновыми пробками, пипетка вместимостью 5 см³, капельница, вата хирургическая, бумага фильтровальная, стеклянная палочка с опаянным концом, 4 %-ный раствор хлорида кальция, вода дистиллированная.

Подготовка к анализу. Подготовка к анализу заключается в получении безбелковой сыворотки из исследуемого молока. В медицинский флакончик отмеривают 5 см³ молока и добавляют 5 капель хлорида кальция. Флакончик закрывают пробкой и перемешивают. Затем для полного осаждения белков флаконы ставят в кипящую водяную баню (с завинченной крышкой) на 10 мин. После чего воду из бани сливают через отверстия в крышке и флаконы охлаждают под проточной водой. Затем стеклянной трубкой или пипеткой с ватным тампоном в нижней части отбирают немного сыворотки, фильтруя ее через вату.

Техника анализа на рефрактометрах типа АМ-2 или ИРФ. На измерительную призму рефрактометра наносят 1-2 капли прозрачной сыворотки. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают расплывчатость и окрашенность на границе света и тени. Снимают показания по шкале «Белок» (Xi) Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой.

Затем на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды и также снимают показания по шкале белок (Х₂). Массовую долю лактозы (Л) в процентах находят по формуле (4.7):

Л = X₁ -Х₂; (4.7)

где: Х₁ – показание по шкале «Белок» для сыворотки, %;

Х₂ – показание по шкале «Белок» для дистиллированной воды, %

Техника анализа на рефрактометре РЛ-2. Рефрактометр РЛ-2 имеет две шкалы: «показатель преломления» в пределах 1,33-1,54 и «содержание сухих веществ по сахарозе» до 95 %. Рефрактометр на «0» устанавливают при 20 °C. Перед работой камеры призм рефрактометра присоединяют штуцерами к ультратермостату и пропускают воду с температурой 17,5 °C в течение 1015 мин. Затем проверяют установку нуля. На нижнюю призму наносят 2 капли дистиллированной воды, закрывают верхней и устанавливают окуляр на резкость видимости по шкале и визирной линии (представляющей собой три штриха). Окуляр перемещают до совмещения визирной линии с границей светотени. Она должна совпадать с нулевым делением шкалы сухих веществ и с делением n_D=1,333.

Призмы насухо вытирают и на поверхность нижней призмы наносят 2 капли прозрачной сыворотки. Наблюдая в окуляр, вращением рукоятки устанавливают поле зрения на фокус (ясную видимость), устраняют расплывчатость и радужность окраски границы светотени. Передвижением окуляра добиваются полного совпадения граничной линии с визирным указателем и отсчитывают показатель преломления сыворотки по левой шкале рефрактометра. Затем по таблице (Приложение Г) устанавливают массовую долю молочного сахара.

4.6. Определение механической загрязненности молока 55
  ГОСТ 8218-89 «Молоко. Метод определения чистоты»


[Закрыть]

Метод основан на отделении механической примеси из дозированной пробы молока путем процеживания через фильтр и визуального сравнения наличия механической примеси на фильтре с образцом сравнения (эталоном).

Приборы и материалы. Приборы разных конструкций (типа «Рекорд» и др.) с диаметром фильтрующей поверхности 27-30 мм, ватные фильтры лабораторные, фланель (отбеленная).

Техника анализа. На сетку прибора кладут ватный или фланелевый фильтр в виде кружка и закрепляют. Пробу молока объемом 250 см³, подогретую до температуры (35±5)°С, тщательно перемешивают и пропускают через приготовленный фильтр. По окончании фильтрования фильтр помещают на лист пергамента и просушивают на воздухе. В зависимости от количества механической примеси на фильтре молоко подразделяют на три группы (таблица 4.3).

Таблица 4.3 – Определение группы чистоты молока

⁶ Цвет фильтра должен соответствовать цвету молока в соответствии с требованиями стандарта. При изменении цвета фильтра молоко, независимо от количества имеющейся на фильтре механической примеси, относят к третьей группе чистоты.

4.7. Методы определения микробной обсемененности молока 66
  ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа. ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье – сырье. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов»


[Закрыть]

Пробы для микробиологических исследований отбирают в стерильную посуду с помощью специальных приспособлений с соблюдением правил асептики. Инвентарь для отбора проб перед использованием стерилизуют фламбированием (протирание ватой, смоченной спиртом, с последующим обжиганием на огне) или в автоклаве. Стерильные колбы с пробами закрывают стерильными пробками, горлышко посуды и пробку обертывают бумагой и обвязывают. Отобранные пробы следует исследовать не позднее 4 ч с момента взятия, при условии хранения или транспортирования при температуре не выше 6 °C.

Определение бактериальной обсемененности молока может быть проведено путем непосредственного посева молока на питательную среду (чашечный метод) или по редуктазной пробе.

Эта проба является косвенным показателем микробного загрязнения сырого молока. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.

Метод основан на восстановлении резазурина окислительновосстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Определение микробной обсемененности молока редуктазными пробами

Приборы и реактивы. Редуктазник или водяная баня с терморегулятором, пробирки диаметром 20 мм и высотой 180 мм, пипетки вместимостью 1 и 20 см³, рабочий раствор резазурина (готовится из основного).

Основной раствор: 100 мг резазурина растворяют в 200 см³ прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Срок хранения не более 20 сут. при 3-5 °C.

Рабочий раствор готовят из основного разбавлением прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1: 10. Срок хранения не более 7 сут.

Техника анализа. Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого сырого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок.

Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 ±1) °С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с сырым молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру (37 ±1) °С поддерживают в течение всего времени определения. Пробирки с сырым молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).

Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из классов в соответствии с таблицей 4.4.

Таблица 4.4 – Определение бактериальной обсемененности и класса молока по редуктазной пробе с резазурином

Примечания: 1. Для оценки качества сырого молока при бактериальной обсемененности до 100 тыс. в 1 см³ используют посев на чашки Петри.

2. При бактериальной обсемененности сырого молока до 300 тыс. время выдержки проб составляет 1,5 ч. Окраска сырого молока – от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком.

3. Цвет сырого молока от бледно-розового до белого через 1 ч выдержки свидетельствует о бактериальной обсемененности свыше 4 млн. жизнеспособных клеток.

Цветовая шкала для определения класса сырого молока по редуктазной пробе с резазурином представлена в приложении Д.

Определение микробной обсемененности молока биолюминесцентным методом

Метод основан на растворении соматических клеток, белка и жира молока АТФ-реагентом; фильтровании полученного образца через бактериальный мембранный фильтр; растворении отфильтрованных микроорганизмов реагентом на основе диметилсульфоксида; расчете концентрации АТФ микроорганизмов в полученном растворе по его биолюминесценции и определении количества микроорганизмов в 1 см³ молока.

Приборы и реактивы: люминометр, обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм; люминонометрическая кювета (типа фильтраветы); штатив для фильтравет; шприц медицинский вместимостью 5 см³; наконечник резиновый к медицинскому шприцу; фильтровальная бумага; пипетки автоматические вместимостью 0,02 см³, 0,1 см³ и 1 см³; наконечники к автоматическим пипеткам стерильные; баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1)^oC. Реагенты: флакон № 1 – АТФ-реагент ЛЮМТЕК, лиофильно высушенный; флакон № 2 – раствор для реконструкции АТФ-реагента; флакон № З – АТФ-контроль, лиофилизованный; флакон № 4 – реагент для разрушения бактериальных клеток, раствор; флакон № 5 – реагент для предобработки молока, лиофилизованный; флакон № 6 – промывочный раствор. Внимание! Реагенты следует хранить в холодильнике при температуре от 0 до 6 °C.

Для получения воспроизводимых результатов анализа молока необходимо соблюдать меры предосторожности, принятые при работе в микробиологической лаборатории, в частности: перед проведением анализа поверхность лабораторного стола обработать 70 % этанолом; использовать автоматические пипетки и стерильные наконечники к ним; для выполнения каждой операции использовать новый стерильный наконечник; после анализа каждого образца молока штативы для фильтравет, фланцевый наконечник шприца, пинцет и автоматические пипетки стерилизовать 70 % этанолом.

Подготовка реагентов к анализу. Во флакон № 1 внести 2 мл раствора из флакона № 2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4 °C – в течение 2-3 дней.

Во флакон № 3 внести 1 мл раствора из флакона № 4, перемешать. Полученный раствор АТФ контроля имеет концентрацию АТФ 10 пикомоль/мл. Полученный раствор следует использовать в течение одного рабочего дня.

Проверка АТФ-реагента по АТФ-контролю. Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. Внести в нее 0,02 мл раствора АТФ-контроля из флакона №З и 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемешать, добавить 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить биолюминесцентный сигнал. Повторить измерения еще раз и найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля (I_K0HmpX Если измеренные значения различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Техника анализа. Образец анализируемого молока объемом 50 мл довести до комнатной температуры и тщательно перемешать. Внести 1 мл молока во флакон № 5 с реагентом для предобработки молока и тщательно перемешать. Закрыть флакон, поместить его в водяную баню (45 ± 0,5)^оС на 10 мин. Поместить в штатив для фильтравет с помощью пинцета фильтровальную полоску и установить на неё две фильтраветы.

Внести в одну фильтравету 0,2 мл предобработанного молока и продавить его на фильтровальную бумагу, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Сдвинуть фильтровальную полоску так, чтобы под фильтраветой оказался сухой участок полоски. Внести в ту же фильтравету две капли промывочного раствора из флакона № 6 и продавить его в фильтровальную полоску, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником.

Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра и внести в нее 0,02 мл раствора из флакона № 4. Добавить через 1-2 мин в ту же фильтравету 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемещать, затем добавить 0,05 мл АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить максимальный биолюминесцентный сигнал (I_М0Д).

Повторить операции со второй фильтраветой. Найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для образца молока (I_М0Д). Если измеренные значения (I различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Рассчитать концентрацию АТФ в молоке по формуле (4.8):

Определить величину КМАФАнМ по таблице 4.5, приведенной ниже.

Таблица 4.5 – Определение КМАФАнМ в сыром молоке биолюминесцентным методом