Читать книгу "Альгология и микология. Практикум"

2.2. Методы сбора, хранения и изучения миксомицетов, грибов и грибоподобных организмов

Материал для занятий собирают с ранней весны до поздней осени. Для сбора грибов необходимо брать ботанизирку, сумку с коробками разного размера, складной нож, топорик, писчую бумагу для этикеток, блокнот для записей, карандаш.

Сбор миксомицетов. Плодовые тела (спорангии, эталии) миксомицетов нужно собирать вместе с кусочками субстрата. Собранный материал сохраняют в сухом виде в небольших коробочках (можно в спичечных) или консервируют 96%-м этиловым спиртом и хранят в баночках с хорошо притертыми пробками.

Сбор почвенных грибов и грибоподобных организмов. Сбор, просушка и гербаризация грибов-паразитов травянистых растений производится таким же образом, как и высших растений. Для фиксации материала пораженные участки листьев, стеблей или целые органы вырезают, кладут в банку с притертой пробкой и заливают 96%-м этиловым спиртом. Иногда материал фиксируют раствором Карнуа, а через сутки его промывают спиртом до удаления запаха уксусной кислоты и кладут на хранение в 96%-й этиловый спирт (например, Cystopus, Peronospora). Высушенные пораженные органы растения раскладывают в конверты и используют на занятиях. Фиксированный и сухой материал служит для приготовления постоянных препаратов в глицерин-желатине.

Мясистые плодовые тела грибов сохранить значительно труднее, чем сухие. Апотеции многих дискомицетов хорошо сохраняются в фиксированном виде – в 96%-м этиловом спирте. Перед фиксацией плодовые тела тщательно очищают от земли и других посторонних частиц. Фиксация таким же способом шляпочных грибов, как правило, приводит к изменению их окраски и формы, что лишает возможности идентификации. Лучший способ сохранения естественной окраски и формы плодового тела гименомицетов – гербаризация по методу С.И. Ростовцева (1924), при которой тонкие срезы ножки, шляпки и споровый порошок наклеивают на бумагу, пропитанную желатиной. Для этого лист писчей бумаги густо смазывают горячим раствором желатины (1 часть желатины растворяют в 5 частях воды, к раствору добавляют несколько капель крепкой карболовой кислоты) и высушивают. При этом углы бумаги прикрепляют кнопками, чтобы она не коробилась. Приготовленная бумага должна храниться в сухом месте.

Для изготовления гербарного образца берут кусок желатинной бумаги, кладут ее желатинированной стороной вверх на тарелку с небольшим количеством воды; бумага становится липкой. У гриба отрезают ножку под самой шляпкой. Шляпку разрезают пополам и из ее половинок осторожно выскабливают мясистое содержимое, оставляя наружный тонкий слой. Такую же процедуру выполняют и с ножкой. Затем помещают приготовленные шляпку и ножку на желатинную бумагу (наружной стороной кверху). Другой экземпляр такого же гриба острым ножом разрезают вдоль (ножку и шляпку, не отделяя их друг от друга) и из любой половинки вырезают вдоль всего гриба как можно более тонкую пластинку, которую кладут на желатинную бумагу. Когда весь лист желатинной бумаги будет замещен препаратами гриба, на него кладут фильтровальную бумагу и помещают под легкий пресс. Бумагу следует несколько раз менять до полного высушивания гриба. Высохшие препараты вырезают ножницами вместе с желатинной бумагой и приклеивают на лист плотной бумаги (ватман). Сначала приклеивают ножку, а на ее верхний конец – половинку шляпки и рядом разрез. Поскольку для определения этих грибов большое значение имеет окраска спорового порошка, шляпку свежесобранного зрелого гриба отрезают у самой ножки и кладут гименофором вниз на белую писчую или синюю проклеенную (в зависимости от окраски спор), или желатинную бумагу и закрывают стеклянным колпаком, оставляя на 12 – 24 ч. За это время отпавшие с базидий споры образуют на бумаге отпечаток гименофора, и становится заметной окраска спорового порошка. Шляпку осторожно снимают, а бумагу со спорами кладут на тарелку и наливают немного особого лака, служащего для закрепления спор. Он состоит из 1 части сандаракса, 2 частей мастики, 2 частей канадского бальзама и 25 частей скипидара. Лак медленно просачивается через бумагу, и, когда она намокает, ее снимают и сушат 12 и более часов. После этого весь отпечаток вырезают и наклеивают на лист ватмана рядом с плодовым телом гриба. Туда же приклеивают этикетку, на которой следует указать окраску плодового тела гриба в момент сбора, определенную по шкале цветов, например А.С. Бондарцева (1953).

Твердые плодовые тела просушивают до полного удаления влаги. Они могут храниться длительное время. Рекомендуется собирать грибы с корой дерева или другого субстрата, на котором они были найдены. Для предотвращения засорения посторонними спорами каждый вид при сборе кладут в отдельный пакет или бумагу, а затем хранят в отдельной коробке.

Многие грибы выращивают в лаборатории, например, РПо-bolus, Мисог хорошо развиваются на свежем конском навозе, а Sclerotlnla — на пораженном корне моркови под колпаком.

Большинство грибов легко культивируются на различных питательных средах в течение длительного времени. Это дает возможность показать живой материал на нужной стадии развития или зафиксировать его впрок. Грибы одинаково хорошо растут на жидких и твердых агаризованных средах.

Сбор водных грибов и грибоподобных организмов. Для обнаружения сапротрофных и факультативных паразитов из пор Saprolegniales, развивающихся на различных погруженных в воду субстратах растительного и животного происхождения, пользуются методом «приманок». Для этого прудовую или речную воду разливают нетолстым слоем в стеклянные, чисто вымытые и простерилизованные сосуды, затем туда помещают различные приманки: семена конопли, льна, мертвые личинки и взрослые особи различных насекомых, муравьиные «яйца», кусочки белка вареного яйца и др. Эти приманки оставляют на поверхности, погружают на дно сосудов или прикрепляют на нитях на разной глубине. При комнатной температуре через 3 – 4 дня будет хорошо заметен белый мицелий, пронизывающий субстрат и разрастающийся от него радиально во все стороны. Когда мицелий хорошо разовьется, на кончиках гиф появятся зооспорангии. Этот материал можно использовать для ознакомления с бесполым размножением сапролегнии и строением ее мицелия. Его можно также зафиксировать в 70 – 80%-м спирте. На 10 – 14-й день, когда запас питательных веществ начинает истощаться, появятся оогонии и антеридии.

Для выявления водных гифомицетов в водоемах берут образцы погруженных в воду разлагающихся или уже скелетированных листьев и веток деревьев и кустарников, стеблей травянистых растений, кусочков древесины и др. Отмытые непосредственно в водоеме образцы листьев и других субстратов помещают в колбы с широким горлом, склянки или чашки Петри. Пробы пены и поверхностной пленки отбирают в пробирки или склянки. В лаборатории их рассматривают под микроскопом на предмет наличия конидий водных гифомицетов непосредственно после сбора. Для более длительного хранения такие пробы необходимо фиксировать раствором Люголя или 4%-м раствором формалина.

Пробы листьев и других субстратов в лаборатории тщательно промывают дистиллированной водой, затем помещают в чашки Петри со стерильной водопроводной или дождевой водой. Материал исследуют через 24 ч, а потом ежедневно в течение 5 – 6 дней. При этом должны быть хорошо видны конидиеносцы и конидии.

Веточки деревьев и кустарников, кусочки древесины инкубируют во влажных камерах в течение 3 – 4 недель, а затем материал микроскопируют.

2.3. Место грибов в современной системе органического мира

Со времен К. Линнея (1735) грибы на основе ряда значимых признаков традиционно относили к царству растений. Однако уже в XIX в. многие ботаники указывали на существенные отличия грибов от растений, и Э. Фриз в 1831 г. предложил выделять грибы в самостоятельное царство органического мира.

Многочисленные материалы по биохимии и физиологии, ультраструктуре клетки, характеру обмена веществ и способу питания грибов, полученные в XX в. специалистами многих стран мира, подтверждают предположение о том, что грибы не имеют прямой эволюционной связи с растениями, как считалось ранее. Они занимают промежуточное положение между растениями и животными и имеют признаки представителей обоих царств. На основании этих результатов можно также предположить, что грибы выделились в самостоятельный ствол живого мира еще до разделения живых организмов на растения и животных. Они представляют отдельную эволюционную (филогенетическую) линию эукариот и рассматриваются как самостоятельное царство органического мира.

По сочетанию основных признаков (подвижность, строение зооспор и гамет, состав клеточной стенки, путь синтеза лизина и др.) традиционно относящиеся к грибам организмы в настоящее время разделены на три самостоятельные эволюционные линии и распределены по трем царствам живой природы – Протозоа (Protozoa), Хромиста (Chromista) и Настоящие грибы (Fungi) (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Отделы и классы грибов и грибоподобных организмов (по Гарибовой, Лекомцевой, 2005)

В царство Protozoa в качестве четырех отделов включены организмы, объединенные в группу «миксомицеты».

К царству Chromista относятся грибоподобные организмы, или псевдогрибы, а также бурые, золотистые, желтозеленые водоросли и др. Представители этого царства имеют митохондрии с трубчатыми кристами, перистые жгутики с мастигонемами. В состав их клеточной стенки входит целлюлоза; хитин и β-глюкан в ней отсутствуют.

Царство Настоящие грибы объединяет организмы, в состав клеточной стенки которых входит хитин в сочетании с β-глюканом, маннаном или с хитозаном. Подвижные стадии (зооспоры, гаметы) в цикле развития имеются только у представителей отдела Chytrldyomycota. Биосинтез лизина у них идет через α-аминоадипиновую кислоту.

Систематика грибов и грибоподобных организмов

2.4. Отдел Оомикота (Oomycota)

Отдел объединяет свыше 550 видов – от примитивных водных организмов до высокоспециализированных паразитов наземных растений. Несмотря на такое экологическое разнообразие, оомикоты чрезвычайно однородны онтогенетически, химически и физиологически и четко отличаются от других грибоподобных организмов и настоящих грибов.

Вегетативное тело оомикот представлено хорошо развитым несептированным (лишенным перегородок) мицелием с неограниченным верхушечным ростом. Вегетативная стадия – диплоидная. В клеточных стенках тела содержится преимущественно полисахаридный комплекс глюкан-целлюлоза; только у лептомитальных в них обнаружен также хитин. В качестве запасного продукта накапливается водорастворимый глюкан миколаминарин. Гликоген, типичный для настоящих грибов, отсутствует.

Подвижные стадии (зооспоры) оомикот имеют два жгутика (передний – перистый, задний – гладкий).

Отдел Oomycota включает 1 класс Oomycetes, повторяющий признаки отдела.

Бесполое размножение оомицетов осуществляется двухжгутиковыми зооспорами, реже конидиями. Половой процесс преимущественно оогамный. Содержимое антеридия, не дифференцированное на гаметы, через антеридиальные отростки переливается в оогоний, где его ядра сливаются с яйцеклетками. Оплодотворенные яйцеклетки покрываются многослойной оболочкой и превращаются в зиготы (ооспоры), прорастающие после периода покоя зооспорангием или мицелием.

Оомицеты обитают в воде и на суше. Среди них имеются как паразиты водорослей, водных животных и высших наземных растений, так и сапротрофы.

Оомицеты в своем происхождении связывают с водорослями, в частности с разножгутиковыми. У них аналогичный жгутиковый аппарат, в клеточной стенке содержится целлюлоза, сходны пути биосинтеза лизина. У оомицетов в отличие от грибов кристы митохондрий имеют трубчатое строение.

В состав класса входит 10 порядков, более 70 родов и свыше 550 видов. Порядки выделяются по уровню организации таллома и особенностям бесполого и полового размножения. Наибольший интерес представляют 2 порядка – Сапролегниальные и Пероноспоральные.

Порядок Сапролегниальные (Saprolegniales). У представителей данного порядка обычно хорошо развит несептированный мицелий, имеющий 2 типа гиф. Тонкие разветвленные (ризоидальные) гифы прорастают в субстрат, а более толстые развиваются над субстратом и несут органы бесполого и полового размножения – зооспорангии, оогонии и антеридии. Зооспоры с двумя жгутиками – бичевидным и перистым. При этом у ряда представителей наблюдается дипланетизм (размножение зооспорами в две стадии). Зооспоры каждой стадии различаются по внешнему виду (диморфизм): первичные, как правило, бывают грушевидной, а вторичные – почковидной формы.

Половой процесс оогамный. При этом внутри оогония образуется 4-8 (иногда до 50) ооспор. Важное систематическое значение имеет взаимное расположение оогония и антеридия, которые могут развиваться на одной или на разных ветвях мицелия. Есть и гетероталличные формы.

Обитают сапролегниальные преимущественно в пресных водоемах. Большинство из них живут как сапротрофы на растительных и животных остатках. Некоторые паразитируют на водорослях, водных грибах, икре рыб и лягушек, молоди рыб.

Типичным представителем порядка является род сапролегния.

Род сапролегния (Saprolegnia) включает грибы с хорошо развитым мицелием, дифференцированным на ризоидальные и вегетативные гифы. Концы некоторых гиф булавовидно вздуты и имеют более густую, темную, зернистую цитоплазму, которая отделяется перегородкой. Так образуется зооспорангий. После выхода из него через отверстие первичных зооспор в опустевший зооспорангий снизу может врастать новый зооспорангий от той же гифы, и процесс врастания (пролиферация) может повторяться несколько раз (рис. 2.2). Первичные зооспоры грушевидной формы с двумя жгутиками на переднем конце после выхода из зооспорангия превращаются в цисту. Через какое-то время из цисты выходят вторичные зооспоры почковидной формы с двумя прикрепленными сбоку жгутиками. Вторичные зооспоры способны прорастать в новый мицелий.

Антеридии плотно прилегают к оогонию и образуют отроги, проникающие через поры оболочки к яйцеклеткам. По отрогам содержимое антеридия перетекает в яйцеклетки.

Рис. 2.2. Saprolegnia: а - молодой зооспорангий; б - выход зооспор из зооспорангия; в – пролиферация зооспорангия; г – оогоний с яйцеклетками (1) и антеридиями (2)

После оплодотворения формируются ооспоры с толстой оболочкой, которые обычно переходят в состояние покоя. Ооспоры после периода покоя прорастают в короткую гифу с зооспорангием на конце.

Известно несколько десятков видов, распространенных в водоемах по всему земному шару. Сапролегнии развиваются сапротрофно на отмерших насекомых и редко на остатках водных растений. Некоторые сапролегнии являются паразитами рыб, раков и других водных животных, вызывая у них сапролегниоз. Наиболее известные представители – С. паразитная (S. parasitica), С. смешанная (S. mixta) и С. плодоносная (S.ferax).

Порядок Пероноспоральные (Peronosporales). Порядок объединяет преимущественно наземные организмы с хорошо развитым, ветвящимся, несептированным мицелием.

У низших представителей мицелий простирается как на поверхности, так и внутри субстрата, его питание осуществляется всей поверхностью гиф. У более высокоорганизованных видов (семейство пероноспоровых) мицелий межклеточный (эндофитный); его питание осуществляется посредством гаусторий.

Размножаются пероноспоральные бесполым и половым путями.

Бесполое размножение происходит зооспорами почковидной формы с двумя жгутиками, отходящими сбоку. У эволюционно продвинутых форм образуются конидии, а также хламидоспоры.

Половой процесс – оогамия или анизогамная гаметангиогамия. В оогонии содержится одна яйцеклетка. После ее оплодотворения формируется ооспора с гладкой, бородавчатой или шиповатой оболочкой. Прорастает ооспора мицелиальным ростком либо зооспорангием.

Порядок включает более 300 видов, в том числе в Беларуси их более 70. Среди них встречаются такие, которые ведут водный (сапротрофы на органических остатках, паразиты водорослей) и наземный (паразиты высших растений) образ жизни. На этой группе оомицетов можно проследить эволюцию видов по линии их перехода от водного образа жизни к наземному и от сапротрофности к паразитизму. Например, у наземных оомицетов черты приспособленности к водному образу жизни сохранились и в настоящее время. Это проявляется в прорастании зооспорангиев только при наличии капельно-жидкой среды, а в ее отсутствие спорангии функционируют как конидии.

Род фитофтора (Phytophthora) включает представителей с четко выраженным плеоморфизмом, обусловливающим образование различных стадий со сменой гаплоидной фазы диплоидной: мицелия, зооспорангиеносцев с зооспорангиями (конидиями), хламидоспор, зооспор, оогониев с антеридиями и ооспор. Эти стадии постоянны в цикле развития данной группы, за исключением Ph. infestans, у которой половой процесс в большинстве своем редуцирован из-за приспособленности ее сохраняться вегетативно в виде мицелия в клубнях картофеля и, как следствие, ооспоры образуются сравнительно редко.

Мицелий хорошо развитый, ветвящийся, белый, паутинистый, с разветвленными гаусториями, которые проникают в клетки мезофилла и высасывают из них питательные вещества. Спорангиеносцы крупные, простые или слаборазветвленные. На субстрате они образуют плотный беловатый или буроватый налет. В присутствии капельно-жидкой среды на боковых веточках спорангиеносцев формируются лимоновидные зооспорангии, внутри которых развивается 6—16 двухжгутиковых зооспор. Зооспоры прорастают в гифы, внедряющиеся через устьица в ткань листа и заражающие растение-хозяина (рис. 2.3).

При недостатке влаги спорангии функционируют как конидии, т.е. отваливаются и прорастают гифой.

Известно более 70 видов фитофторы, распространенных по всему земному шару. В Беларуси их описано около 10. Из них наиболее известны Ф. инфестанс (Ph. infestans), Ф. кокгорум (Ph. cactorum) и Ф. земляничная (Ph. fragariae). Фитофтора инфестанс – возбудитель болезни картофеля, известной под названием фитофтороз. Внешне заболевание проявляется обычно во второй половине лета, когда на листьях картофеля возникают бурые пятна с беловатым налетом снизу листа. В конце лета или осенью ботва чернеет и гниет.

На клубнях фитофтороз имеет вид твердых, слегка вдавленных пятен неправильной формы, окрашенных в бурый или серый цвет. Позже от пораженных мест в мякоть клубня распространяются слаборасплывчатые пятна или полоски светло-коричневого цвета. Больные клубни плохо хранятся и при высадке служат основным источником первичной инфекции на поле.

Рис. 2.3. Phytophthora infestans: a - разрез листа картофеля с выходящими из устьица конидиеносцами; б – конидия (зооспорангий); в – зооспора; г – прорастание зооспорангия; д - прорастание конидии гифой

Род плазмопара (Plasmopara). Объединяет облигатных (обязательных) паразитов, поражающих преимущественно надземные органы растений. Хорошо развитый, ветвистый мицелий распространяется по межклетникам тканей и образует шаровидные или эллипсовидные гаустории. Спорангиеносцы древовидные, моноподиально разветвленные, выступают одиночно или пучками из устьиц на нижней стороне листа. Короткие боковые ветви отходят от спорангиеносца под прямым углом (родовой признак) и несут по одному овальному спорангию, прорастающему зооспорами (рис. 2.4).

Половой процесс – оогамный. Ооспора имеет многослойную оболочку. После периода покоя ооспора прорастает либо мицелием, либо спорангиеносцем со спорангием (конидиеносцем с конидиями).

Рис. 2.4. Plasmopara.Спорангиеносец со спорангиями

Рис. 2.5. Peronospora. Спорангиеносец со спорангиями

Грибы вызывают опасную болезнь многих культурных и дикорастущих растений, называемую ложной мучнистой росой (пероноспороз).

Известно несколько десятков видов, распространенных по всему земному шару. В Беларуси их около 10. Наиболее распространены П. винограда (P. viticola), вызывающая опасную болезнь винограда – милдью, П. снежная (P. nivea), развивающаяся на листьях растений семейства зонтичных, П. подсолнечника (P. helianthi), поражающая растения подсолнечника, начиная со всходов.

Род пероноспора (Peronospora) является наиболее совершенной группой организмов в семействе пероноспоровых. Это выражается прежде всего в том, что у представителей данного рода бесполое размножение осуществляется только конидиями, утратившими свою связь с зооспорангиями, от которых они берут свое начало.

Мицелий разветвленный, межклеточный, с крупными гаусториями. Конидиеносцы имеют древовидную, дихотомически разветвленную форму (рис. 2.5). На их коротких, заостренных, прямых: или изогнутых ветках образуются одиночные конидии овальной или эллипсовидной формы без сосочков на вершине. Прорастают конидии гифой. Оогонии и антеридии, а также ооспоры формируются внутри тканей растений-хозяев.

Рис. 2.6. Albugo Candida. Спорангиеносец со спорангиями под эпидермисом листа

Представители рода являются облигатными паразитами многих культурных и дикорастущих растений, вызывая ложную мучнистую росу.

Известно около 300 видов. Наиболее вредоносные виды – П. свеклы (Р. schachtii), П. табака (Р. tabacina), П. капусты (Р. brassicae), П. разрушительная (Р. destructor) и др.

У рода альбуго (Albugo) мицелий разветвленный, межклеточный, с многочисленными шаровидными гаусториями. Спорангиеносцы короткие, простые, булавовидные, формируются тесно скученными группами в виде сплошного слоя под эпидермисом листа. Округлые спорангии располагаются на спорангиеносцах в виде цепочек (рис. 2.6). После разрыва эпидермиса спорангии рассеиваются и прорастают двухжгутиковыми зооспорами. Ооспоры шаровидные, с толстой бурой оболочкой, прорастают зооспорами, редко мицелием со спорангием на конце.

Род включает более 10 видов, распространенных в странах Европы, Америки, Африки. В Беларуси 5 видов, паразитирующих преимущественно на растениях семейств сложно– и крестоцветных. Чаще других встречаются А. белый (A. Candida), А. козлобородниковый (A. tragopogonis А. амарантовый (A. bliti).

Задания

1. Рассмотреть пораженных сапролегнией мертвых мух, на которых хорошо заметен белый в виде пуха мицелий, пронизывающий тело насекомого и разрастающийся от него радиально во все стороны. Приготовить препарат. Для этого небольшое количество пушка берут пинцетом, помещают в каплю воды на предметное стекло и рассматривают вначале при малом, затем при большом увеличении микроскопа.

Изучить строение мицелия и зооспорангиев и зарисовать их. На готовом препарате найти, изучить и зарисовать оогонии, антеридии и ооспоры.

2. Рассмотреть пораженные фитофторой ботву и клубни картофеля. Изготовить временный водный препарат, соскоблив препаровальной иглой или лезвием немного налета с нижней стороны листа в каплю воды на предметное стекло, накрыть покровным стеклом и рассмотреть при большом увеличении микроскопа. Изучить и зарисовать конидиеносцы (спорангиеносцы) и конидии (спорангии) возбудителя фитофтороза.

3. Рассмотреть пораженные плазмопарой листья сныти – Aegopodium podagraria. Изготовить временный водный препарат таким же способом, как и для фитофторы. Изучить и зарисовать спорангиеносцы и спорангии плазмопары.

На готовых препаратах изучить и зарисовать оогонии, антеридии и ооспоры.

4. Рассмотреть стебли пастушьей сумки (Capsella bursa pastoris), пораженные альбуго (A. Candida). Обратить внимание на симптомы заболевания.

Сделать поперечный срез через пораженные места стебля. Рассмотреть под микроскопом и зарисовать короткие неветвящиеся спорангиеносцы и спорангии, расположенные тесным слоем под приподнятым эпидермисом.

На готовом препарате изучить и зарисовать развивающиеся в межклетниках растения-хозяина оогонии, антеридии и ооспоры.

Вопросы и задания для самоконтроля

1. Каковы отличия оомицетов от настоящих грибов?

2. Назовите особенности строения органов бесполого размножения оомицетов в связи с их образом жизни.

3. Охарактеризуйте циклы развития сапролегнии и фитофторы.

4. Что такое диморфизм и дипланетизм?

5. В чем сходство и отличие полового процесса в разных семействах оомицетов?

6. На примерах отдельных представителей оомицетов проследите путь постепенной приспособляемости грибоподобных организмов к наземным условиям существования, а также путь перехода их от сапротрофного к паразитическому образу жизни.

7. Назовите пероноспоральные организмы, являющиеся возбудителями опасных болезней культурных растений, и перечислите меры борьбы с ними.