Текст книги "Оценка качества и безопасности молока"

2.4. Рефрактометрический метод определения лактозы в молоке

Данным методом на рефрактометрах типа АМ-2, ИРФ, РЛ или РЛП возможно определение лактозы в молочной сыворотке.

Метод основан на способности безбелковой сыворотки, преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы.

Приборы и реактивы. Рефрактометр типа АМ-2, ИРФ или РЛ-2, водяная баня с навинчивающейся крышкой для флаконов, медицинские флакончики с резиновыми пробками, пипетка вместимостью 5 см³, капельница, вата хирургическая, бумага фильтровальная, стеклянная палочка с опаянным концом, 4 %-ный раствор хлорида кальция, вода дистиллированная.

Подготоека к анализу. Подготовка к анализу заключается в получении безбелковой сыворотки из исследуемого молока. В медицинский флакончик отмеривают 5 см³ молока и добавляют 5 капель хлорида кальция. Флакончик закрывают пробкой и перемешивают. Затем для полного осаждения белков флаконы ставят в кипящую водяную баню (с завинченной крышкой) на 10 мин. После чего воду из бани сливают через отверстия в крышке и флаконы охлаждают под проточной водой. Затем стеклянной трубкой или пипеткой с ватным тампоном в нижней части отбирают немного сыворотки, фильтруя ее через вату.

Техника анализа на рефрактометрах типа АМ-2 или ИРФ. На измерительную призму рефрактометра наносят 1-2 капли прозрачной сыворотки. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают расплывчатость и окрашенность на границе света и тени. Снимают показания по шкале «Белок» (Х₁) Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой.

Затем на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды и также снимают показания по шкале белок (Х₂). Массовую долю лактозы (Л) в процентах находят по формуле (2.7):

Л = Х₁ -Х₂; (2.7)

где: Х₁ – показание по шкале «Белок» для сыворотки, %;

Х₂ – показание по шкале «Белок» для дистиллированной воды, %

Техника анализа на рефрактометре РЛ-2. Рефрактометр РЛ-2 имеет две шкалы: «показатель преломления» в пределах 1,33-1,54 и «содержание сухих веществ по сахарозе» до 95 %. Рефрактометр на «0» устанавливают при 20 °C. Перед работой камеры призм рефрактометра присоединяют штуцерами к ультратермостату и пропускают воду с температурой 17,5 °C в течение 1015 мин. Затем проверяют установку нуля. На нижнюю призму наносят 2 капли дистиллированной воды, закрывают верхней и устанавливают окуляр на резкость видимости по шкале и визирной линии (представляющей собой три штриха). Окуляр перемещают до совмещения визирной линии с границей светотени. Она должна совпадать с нулевым делением шкалы сухих веществ и с делением n_D=1,333.

Призмы насухо вытирают и на поверхность нижней призмы наносят 2 капли прозрачной сыворотки. Наблюдая в окуляр, вращением рукоятки устанавливают поле зрения на фокус (ясную видимость), устраняют расплывчатость и радужность окраски границы светотени. Передвижением окуляра добиваются полного совпадения граничной линии с визирным указателем и отсчитывают показатель преломления сыворотки по левой шкале рефрактометра. Затем по таблице (Приложение 2) устанавливают массовую долю молочного сахара.

2.5. Определение механической загрязненности молока 44
  ГОСТ 8218-89 «Молоко. Метод определения чистоты»


[Закрыть]

Метод основан на отделении механической примеси из дозированной пробы молока путем процеживания через фильтр и визуального сравнения наличия механической примеси на фильтре с образцом сравнения (эталоном).

Приборы и материалы. Приборы разных конструкций (типа «Рекорд» и др.) с диаметром фильтрующей поверхности 27-30 мм, ватные фильтры лабораторные, фланель (отбеленная).

Техника анализа. На сетку прибора кладут ватный или фланелевый фильтр в виде кружка и закрепляют. Пробу молока объемом 250 см³, подогретую до температуры (35±5)°С, тщательно перемешивают и пропускают через приготовленный фильтр. По окончании фильтрования фильтр помещают на лист пергамента и просушивают на воздухе. В зависимости от количества механической примеси на фильтре молоко подразделяют на три группы (таблица 2.2).

Таблица 2.2 – Определение группы чистоты молока

⁵ Цвет фильтра должен соответствовать цвету молока в соответствии с требованиями стандарта. При изменении цвета фильтра молоко, независимо от количества имеющейся на фильтре механической примеси, относят к третьей группе чистоты.

2.6. Методы определения микробной обсемененности молока 55
  ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа» ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье – сырье. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов»


[Закрыть]

Пробы для микробиологических исследований отбирают в стерильную посуду с помощью специальных приспособлений с соблюдением правил асептики. Инвентарь для отбора проб перед использованием стерилизуют фламбированием (протирание ватой, смоченной спиртом, с последующим обжиганием на огне) или в автоклаве. Стерильные колбы с пробами закрывают стерильными пробками, горлышко посуды и пробку обертывают бумагой и обвязывают. Отобранные пробы следует исследовать не позднее 4 ч с момента взятия, при условии хранения или транспортирования при температуре не выше 6 °C.

Определение бактериальной обсемененности молока может быть проведено путем непосредственного посева молока на питательную среду (чашечный метод) или по редуктазной пробе. Эта проба является косвенным показателем микробного загрязнения сырого молока. Редуктаза – фермент, выделяемый микрорганизмами. Метод основан на способности редуктазы обесцвечивать или восстанавливать индикатор – метиленовый синий или резазурин, добавленный в молоко.

Определение микробной обсемененности молока редуктазными пробами

Метод с метшеновым синим (арбитражный). По продолжительности обесцвечивания индикатора метиленовый голубой оценивают бактериальную обсемененность молока.

Приборы и реактивы. Редуктазник или водяная баня с терморегулятором, пробирки диаметром 20 мм и высотой 180 мм, пипетки вместимостью 1 и 20 см³, рабочий раствор метиленового синего (готовится из основного).

Основной раствор: 10 г метиленового синего смешивают со 100 см 96 %-ного этилового спирта. Раствор ставят в термостат при 37 °C на 24 ч, а затем фильтруют.

Рабочий раствор: к 5 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 195 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают. Срок хранения – не более 7 сут.

Техника анализа. В стерильные пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора метиленового синего и по 20 см исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с водой температурой (37 ± 1) °С. Вода после погружения пробирок должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Наблюдение за изменением окраски ведут через 40 мин, 2,5 и 3,5 ч с начала проведения анализа. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из четырех классов, указанных в таблице 2.3.

Таблица 2.3 – Определение бактериальной обсемененности и класса молока по редуктазной пробе с метиленовым синим

Метод с резазурином. По продолжительности изменения окраски индикатора резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы и реактивы. Приборы и посуда те же, рабочий раствор резазурина (готовится из основного).

Основной раствор: 100 мг резазурина растворяют в 200 см прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Срок хранения не более 20 сут. при 3-5 °C. Рабочий раствор готовят из основного разбавлением прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1: 10. Срок хранения не более 7 сут.

Техника анализа. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см исследуемого молока закрывают резиновыми пробками и смешивают, медленно трехкратно перевертывая пробирки. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 ± 1)°С. Вода после погружения пробирок должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Момент погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника и определяют окрашивание молока. Пробирки, имеющие серо-сиреневую окраску оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. В зависимости от обесцвечивания или изменения цвета, молоко относят к одному из четырех классов, указанных в таблице 2.4.

Таблица 2.4 – Определение бактериальной обсемененности и класса молока по редуктазной пробе с резазурином

⁷ Молоко, имеющее через 1,5 ч окраску, соответствующую 1 классу, относят к высшему классу.

Определение микробной обсемененности молока биолюминесцентным методом

Метод основан на растворении соматических клеток, белка и жира молока АТФ-реагентом; фильтровании полученного образца через бактериальный мембранный фильтр; растворении отфильтрованных микроорганизмов реагентом на основе диметилсульфоксида; расчете концентрации АТФ микроорганизмов в полученном растворе по его биолюминесценции и определении количества микроорганизмов в 1 см³ молока.

Приборы и реактивы: люминометр, обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм; люминонометрическая кювета (типа фильтраветы); штатив для фильтравет; шприц медицинский вместимостью 5 см³; наконечник резиновый к медицинскому шприцу; фильтровальная бумага; пипетки автоматические вместимостью 0,02 см³, 0,1 см³ и 1 см³; наконечники к автоматическим пипеткам стерильные; баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45 ± 1)^oC. Реагенты: флакон № 1 – АТФ-реагент ЛЮМТЕК, лиофильно высушенный; флакон № 2 – раствор для реконструкции АТФ-реагента; флакон № 3 – АТФ-контроль, лиофилизованный; флакон № 4 – реагент для разрушения бактериальных клеток, раствор; флакон № 5 – реагент для предобработки молока, лиофилизованный; флакон № 6 – промывочный раствор. Внимание! Реагенты следует хранить в холодильнике при температуре от 0 до 6 °C.

Для получения воспроизводимых результатов анализа молока необходимо соблюдать меры предосторожности, принятые при работе в микробиологической лаборатории, в частности: перед проведением анализа поверхность лабораторного стола обработать 70 % этанолом; использовать автоматические пипетки и стерильные наконечники к ним; для выполнения каждой операции использовать новый стерильный наконечник; после анализа каждого образца молока штативы для фильтравет, фланцевый наконечник шприца, пинцет и автоматические пипетки стерилизовать 70 % этанолом.

Подготовка реагентов к анализу. Во флакон № 1 внести 2 мл раствора из флакона № 2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4 °C – в течение 2-3 дней.

Во флакон № 3 внести 1 мл раствора из флакона № 4, перемешать. Полученный раствор АТФ контроля имеет концентрацию АТФ 10 пикомоль/мл. Полученный раствор следует использовать в течение одного рабочего дня.

Проверка АТФ-реагента по АТФ-контролю. Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. Внести в нее 0,02 мл раствора АТФ-контроля из флакона №З и 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемешать, добавить 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить биолюминесцентный сигнал. Повторить измерения еще раз и найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля (/коямр). Если измеренные значения различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Техника анализа. Образец анализируемого молока объемом 50 мл довести до комнатной температуры и тщательно перемешать. Внести 1 мл молока во флакон № 5 с реагентом для предобработки молока и тщательно перемешать. Закрыть флакон, поместить его в водяную баню (45 ± 0,5)^оС на 10 мин. Поместить в штатив для фильтравет с помощью пинцета фильтровальную полоску и установить на неё две фильтраветы.

Внести в одну фильтравету 0,2 мл предобработанного молока и продавить его на фильтровальную бумагу, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Сдвинуть фильтровальную полоску так, чтобы под фильтраветой оказался сухой участок полоски. Внести в ту же фильтравету две капли промывочного раствора из флакона № 6 и продавить его в фильтровальную полоску, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником.

Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра и внести в нее 0,02 мл раствора из флакона № 4. Добавить через 1-2 мин в ту же фильтравету 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемещать, затем добавить 0,05 мл АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить максимальный биолюминесцентный сигнал (I_М0Л).

Повторить операции со второй фильтраветой. Найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для образца молока (I_М0Л). Если измеренные значения (I различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.

Рассчитать концентрацию АТФ в молоке по формуле (2.8):

Определить величину КМАФАнМ по таблице 2.5, приведенной ниже.

Таблица 2.5 – Определение КМАФАнМ в сыром молоке биолюминесцентным методом

2.7. Методы определения кислотности молока 66
  ГОСТ 3624-92 «Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности», ГОСТ 26781-85 «Молоко. Метод измерения рН


[Закрыть]

Кислотность молока выражается общей (титруемой) и активной (концентрацией водородных ионов).

– Титруемая кислотность обусловлена содержанием в молоке белков, кислых солей и растворенные газы. Титруемая кислотность определяется в градусах Тернера (°Т). Под градусами Тернера понимают количество миллилитров 0,1 н раствора гидроксида натрия, которое расходуется на нейтрализацию (титрование) 100 см³ молока, разбавленного водой. Один градус Тернера соответствует 0,009 % молочной кислоты.

Кислотность свежего молока равна 16-18°Т. На белки приходится 45°Т, на кислые соли – 11-13°Т, на СО₂ и органические кислоты – 1-3°Т.

Титруемая кислотность молока зависит от кормового рациона, породы, возраста, периода лактации, состояния здоровья и ряда других факторов.

– Активная кислотность характеризуется концентрацией свободных водородных ионов, выражается величиной рН и численно равна отрицательному десятичному логарифму концентрации водородных ионов (Н+). Величина рН цельного молока составляет в среднем 6,7. Она зависит от температуры, а также от жизнедеятельности присутствующих в молоке бактерий.

Молоко, содержащее слабые кислоты, соли, белки, диоксид углерода и другие компоненты является буферной системой, сохраняющей определенный рН при добавлении небольших количеств кислоты или щелочи, то есть молоко обладает определенной буферной емкостью.

По отношению к кислоте молоко обладает значительно большей буферной емкостью, чем по отношению к щелочи. Низкая буферная емкость при рН 8,3 используется в методе определения титруемой кислотности с индикатором фенолфталеином.

Техника определения титруемой кислотности молока

Метод заключается в титровании кислых солей, белков, органических кислот раствором щелочи в присутствии фенолфталеина.

Приборы и реактивы. Бюретка стеклянная на 25-50 см³, пипетки вместимостью 1, 10 и 20 см³, колбы конические на 150-200 см³, капельница для индикатора. Раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм³, 1 %-ный спиртовой раствор фенолфталеина, пентагидрат сульфата кобальта (CoSO₄ • 5 H₂O) – раствор с массовой концентрацией сульфата кобальта 25 г/дм³, вода дистиллированная.

Для приготовления эталона окраски в колбу для титрования отмеривают пипеткой 10 см³ молока, 20 см³ воды и 1 см³ раствора сульфата кобальта. Эталон пригоден для работы в течение 8 ч при комнатной температуре.

Техника анализа. В коническую колбу вместимостью 150-200 см³ отмеривают пипеткой 10 см³ молока, 20 см³ воды, 3 капли фенолфталеина, смесь тщательно перемешивают и титруют 0,1 н раствором гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин.

Кислотность молока в °Т равна количеству (в см³) гидроксида натрия, пошедшего на титрование, умноженному на 10. Расхождение между параллельными определениями должно быть не более 1°Т.

Потенциометрическое определение рН молока

Приборы и реактивы. Анализатор потенциометрический для контроля рН молока, стаканы химические вместимостью 50 см³, стандартные буферные растворы для рН-метрии, вода дистиллированная, бумага фильтровальная лабораторная.

Техника анализа. Прибор включают в сеть за 10-15 мин до начала работы и проверяют его по буферным растворам. Для шкалы рН от 6 до 7 прибор настраивают по буферным растворам с величиной рН 6,88 и 4,00 при температуре раствора (20 ± 2)°С. Перед проверкой прибора электроды тщательно промывают дистиллированной водой, остатки воды с электродов удаляют с помощью фильтровальной бумаги.

В стеклянный стакан вместимостью 50-100 см³ наливают (40 ± 5) см³ буферного раствора, погружают в него электроды и через 10-15 с снимают показания прибора. Если показания прибора отличаются от значения рН буферного раствора более чем на 0,05, то прибор настраивают посредством регулятора (описание настройки в паспорте прибора). Проверка прибора по стандартному буферному раствору проводится ежедневно.

В стакан вместимостью 50-100 см³ наливают (40 ± 5) см³ молока и в него погружают электроды прибора, они не должны касаться стенок и дна стакана. Показания прибора снимают через 10-15 с после остановки стрелки. После окончания измерения электроды тщательно промывают и помещают в стакан с дистиллированной водой. При массовых измерениях рН молока остатки предыдущей пробы перед измерением рН следующей пробы удаляют с электродов путем легкого кругового помешивания, а промывают электроды дистиллированной водой через каждые 3-5 измерений. Для перевода величины рН в усредненные соотношения между рН и титруемой кислотностью молока используют данные, приведенные в таблице 2.6.

Таблица 2.6 – Усредненные соотношения между рН и титруемой кислотностью сырого молока

2.8. Методы определения технологических свойств молока 97
  ГОСТ 25228-82 «Молоко и сливки. Метод определения термоустойчивости по алкогольной пробе»


[Закрыть]

К основным технологическим свойствам молока относят термоустойчивость (термостабильность) и сычужную свертываемость.

Молоко, полученное от здоровых животных, обладает термоустойчивостью – способностью при высоких температурах сохранять первоначальные свойства. Оно обладает стойкостью при нагревании до 100 °C в течение нескольких десятков минут. Термоустойчивость молока зависит, в основном, от устойчивости казеиновых мицелл. Основными факторами стабильности белковых молекул в растворе, как известно, являются величина поверхностного заряда и их степень гидрофильности. Следовательно, факторы, уменьшающие отрицательный заряд казеиновых мицелл и степень их гидратации, будут снижать термоустойчивость молока. К ним относятся изменение белково-солевого состава и рН молока.

Под сычужной свертываемостью молока понимают способность его белков коагулировать под действием внесенного сычужного фермента с образованием относительно плотного сгустка. Способность молока к сычужной свертываемости определяется в первую очередь содержанием в нем казеина и солей кальция – чем оно больше, тем выше скорость свертывания молока и плотность образующихся белковых сгустков, и наоборот.

Определение термоустойчивости молока

Метод основан на воздействии этилового спирта на белки молока и сливок, которые полностью или частично денатурируются при смешивании равных объемов молока или сливок со спиртом.

Приборы и реактивы. Ареометры для спирта, цилиндры мерные, стаканы химические вместимостью 50 и 100 см³, чашки Петри, пипетки вместимостью 2 см³, баня водяная, термометр стеклянный ртутный, спирт этиловый ректификованный или спирт этиловый синтетический технический, вода дистиллированная.

Подготовка к проведению анализа. Термоустойчивость по алкогольной пробе определяют при помощи водного раствора этилового спирта с объемной долей алкоголя 68,70,72, 75 и 80 %. Концентрацию приготовленных водных растворов этилового спирта проверяют по плотности с помощью ареометра. Плотность используемых для алкогольной пробы спиртов при 20 °C должна быть равна: 0,8904 г/см³ для 68 %-ного спирта; 0,8855 г/см³ для 70%ного спирта; 0,8805 г/см³ для 72 %-ного спирта; 0,8728 г/см³ для 75 %-ного спирта; 0,8593 г/см³ для 80 %-ного спирта.

Молоко и сливки для определения термоустойчивости исследуют при температуре (20 ± 2)°С.

Техника анализа. В чистую чашку Петри наливают 2 см³ исследуемого молока или сливок, приливают 2 см³ этилового спирта требуемой концентрации. Смесь тщательно перемешивают круговыми движениями. Спустя 2 мин, наблюдают за изменением консистенции исследуемого сырья. Если на дне чашки Петри при стекании испытуемых молока или сливок не появились хлопья, считается, что они выдержали алкогольную пробу.

В зависимости от того, какой концентрации раствор этилового спирта не вызвал осаждения хлопьев в испытуемом молоке и сливках, их подразделяют на группы, указанные в таблице 2.7.

Таблица 2.7 – Определение группы термоустойчивости молока