Читать книгу "Интерпретация результатов лабораторных исследований"

Выявление мутаций в гене kras методом масс–спектрометрии (Главацкая А.А., Куклина Н.Г., Шипулин Г.А.)

ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России

Glavatskaya A. A., Kuklina N. G., Shipulin G. A.

DETECTION OF MUTATIONS IN KRAS GENE USING MASS SPECTROMETRY

Ген KRAS является членом семейства RAS и представляет собой классический и наиболее часто мутирующий онкоген у человека. Мутации этого гена встречаются в более чем 30% случаев колоректального рака, а также при аденокарциноме легких, раке поджелудочной железы и других. Активирующие мутации гена KRAS приводят к последовательной активации пути RAS-RAF и действуют как предикторы устойчивости к терапии ингибиторами EGFR [2, 3]. В связи с этим анализ наличия и спектра мутаций в гене KRAS является необходимым при назначении лекарственной терапии таргетными препаратами. Для оценки мутационного статуса применяются следующие методы: различные варианты ПЦР в реальном времени, секвенирование по Сэнгеру и масс-спектрометрия с матричной лазерной ионизацией.

Цель: разработка и апробирование на контрольных образцах мультиплексной панели для выявления мутаций в гене KRAS методом масс-спектрометрии.

Отобраны 30 мутаций в гене KRAS (2,3,4 экзон) на основе Клинических рекомендаций «Рак прямой кишки» и «ЗНО ободочной кишки». Дизайн олигонуклеотидов осуществляли с помощью программного обеспечения Assay Design Suite, доступного в он-лайн режиме на сайте www.agenabio.com («Agena Bioscience», США). Процедуру подготовки аналитов, включающую в себя три этапа: мультиплексная ПЦР, SAP-реакция и реакция удлинения iPlex, проводили с помощью реагентов «PCR Reagent Set, medium» («Agena Bioscience», США). В качестве объектов исследования использовали образцы геномной ДНК U-937, экстрагированную из клеток диффузной гистиоцитарной лимфомы (Sibenzyme, Россия), с концентрацией 5 нг/мкл. Контрольные образцы мутаций гена KRAS были синтезированы путем сайт-направленного мутагенеза на основе ПЦР. Из них были приготовлены смешанные образцы с относительной чувствительностью – 50%, 5%, 1%, 0,1%. Мультиплексное генотипирование проводили на автоматизированном генетическом анализаторе MassArray («Agena Bioscience», США). Для анализа масс-спектров в реальном времени, а также для первичной обработки и документирования результатов опыта использовали программное обеспечение «MassArray Typer 4.0» («Agena Bioscience», США).

В ходе экспериментов, проведенных на геномной ДНК U-937 дикого типа с концентрацией 5 нг/мкл, были получены одиночные пики, соответствующие массам пиков нормального аллеля, что говорит о высоком уровне специфичности системы. При анализе смешанных контрольных образцов, состоящих из мутантных клонов и геномной ДНК U-937, были получены по два пика, соответствующие пику нормального аллеля и пику мутантного аллеля. Наличие пиков в образцах с относительной чувствительностью равной 0,1% говорит о высоком уровне чувствительности.

Заключение. Разработанная система позволяет детектировать мутации с низкой концентрацией. Высокая степень мультиплексирования позволяет за короткое время провести анализ выбранных SNP. В дальнейшем планируется валидация данной системы на клинических образцах.

Направления деятельности кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом лабораторной иммунологии рманпо в условиях индустриализации лабораторной службы (Годков М.А., Долгов В.В.)

РМАНПО Минздрава России, г. Москва

Godkov M. A., Dolgov V. V.

DIRECTIONS OF ACTIVITY OF THE DEPARTMENT OF CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS WITH A COURSE OF LABORATORY IMMUNOLOGY IN CONDITIONS OF INDUSTRIALIZATION OF LABORATORY SERVICES

Централизация, цифровизация, применение высокотехнологических лабораторных поточных систем вытесняют ручной труд при скрининговых лабораторных исследованиях, результаты которых используются при диспансеризации, первичном приеме у врача, госпитализации.

Цель: определить задачи кафедры последипломной подготовки специалистов в меняющихся условиях функционирования лабораторной службы.

Государственная политика в области здравоохранения строится на бесплатной медицинской помощи в рамках госгарантий, которые, в свою очередь, увязаны с клиническими рекомендациями, стандартами и протоколами оказания медицинской помощи по разным клиническим направлениям. Лабораторной диагностике, как и другим диагностическим специальностям, отводится роль междисциплинарной деятельности. Компетенции специалистов лабораторной службы определяются профессиональным стандартом «Специалист в области клинической лабораторной диагностики» (приказ Минтруда РФ от 14 марта 2018 г. № 145н). Этим приказом регламентируется деятельность специалистов клинической лабораторной диагностики с высшим медицинским и немедицинским образованием, которая разнится в том, что врачи клинической лабораторной диагностики должны консультировать врачей других специальностей и пациентов по вопросам лабораторных исследований, а биологам медицинских лабораторий эта обязанность не вменяется. Кафедра КЛД РМАНПО корреспондирует свою деятельность на основе вышеизложенных положений.

Подготовка врачей и биологов для лабораторной службы строится по отдельным учебным программам, сходным в части аналитической компоненты и разным по интерпретации результатов. При первичной профессиональной переподготовке очно всем курсантам с медицинским и немедицинским образованием дается информация по аналитическим характеристикам методов лабораторного исследования и материалы для формирования лабораторного заключения, для врачей клинической лабораторной диагностики дополнительно предоставляется клиническая интерпретация, часто с привлечением врачей клинических специальностей. При повышении квалификации и врачам, и биологам информация может доводиться в дистанционном формате, обучение ведется по разным программам.

Бюджетные плановые циклы строятся на основе квалификационных требований профессионального стандарта, что закреплено в соответствующих учебных программах и заложено в финансово-экономических планах работы РМАНПО и учебных планах кафедры. Внебюджетные циклы проводятся кафедрой по технологиям, выходящим за рамки госгарантий, представлены высокотехнологичными лабораторными исследованиями, например: «Цитологическое исследование при патологии шейки матки», «Менеджмент лабораторных процессов в меняющихся условиях», «Лабораторные исследования системы гемостаза», «Проточная цитометрия в онкогематологии» и другие.

Лечебная деятельность сотрудников кафедры является залогом неразрывной связи с профессиональным сообществом. В настоящее время многие преподаватели совмещают работу на кафедре с работой в КДЛ разных медицинских организаций. В планах кафедры – создать производственную учебно-диагностическую лабораторию, на базе которой будут проводиться: практическая подготовка ординаторов, научно-исследовательская работа аспирантов и соискателей, производственная работа под патронажем профессорско-преподавательского коллектива кафедры.

Общественная деятельность преподавателей кафедры обширна, включает работу в профессиональных общественных организациях, диссертационных советах, комиссиях по аккредитации и аттестации, редакциях журналов, организацию конференций и школ по конкретным направлениям профессиональной деятельности. Кафедра старается отвечать на запросы специальности, готовя атласы, руководства, учебные пособия.

Заключение. Разносторонняя профессиональная деятельность позволяет кафедре КЛД РМАНПО быть востребованной в динамически меняющихся условиях модернизации здравоохранения и индустриализации лабораторной службы.

Особенности интерпретации профилей оксилипинов в биологических жидкостях как маркеров воспалительных состояний (Горбатенко В.О., Сергеева М.Г., Чистяков Д.В.)

Горбатенко В.О.¹, Сергеева М. Г.², Чистяков Д. В.²

¹ Факультет Биоинженерии и Биоинформатики, МГУ им. М. В. Ломоносова

² Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова, г. Москва

Gorbatenko V. O., Sergeeva M. G., Chistyakov D. V.

INTERPRETATION FEATURES OF OXYLIPIN PROFILES IN BIOLOGICAL FLUIDS AS MARKERS OF INFLAMMATORY CONDITIONS

Цель: разработка новых платформ к анализу и интерпретации данных инструментального анализа и омиксных технологий.

Проведен анализ количественных данных профилей оксилипинов, получаемых методом ВЭЖХ–МС/МС. Оксилипины (более 200 идентифицированных соединений) – биологически активные вещества, которые образуются при оксигенировании полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Комплексный профиль оксилипинов рассматривается как перспективные маркеры онкологических состояний, неврологических нарушений и системных заболеваний с воспалительной компонентой. ПНЖК метаболизируются до оксилипинов по разным полиферментным каскадам: циклооксигеназная ветвь (COX), липоксигеназная ветвь (LOX), эпоксигеназная ветвь (CYP) метаболизма оксилипинов, дополнительно выделяют превращение ПНЖК по анандамидному пути и неферментативный путь окисления. Наиболее изученными соединениями в контексте заболеваний являются такие производные С20:4ω-6 арахидоновой кислоты, как эйкозаноиды (простагландины, тромбоксаны, лейкотриены), производные С22:6ω-3 докозагексаеновой, С20:5ω-3 эйкозапентаеновой, С18:2ω-6 линолевой кислоты. Обычная статистическая обработка профилей оксилипинов может не давать полной картины изменения в биохимических путях при исследуемых состояниях. Эффекты оксилипинов могут суммироваться, достигая значимых результатов при незначительном изменении каждого отдельного соединения. Мы предлагаем методологию оценки изменения профилей оксилипинов, основанную на трех подходах:

1) суммирование концентрации метаболитов по их кислотам-предшественникам, что позволяет оценивать влияние поступающих извне ПНЖК;

2) суммирование концентрации метаболитов по ключевым ферментам их биосинтеза (COX, LOX, CYP, AEA, неферментативный), что позволяет оценивать активацию или ингибирование отдельных биохимических путей, и предлагать их как мишени действия лекарственных средств при соответствующих патологиях;

3) суммирование концентраций метаболитов, сгруппированных их функциональным свойствам, такой анализ соотношения про– и анти-воспалительных липидных медиаторов позволяет получить информацию о смещении состояния организма в сторону разрешения, или активации воспаления.

В клиническом исследовании пациентов с болезнью Паркинсона (БП) (73 пациентов с различными стадиями заболевания и 36 здоровых контролей), предложенный подход к анализу данных позволил выявить активацию СОХ-пути биосинтеза оксилипинов у пациентов с поздними стадиями БП (3–4 по шкале Хен и Яра), что показывает перспективность дополнительной терапии данных пациентов ингибиторами СОХ. В рамках исследования действия лекарственных средств (на примере метформина) в клеточных моделях нейровоспаления на первичных астроцитах крысы показано, что метформин способен эффективно ингибировать COX-путь и активировать LOX-путь биосинтеза оксилипинов, что открывает возможность нового направления регуляции клеточного ответа.

Заключение. Комплексная методология оценки изменения профилей оксилипинов позволяет улучшить интерпретацию получаемых данных и повысить эффективность поиска биомаркеров заболеваний, оценки действия лекарственных средств и изучения молекулярных механизмов патологий.

Цитохимическое исследование миелопероксидазы в диагностике острых лейкозов (Горбачева Д.В., Ярец Ю.И.)

Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека», г. Гомель, Республика Беларусь

Harbachova D. V., Yarets Yu. I.

CYTOCHEMICAL STUDY OF MYELOPEROXIDASE IN THE DIAGNOSIS OF ACUTE LEUKEMIA

Миелопероксидаза (МПО) выявляется в клетках гранулоцитарного ряда в азурофильных гранулах, начиная с миелобласта. По мере созревания клеток активность фермента возрастает, в нейтрофилах выявляется наиболее высокая активность в виде гранул, заполняющих всю цитоплазму. Слабоположительная реакция на МПО наблюдается в небольшом количестве моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах, базофилах и мегакариоцитах МПО не определяется. Положительная реакция на миелопероксидазу характерна для острых миелоидных лейкозов. При М1 более 3% бластов обнаруживают активность МПО. При М2 количество бластных клеток, содержащих МПО, возрастает и может достигать 100% при М3. При острых лимфобластных лейкозах реакция на МПО является отрицательной.

Цель: определить вид острого лейкоза по наличию или отсутствию миелопероксидазы в бластных клетках у первичных пациентов с острыми лейкозами, направленных на обследование в ГУ «РНПЦ РМиЭЧ» в 2023 году.

Обследовано 42 пациента (возраст 13–70 лет) с острыми лейкозами (наличие бластных клеток в костном мозге более 20%, увеличение селезенки, лимфатических узлов). Материалом для исследования являлся аспират костного мозга, полученный с ЭДТА. Из образцов костного мозга были сделаны мазки. Принцип цитохимического метода определения миелопероксидазы основан на окислении бензидина в присутствии перекиси водорода в окрашенное нерастворимое соединение желтого цвета. Лабораторные исследования выполняли в клинико-диагностической лаборатории ГУ «РНПЦ РМиЭЧ».

У 27 пациентов с острым лейкозом была выявлена МПО в бластных клетках цитохимическим методом: бластные клетки окрасились в желтый цвет. Процент положительно окрашенных бластов составлял от 11% до 100% клеток, что говорит о наличии у этих пациентов острого миелобластного лейкоза. У 15 пациентов цвет бластов после окрашивания на МПО не изменился, что соответствует отрицательной реакции и острому лимфобластному лейкозу. Таким образом, частота впервые выявленых случаев острого миелобластного лейкоза с использованием цитохимического метода среди всей выборки пациентов (n=42) составила 64%, а острого лимфобластного лейкоза – 36%. Данные цитохимического исследования были подтверждены методом иммунофенотипирования – в образцах, положительных на миелопероксидазу были выявлены миелоидные маркеры, такие как CD33, CD117, CD13, миелопероксидаза. В отрицательных образцах выявлены лимфоидные маркеры, такие как CD19, CD20, CD22.

Заключение. Цитохимические исследования опухолевых клеток занимают важное место в дифференциальной диагностике гемобластозов. Они используются для установления варианта острого лейкоза и выявления особенностей метаболизма лейкозных клеток. Цитохимическая реакция определения МПО должна проводиться для первичной диагностики острых лейкозов.

Сывороточные уровни адипоцитокинов у пациентов с ранним ревматоидным артритом на фоне противоревматической терапии (Горбунова Ю.Н., Попкова Т.В., Авдеева А.С.)

ФГБНУ НИИР имени В. А. Насоновой, Москва, Россия

Gorbunova Yu. N., Popkova T. V., Avdeeva A. S.

SERUM LEVELS OF ADIPOCYTOKINES IN PATIENTS WITH EARLY RHEUMATOID ARTHRITIS ON THE BACKGROUND OF ANTIRHEUMATIC THERAPY

Жировая ткань рассматривается как высокоактивный эндокринный орган, продуцирующий большое количество различных адипоцитокинов (АЦК) (адипонектин, лептин, резистин, висфатин и др.), участвующих в патогенезе РА. Влияние противоревматической терапии на провоспалительные (лептин, резистин, висфатин) и противовоспалительные (адипонектин) адипоцитокины при РА неоднозначно.

Цель: оценить динамику АЦК (адипонектин, лептин, резистин, висфатин) в сыворотке крови больных ранним РА исходно и через 24 недели противоревматической терапии, сравнить исходные уровни АЦК в зависимости от достигнутой активности РА к 24 недели терапии.

Обследовано 47 пациентов с ранним РА (критерии ACR/EULAR, 2010), не получавших ранее противоревматическую терапию (ГК и БПВП), медиана возраста (25–75 процентиль) – 57 [46,5; 62,0] лет, продолжительность заболевания – 6,0 [5,5; 15,5] месяцев, серопозитивных по IgM РФ (87%) и АЦЦП (100%), с высокой активностью РА (DAS28 5,5 [5,1; 5,9] баллов). После включения в исследование все пациенты получали метотрексат (MT) (10 [10–15] мг/1 раз в неделю), через 12 недель при неэффективности МТ дополнительно назначался генно-инженерный биологический препарат (ГИБП): ингибитор-ФНО-α, адалимумаб 40 мг 1 раз в 2 недели. Концентрацию адипоцитокинов определяли иммуноферментным анализом (BioVendor, Brno, Czech Republic).

В целом по группе (n = 47) через 24 недели противоревматической терапии, сывороточный уровень адипонектина снижался на 47%, лептина и резистина увеличивался на 53% и 62% соответственно (р < 0,05 во всех случаях). Концентрация висфатина в сыворотке больных РА через 24 недели терапии повышалась на 37% статистически незначимо (р = 0,2) (таблица 1).

Таблица 1

Динамика АЦК у больных ранним РА исходно и через 24 недели терапии

Примечание: * – различия между группами достоверны с p < 0,05; ∆, % – разность показателей через 24 нед.

В зависимости от достигнутой к 24-й недели терапии активности РА пациенты разделены на две группы: 1-я группа – с ремиссией/низкой активностью (n=24), 2-я группа – с умеренной/высокой активностью (n=23). У пациентов, достигших ремиссии/низкой активности РА к 24 недели комбинированной терапии исходное значение уровня лептина в сыворотке крови было достоверно ниже, чем у пациентов с сохраняющейся, несмотря на лечение, умеренной/высокой активностью заболевания (11,9 [5,1; 24,0] нг/мл против 27,0 [15,0;44,0] нг/мл, соответственно, p<0,05). Различий по уровню других адипоцитокинов получено не было (таблица 2).

Таблица 2

Исходные уровни адипоцитокинов, в зависимости от достигнутой активности РА к 24 недели терапии

Примечание: * – р<0,05 различия исходных значений в I и II группах (критерий Манна–Уитни.

Заключение. Через 24 недели эффективной противоревматической терапии сывороточный уровень адипонектина снижался, лептина и резистина увеличивался. Исходное значение уровня лептина в сыворотке крови у пациентов, достигших ремиссии/низкой активности РА к 24 недели комбинированной терапии было достоверно ниже, чем у пациентов с сохраняющейся активностью заболевания. Повышенный уровень лептина у пациентов с умеренной/высокой активностью РА, позволяет рассматривать его в качестве маркера не только метаболических нарушений, но и ревматоидного воспаления. При проведении противоревматической терапии необходим тщательный мониторинг метаболических нарушений (показателей липидного, углеводного и жирового обмена).

ANTI-HBc маркер вирусного гепатита у HBsAg-негативных доноров крови разных возрастов (Гринвальд Е.Н., Савчук Т.Н., Имашпаев Д.М., Абдрахманова С.А.)

РГП на ПХВ «Научно-производственный центр трансфузиологии» МЗ РК, г. Астана, Казахстан

Grinvald E. N., Savchuk T. N., Imashpayev D. M., Abdrakhmanova S. A.

ANTI-HBC MARKER OF VIRAL HEPATITIS IN HBSAG – NEGATIVE BLOOD DONORS OF DIFFERENT AGES

Достоверным признаком перенесенного вирусного гепатита В является наличие в крови антител к HBcAg вируса – anti-HBc. Данные антитела в организме появляются в ответ на внедрение вируса через некоторое время и сохраняются пожизненно, наличие анти-HBc является верным доказательством контакта организма с вирусом. Поэтому скрытое течение вирусной инфекции, возможное сохранение персистенции в гепатоцитах пациента, который перенес ВГВ, создает потенциальную опасность передачи вируса через гемотрансфузии, трансплантацию органов и гемодиализ. На базе Научно-производственного центра трансфузиологии (далее – НПЦТ) проводилось исследование по тестированию доноров г. Астаны на anti-HBc. По результатам исследования было принято решение об обязательном скрининге доноров на маркер anti-HBc.

Цель: анализ распространенности маркера anti-HBc в разных возрастных группах доноров крови.

Лабораторные исследования выполнялись методом иммунохемилюминесцентного анализа (ИХЛА) на анализаторе Architect i2000SR, Alinity i (АВВОТТ). Данные для статистического анализа получены из информационной системы «Infodonor».

За 2023 г. на anti-HBc было протестировано 43 169 HBsAg-негативных доноров. Антитела к ядерному антигену (anti-HBc) выявлены у 6086 (14,1%) доноров, отрицательных на поверхностный антиген ВГВ (HBsAg). Распространенность маркера anti-HBc в разных возрастных категориях доноров крови представлена в таблице. Отмечается большая разница по распространенности маркера у доноров более старшего возраста по сравнению с молодыми донорами. Маркер ВГВ (anti-HBc) встречается более чем у 36,5% доноров в возрасте 64–73 года и у 0,8% доноров в возрасте 18–23 года. Следует отметить, что в Республике Казахстан обязательная вакцинация против ВГВ всех новорожденных началась в 1998 г. Кроме того, молодые доноры по сравнению с более старшими в течение жизни получали меньше инвазивных процедур и имели меньше контактов, которые могли привести к инфицированию вирусным гепатитом В (таблица).

Распространенность маркера anti-HBc среди доноров в зависимости от возраста

Заключение. Распространенность anti-HBc среди доноров старшего возраста значительно больше, чем у молодых, получивших вакцину против ВГВ, что подтверждает о предпочтительном привлечении в ряды доноров молодых людей от 25 лет и моложе.