Текст книги "Медицинская микробиология, иммунология и вирусология"

Глава 31
Приобретенный иммунитет. Формы иммунного ответа. Антитела

Возможны следующие формы иммунного ответа на проникновение антигена в организм: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция гиперчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замедленного типа (в том числе трансплантационный иммунитет), иммунологическая толерантность, идиотип-антиидиотипические отношения.

Антитела являются уникальными сывороточными белками – глобулинами, которые вырабатываются в ответ на поступление в организм антигена и способны с ним специфически взаимодействовать. При электрофорезе сыворотки антитела мигрируют в составе γ-глобулинов, поэтому ранее их называли гамма-глобулинами. В соответствии с международной классификацией, ныне совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами и обозначают символом Ig.

Уникальность антител заключается в том, что они способны взаимодействовать только с тем антигеном, который индуцировал их образование. Практически антитела могут быть получены к любому антигену. Число возможных специфичностей антител, вероятно, составляет не менее 10⁹.

Важная роль антител в формировании иммунитета и их исключительная специфичность стимулировали огромный интерес к изучению молекулярной структуры иммуноглобулинов, без этого было просто невозможно понять природу антител. В результате было установлено, что существует пять различных классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Они различаются по молекулярной массе, содержанию углеводов, составу полипептидных цепей, коэффициентам седиментации и другим характеристикам (табл. 12).

Основная структурная единица молекулы иммуноглобулина состоит из двух идентичных полипептидных L-цепей (англ. light – легкий) и двух идентичных H-цепей (англ. heavy – тяжелый). Эти четыре цепи ковалентно связаны дисульфидными связями. Молекулярная масса легких цепей составляет около 23 кД, и они состоят примерно из 214 – 220 аминокислотных остатков. Существуют легкие цепи двух типов, один из них обозначается греческой буквой каппа (χ), а другой – лямбда (λ). Соотношение каппа/лямбда у человека равно 70: 30. Каппа– и лямбда-цепи обладают одинаковой способностью связываться с любой тяжелой цепью.

Таблица 12

Свойства классов иммуноглобулинов человека (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Молекулярная масса тяжелых цепей варьирует в пределах 50 – 73 кД. Идентифицировано пять классов тяжелых цепей, их обозначают греческими буквами: альфа (α), гамма (γ), эпсилон (ε), мю (μ) и дельта (δ). Соответственно обозначению тяжелой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов. У человека класс IgG в соответствии с подклассами гамма-цепи (γ1, γ2, γ3 и γ4) делится на 4 подкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Класс IgA делится на 2 подкласса: IgA1 и IgA2, в соответствии с двумя подклассами альфа-цепи (α1 и α2).

На тяжелых цепях в зависимости от класса иммуноглобулинов может быть различное число углеводных остатков.

Крупным шагом на пути выяснения структуры молекулы антитела явились опыты Р. Портера и Г. Эдельмана. Р. Портер показал, что при обработке папаином молекула IgG распадается на 3 фрагмента (рис. 64). Два из них оказались одинаковыми;

каждый из них имел молекулярную массу около 45 кД и состоял из легкой цепи и половины тяжелой цепи и обладал способностью соединяться с антигеном. Поэтому эти два фрагмента обозначены как F(ab)1 и F(ab)2, т. е. фрагменты, связывающие антитела (англ. antigen binding). При этом каждый из них обладал только одним активным центром и поэтому связывание с антигеном не сопровождалось образованием крупных конгломератов. Таким образом было установлено, что Fab-фрагменты определяют антительную специфичность иммуноглобулина. Третий фрагмент имел молекулярную массу около 55 кД и состоял из других половин H-цепей. В связи с тем, что он характеризовался постоянством аминокислотного состава, его обозначили как Fc-фрагмент (англ. constant – постоянный). Fc-фрагмент не обладает способностью связывать антиген, но определяет ряд других важных видов биологической активности, необходимых для полного проявления всех функций антител. С Fc-фрагментом связана способность антител проходить через плаценту, усиливать фагоцитоз, нейтрализовать вирусы, связывать комплемент, фиксироваться на клетках кожи и пр.

Г. Эдельман для разрушения дисульфидных связей в молекулах антител обрабатывал их меркаптоэтанолом в концентрированном растворе мочевины. Это приводило к распаду молекул антител на две пары полипептидных цепей. Оказалось, что в полной мере активностью антител не обладает ни одна из цепей. Активные центры антител образуются только при совместном участии N-концевых половин тяжелой и легкой полипептидных цепей. Специфичность же активного центра определяется первичной структурой той и другой полипептидной цепи, т. е. генетически предопределена. Это подтверждается следующим опытом. Если поместить IgG в концентрированный раствор гуанидинхлорида, то это приведет к полному развертыванию полипептидных цепей из-за разрушения вторичной и третичной структуры и к утрате антительных свойств. Однако после длительного диализа и удаления таким путем гуанидинхлорида иммуноглобулин вновь приобретает первоначальную структуру и восстанавливает антительную активность.

Для выяснения природы специфичности антител большое значение имело изучение аминокислотной последовательности L– и Н-цепей. Как было установлено, все легкие цепи состоят из двух почти равных областей, по 110 – 112 аминокислотных остатков каждая. Первые 110 аминокислотных остатков очень изменчивы, т. е. составляют вариабельную (V) область, а остальные 110 остатков у данного вида всегда постоянны, составляя константную (C) область L-цепи. Тяжелая цепь также состоит из вариабельной области (V_H), включающей около 110 аминокислотных остатков, и константной части (C_H), на долю которой у молекул IgG приходится около 330 аминокислотных остатков. При более детальном исследовании аминокислотного состава в вариабельных участках L– и Н-цепей установлено наличие в них основных каркасных последовательностей и трех (у L-цепи) и четырех (у Н-цепи) коротких гипервариабельных участков:

у L-цепи – 24 – 34; 50 – 56; 89 – 97;

у Н-цепи – 31 – 37; 51 – 68; 84 – 91; 101 – 110.

Каркасная последовательность состоит из четырех постоянных участков, которые определяют аллотип цепей. Гипервариабельные последовательности определяют структуру активного центра. Он представляет собой своеобразную щель, которая обладает структурной дополнительностью к детерминантной группе «своего» антигена. Антитело только тогда свяжет соответствующий антиген, когда его детерминантная группа полностью вместится в щель активного центра, подобно тому, как ключ полностью входит в замочную скважину. Поскольку активный центр для каждого возможного антигена предопределен первичной структурой L– и Н-цепей, это обстоятельство свидетельствует об уникальном механизме генетического контроля биосинтеза антител. Легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов состоят из отдельных блоков – доменов (см. рис. 64). Каждый домен – это пептид, образованный из 100 – 110 аминокислотных остатков и содержащий одну внутрицепочечную петлю, которая возникает вследствие замыкания дисульфидного мостика внутри цепи. В легких цепях имеется два домена: один вариабельный и один константный; в тяжелых – один вариабельный и три или четыре (в зависимости от класса иммуноглобулина) константных. Активные центры антител образуются доменами вариабельных участков обеих цепей. Домены константных участков ответственны за другие функции молекул антител: домены C_L и C_H1 определяют изоантигенные различия антител; в области доменов C_H2 и C_H3 расположены рецепторы, ответственные за связывание C1q компонента комплемента, фиксацию антител на клетках и другие свойства (табл. 13).

Рис. 64. Структура молекулы IgG. Показана локализация участков, ответственных за различные функции (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

С доменом C_H2 связаны также цепочки углеводов. Иммуноглобулины различных классов значительно отличаются по числу и локализации углеводных групп, хотя ряд олигосахаридов располагается в гомологичных положениях – между доменами или на их поверхности. Углеводные компоненты иммуноглобулинов имеют сходное строение. Они состоят из постоянного ядра (внутренняя часть олигосахаридной цепи) и вариабельной наружной части, определяющей специфичность углеводов. Углеводные компоненты влияют на реализацию биологических свойств антител в норме и обусловливают необычные свойства молекул при различных заболеваниях.

В молекуле IgG имеется единственный участок гликозилирования на Н-цепи, к которому могут присоединяться более 30 типов N-гликозилсахаров, что обусловливает микрогетерогенность молекул IgG. Наружные участки сахаров молекул иммуноглобулинов выступают в роли участков связывания с различными клеточными и белковыми рецепторами. Роль углеводов заключается, очевидно, в том, что они участвуют в транспорте и секреции гликозилированных белков молекул антител. Кроме того, они поддерживают конформацию доменов, необходимую для их функций, и защищают антитела от разрушения, прикрывая места, чувствительные к протеолизу.

Участок тяжелых цепей, соединяющий С_Н1 с Fc-фрагментом молекулы антитела, называется шарнирной областью; они у γ-, α– и δ-цепей не похожи на домены. У каждого класса тяжелых цепей шарнирная область имеет своеобразное строение, они представляют наиболее вариабельную часть тяжелых цепей и в связи с этим обусловливают различия между классами иммуноглобулинов по аминокислотной последовательности и варьированию сегментной гибкости.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (эпитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Таблица 13

Биологические функции доменов иммуноглобулинов человека

Изотипы – детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и варианты каппа– и лямбда– легких цепей.

Аллотипы – детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы – антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

Полное схематическое изображение структуры молекулы IgG представлено на рис. 64. На долю этого класса приходится около 75 % общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.

Электронно-микроскопические исследования показали, что антитела класса IgG – гибкие молекулы, имеющие Y-форму, в которой две «руки» представлены Fab-фрагментами, а «талия» – Fc-фрагментом. Молекула IgG имеет размеры 240 × 57 × 19. Иммуноглобулины других классов характеризуются таким же типом строения, имеются лишь некоторые различия в дополнительной организации их функциональных единиц.

На поверхности зрелых В-лимфоцитов молекулы IgM располагаются в виде мономеров. Однако в сыворотке они существуют в форме пентамеров: молекула IgM состоит из пяти структурных единиц, аналогичных IgG, которые соединены между собой дисульфидными связями и J-цепью. Пять мономерных субъединиц в молекуле располагаются радиально, их Fc-фрагменты обращены к центру, а Fab-фрагменты – кнаружи (рис. 65).

Рис. 65. Схема пентамерной молекулы IgM (по Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Тяжелая цепь IgM (μ-цепь) состоит из 576 аминокислотных остатков, 124 из них образуют вариабельный домен, а 452 – четыре константных домена. Эта тяжелая цепь не имеет шарнирной области, ее роль выполняет домен С_μН₂, обладающий некоторой конформационной лабильностью. J-цепь (англ. join – соединять) представляет собой особый полипептид, необходимый для полимеризации IgM и IgA. Он имеет молекулярную массу 15 кД и состоит из 129 аминокислотных остатков и одного сложного углеводного компонента. Синтез J-цепи кодируется особым геном, расположенным в хромосоме, не содержащей генов иммуноглобулинов.

Иммуноглобулин А может иметь одну из трех форм: обычную, димерную или тримерную. В организме имеется два вида молекул IgA – сывороточные и секреторные. Сывороточные IgA составляют 10 – 15 % всех иммуноглобулинов. Секреторные IgA (IgAs), которые находятся в слюне, слизи, пищеварительных соках, секретах слизистой носа, в молозиве и обеспечивают местный иммунитет всех слизистых оболочек, состоят из двух Ig-мономеров, J-цепи и гликопротеина, или секреторного компонента (рис. 66).

У человека имеется два изотипа этого иммуноглобулина – IgA1 и IgA2, причем в сыворотке преобладает подкласс IgA1, а в экстраваскулярных секретах несколько больше содержится изотипа IgA2. Все α-цепи состоят из одного вариабельного домена, трех С-доменов и шарнирной области, домены Сα2 и Сα3 содержат по одной добавочной дисульфидной связи, которых нет у других классов иммуноглобулинов. Секреторный компонент вырабатывается эпителиальными клетками слизистых оболочек и присоединяется к молекуле IgA в момент прохождения последней через эпителиальные клетки. Секреторный компонент повышает устойчивость молекул IgAs к действию протеолитических ферментов. Иммуноглобулины А обладают следующими свойствами: 1) препятствуют связыванию антигенов со слизистыми оболочками; 2) осуществляют транспорт полимерных иммунных комплексов, содержащих IgA; 3) в процессе транспорта через эпителиальные клетки они нейтрализуют находящиеся в них вирусы. Значение иммуноглобулинов класса А в обеспечении местного иммунитета исключительно велико, так как общая площадь поверхности слизистой оболочки составляет несколько сот квадратных метров. Через нее происходит интенсивное экзогенное воздействие на иммунную систему. Но и сама слизистая активно участвует в формировании иммунитета. В ней содержится большое количество антителообразующих клеток. Лимфоциты слизистой оболочки синтезируют различные интерлейкины (IL-2, IL-4, IL-6), γ-интерферон. Клетки кишечного эпителия индуцируют пролиферацию супрессорных CD8-лимфоцитов, а респираторного – хелперных CD4-лимфоцитов.

Рис. 66. Схема строения секреторного IgA человека. Соотношение размеров цепей соответствует истинному:

J – J-цепь; CK – секреторный компонент (по: Д. Джеске, Дж. Капре, 1987)

Антитела этого класса содержатся в сыворотке крови в очень незначительных количествах. Молекулярная масса IgE составляет 190 кД, они содержат около 12 % углеводов. Тяжелая цепь (ε-цепь) состоит из 550 аминокислотных остатков, имеет один вариабельный и четыре константных домена. Основная роль антител этого класса заключается в том, что они своими Fc-фрагментами прикрепляются к мастоцитам и базофилам и опосредуют реакции гиперчувствительности немедленного типа.

IgD наряду с IgM являются главными мембранными рецепторами зрелых В-лимфоцитов. Тяжелая цепь (δ-цепь) состоит из вариабельного и трех константных доменов. Константная область δ-цепи человека построена из 383 аминокислотных остатков, следовательно, ее домены длиннее С-доменов γ– и α-цепей, но короче С-доменов ε– и μ-цепей. Шарнирная область δ-цепи – самая длинная, она состоит из 64 аминокислотных остатков, локализация углеводов в δ-цепи также необычна. Все это, возможно, имеет большое значение для функции IgD.

Под валентностью антител понимают количество способных реагировать с антигеном активных центров. В соответствии с указанными различиями молекулярной организации, иммуноглобулины разных классов бывают двухвалентными (IgG) или поливалентными (IgM). Являясь пентамерами, молекулы IgM имеют десять активных центров. Это свойство антител выявляется при взаимодействии их с антигенами: связываясь с аналогичными антигенными детерминантами, расположенными на разных, например бактериальных клетках, IgG и IgM вызывают их видимую агрегацию. Мономерные же молекулы IgA, хотя и имеют два активных центра, не осаждают антигены, так как их активные центры настолько сближены, что IgA не может выполнять роль связующего мостика.

Наряду с двухвалентными, или полными, антителами, при некоторых заболеваниях в организме человека накапливаются так называемые неполные, или моновалентные антитела. Соединяясь с антигеном, они не могут вызвать его агрегацию, так как связь между ними происходит только в одном из двух активных центров, а лишь блокируют его. Это не значит, что второй активный центр в таких антителах отсутствует. По неизвестным причинам он замаскирован, не проявляется. Присутствие неполных (блокирующих) антител выявляют с помощью антиглобулиновой реакции Кумбса (см. главу 42).

Антитела могут быть получены к любому возможному антигену, общее количество которых превышает 10⁷. Какие же механизмы обеспечивают появление огромного разнообразия иммуноглобулинов с различной антительной специфичностью? Антитела – это белки, а синтез каждого белка запрограммирован соответствующим геном. Генотип человека составляет около 100 000 генов. Поэтому долгое время вопрос о том, как осуществляется генетический контроль синтеза антител, оставался неясным, так как господствовал принцип: один ген – один белок. В 1965 г. У. Дрейер и Дж. Беннетт высказали предположение о том, что синтез иммуноглобулинов контролирует один для каждого класса С-ген и множество V-генов, расположенных отдельно от С-гена. Эта гипотеза нашла подтверждение в 1977 г. Используя набор рестриктаз, С. Тонегава с сотрудниками установили, что в эмбриональных клетках мышей участки ДНК, кодирующие V– и С-домены легкой цепи λ, находятся на далеком расстоянии друг от друга, а в зрелых клетках – значительно ближе. Клонирование этих генов показало, что в них отсутствуют нуклеотиды для 13 аминокислот. Они были обнаружены на расстоянии в несколько тысяч нуклеотидных пар от остальной части V-гена и получили название J-сегмента. Последний располагается около С-гена. Было установлено, что ген, кодирующий λ-цепь, имеет следующую экзон-интронную структуру: L (область, кодирующая лидерный пептид, необходимый для секреции иммуноглобулинов из клетки) – интрон – V-ген – интрон – J-ген – интрон – С-ген. В ДНК людей обнаружены шесть С-генов для λ-цепи, перед каждым из них имеется свой J-ген. Позднее было показано, что синтез γ-цепи контролируется 300 вариантами V-гена и 4 вариантами J-гена. Рекомбинации этих генов позволяют получить 1200 (300 × 4) вариантов различающихся по своей специфичности L-цепей.

Организация генов Н-цепи также имеет особенности:

1. Существует 9 разных С-генов, кодирующих С-домены Н-цепей различных изотипов (γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2, μ, ε, δ).

2. V-гены тяжелой цепи состоят не из двух сегментов, а из трех: V-, D-, J-. D-сегмент (англ. diversity – разнообразие) кодирует от 1 до 9 аминокислотных остатков.

3. Любой из V-генов тяжелой цепи может соединяться с любым из С-генов.

4. Все С-гены, как и V-гены, имеют экзон-интронную структуру. Каждый домен кодируется отдельным экзоном, между последними расположены интроны.

5. В ходе иммунного ответа V-гены тяжелой цепи могут переключаться с С-гена одного класса на С-гены другого класса, что приводит к появлению антител одной и той же антительной специфичности, но принадлежащих к разным классам (IgM, IgG, IgA, IgE, IgD).

В общей сложности синтез Н-цепей иммуноглобулинов контролируют 200 вариантов V-генов, 20 вариантов D-генов, 4 варианта J-генов и 9 вариантов С-генов. Схематически полный ген Н-цепи иммуноглобулинов выглядит таким образом: L-ген – интрон – V-ген – интрон – D-ген – интрон – J-ген – интрон – С-ген.

Организация генов иммуноглобулинов в эмбриональном и соматическом геномах различна. В эмбриональном геноме зародышевые V-гены (как L-цепи, так и Н-цепи) отделены от участков С-генов, D– и J-сегментов многими тысячами пар нуклеотидов. В соматических клетках эти сегменты сближаются, хотя по-прежнему сохраняют экзон-интронную структуру. Сборка V-генов и сближение их с D-, J– и С-генами происходят с помощью особых сигнальных последовательностей, которые расположены на 3'-концах всех зародышевых V-генов и в инвертированном виде – на 5'-концах всех зародышевых J-генов. У D-сегментов сигнальные последовательности располагаются и на 5'-, и на 3'-концах.

Формирование полного гена L-цепи молекулы иммуноглобулина происходит следующим образом. Путем рекомбинации вначале лидерный сегмент с его интроном сливается с одним из V– и с одним из J-генов. Одновременно при этом происходит их сближение с С-геном. Образующийся блок из экзонов и интронов транскрибируется в единую мРНК. После этого все интроны из нее вырезаются и формируется с помощью механизма сплайсинга зрелая мРНК, представленная только генами V, J, C, которая и транслируется в единую цепь.

Благодаря избирательному соединению одного из V-генов с одним из J-генов подавляется выражение остальных V– и J-генов в данной лимфоидной клетке. Таким же образом происходит формирование гена и для Н-цепи, только в нем участвует и D-сегмент. Кроме того, в случае образования Н-цепи имеется дополнительная рекомбинация, с помощью которой происходит переключение синтеза тяжелой цепи одного класса на синтез тяжелой цепи другого класса. Обычно вначале синтезируются иммуноглобулины класса IgM, а затем происходит переключение на синтез иммуноглобулинов класса IgG или других классов.

Таким образом, существует три системы генов иммуноглобулинов: две – для L-цепи (одна – для λ, другая – для χ) и одна – для Н-цепи.

Общее число возможных рекомбинаций для Н-цепей иммуноглобулинов составляет:

Общее же число возможных рекомбинаций для всех иммуноглобулинов составляет:

Точки объединения зародышевых генов строго не фиксированы. Это увеличивает количество возможных вариантов полипептидных цепей, а в том случае, когда они участвуют в формировании активных центров, то и их разнообразия. Кроме того, в период созревания В-лимфоцитов в V-генах происходят точечные соматические мутации, которые окончательно подгоняют структуру активного центра антитела к структуре детерминанта антигена. Считается, что общее количество вариантов антител возрастает за счет неточности сплайсинга и соматических мутаций еще в 100 раз и составляет около 2 млрд:

Таким образом, приобретенный иммунитет может быть обеспечен к любому возбудителю, к любому возможному чужеродному антигену. Решающий вклад в обеспечение многообразия иммуноглобулинов (специфичности антител) вносят следующие факторы:

1) наличие множества зародышевых генов иммуноглобулинов;

2) внутригенные рекомбинации, обусловленные экзон-интронной структурой V-, D-, J-, C-генов;

3) ассоциация различных L-цепей с различными Н-цепями;

4) неточность сплайсинга;

5) соматические мутации V-генов в зрелых В-лимфоцитах.