Текст книги "Медицинская микробиология, иммунология и вирусология"

Способность образовывать пигмент присуща многим видам микроорганизмов. Как уже выше упоминалось, цианобактерии, некоторые виды архебактерий, а также серные и пурпурные бактерии имеют пигменты типа хлорофилла или бактериородопсина, с помощью которых они улавливают энергию Солнца. Различные виды других бактерий образуют пигменты желтого, оранжевого, красного, синего или черного цвета. Окраска колонии может быть связана как с пигментацией самих клеток, так и с выделением окрашенных веществ в питательную среду. Интенсивность образования пигментов зависит от состава питательной среды и условий культивирования микроорганизмов. Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он водорастворим, окрашивается и питательная среда. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды относятся к ненасыщенным углеводородам, антоцианы и меланины – к ароматическим соединениям. Биологическая роль этих пигментов заключается, во-первых, в том, что они защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментных бактерий; а во-вторых, пигменты участвуют в обмене веществ этих бактерий.

Часть вторая
ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ

Глава 9
Некоторые общие понятия о генетической системе

Существование генов как дискретных единиц наследственности было установлено в 1865 г. Г. Менделем, а в 1869 г. Ф. Мишер впервые выделил ДНК. Однако прошло около 80 лет, прежде чем было установлено, что носителем генов является не белок, а ДНК. Это было сделано в опытах с пневмококками. В 1928 г. Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию (превращение) невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью живых, но не образующих капсул невирулентных пневмококков с убитыми капсульными вирулентными пневмококками. В организме мышей бескапсульные пневмококки превратились в капсульные, вызвали их заболевание и смерть. Механизм такой трансформации оставался неясным в течение 16 лет. В 1944 г. О. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти осуществили трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro. Они добавили к культуре бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные превратились в капсульные и стали вирулентными для мышей. Так впервые убедительно было доказано, что носителем единиц наследственности (генов) является ДНК. Через 9 лет после этого, в 1953 г., Ф. Крик и Дж. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие позволило понять, каким образом ген выполняет свои три фундаментальные функции: 1) непрерывность наследственности – благодаря полуконсервативному механизму репликации ДНК; 2) управление структурами и функциями организма – с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех букв (оснований): А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин) и Ц (цитозин); 3) эволюцию организмов – благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Работами Ф. Крика, M. Ниренберга, С. Очоа и Х. Кораны к 1966 г. генетический код был полностью расшифрован. Он характеризуется следующими основными свойствами:

1. Код триплетный. Это означает, что кодон (функциональная единица, кодирующая аминокислоту) состоит из трех букв (оснований).

2. Код неперекрывающийся, т. е. соседние кодоны представлены отдельными самостоятельными триплетами.

3. Код вырожденный, т. е. каждая аминокислота кодируется более чем одним кодоном.

4. Число триплетов, которые не кодируют ни одной аминокислоты, т. е. «бессмысленных», мало – всего три из 64.

5. Последовательность расположения кодонов в гене определяет последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи, кодируемой данным геном.

6. Код универсален, т. е. все живые существа используют один и тот же код для записи генетической информации. Это служит прямым доказательством единства происхождения живой материи. Полный словарь РНК-аминокислотного кода представлен на рис. 41.

Рис. 41. Генетический код

Одновременно с расшифровкой генетического кода происходило и изучение механизмов, с помощью которых осуществляется реализация генетической информации, заключенной в генах. Было обнаружено, что биосинтез белка осуществляется на особых структурах – рибосомах, а информация к ним от генов поступает через особых посредников – матричные РНК (мРНК), расположение кодонов в которых и несет программу сборки аминокислот в полипептидную цепь. Было установлено также, что хромосома состоит из особых функциональных единиц – оперонов, и в общих чертах были выяснены механизмы, с помощью которых регулируется их работа. В результате всех этих исследований стало очевидным, что генетическая система обладает уникальными свойствами, во многом обусловленными двунитевой структурой молекулы ДНК. Эти свойства заключаются в способности генетической системы к: 1) самоудвоению с помощью механизма саморепликации; 2) самовыражению (экспрессии) с помощью регулируемого синтеза мРНК; 3) самообновлению с помощью мутаций, рекомбинаций и транспонируемых элементов; 4) самозащите (самоисправлению) с помощью механизмов ревизии, репарации, супрессии и др.

Примечательно, что все эти функции контролируются специальными собственными генами соответствующей генетической системы. Исключительное значение, которое принадлежит генам в происхождении и эволюции жизни, диктует необходимость дать этому понятию определение.

В узком и специальном понимании ген представляет собой структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи. Но это определение не очень точно, так как существуют гены не только ДНКовые, но и РНКовые. Кроме того, некоторые гены вирусов и эукариот состоят из экзонов (кодирующих участков) и интронов (нетранслируемых участков). Например, сборка полных генов иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов происходит в результате сложной внутригенной рекомбинации в эмбриональном периоде. Кроме того, в одном и том же фрагменте ДНК может быть по крайней мере два гена с разными рамками считывания. Следовательно, структура гена сложнее, чем ранее предполагалось. Он не всегда является строго ограниченным и пространственно фиксированным участком хромосомы. Так называемые транспонируемые генетические элементы способны в интактной форме перемещаться из одного генома в другой. Наконец, для функционирования структурных генов требуется участие особых регуляторных генетических элементов – регуляторов, операторов, промоторов и т. п. Однако гены – это структуры, свойственные только живой материи. Поэтому в определении понятия гена следует исходить из той фундаментальной роли, которую он играет в живой материи.

Ген представляет собой универсальную организующую структурную единицу живой материи, которая, благодаря содержащейся в ней закодированной информации, обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию. Ген является единственным носителем и хранителем жизни, а его продукт – белок – определяет способ и форму существования жизни (А. И. Коротяев). Любой объект природы, имеющий набор собственных генов, следует рассматривать как живой организм. В связи с этим главным критерием, отличающим живое от неживого, является наличие у живого собственной генетической системы. Именно она обусловливает ту целесообразность поведения живых существ, которая отличает их от неживых систем. С этих позиций жизнь можно определить как форму существования всех объектов природы, обладающих собственными геномами, которые и определяют многообразие организмов, их наследственность и эволюцию (А. И. Коротяев). В основе единства и многообразия форм жизни лежит единство генетического кода и многообразие геномов живых существ. Под генетической системой понимают совокупность всех генов данного живого существа, характеризующуюся определенным уровнем структурной организации и особенностями экспрессии, т. е. реализации заложенной в генах информации. В соответствии с этим можно выделить следующие основные этапы эволюции генетической системы: кодон → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосома прокариот (нуклеоид) → хромосомы эукариот (ядро).

Очень часто, говоря о генетической системе, употребляют термин «геном». Под геномом понимают всю совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме или в наборе хромосом данного индивидуума. Объем генома у представителей различных царств жизни очень сильно варьирует. Именно от объема генома, который определяет возможное количество генов, и зависит степень сложности структурной организации данного индивидуума и, соответственно, уровень и характер проявления им своей жизни.

Под генотипом понимают всю совокупность имеющихся у данного существа индивидуальных генов. У плазмид, вирусов и бактерий бQольшая часть нуклеотидов ДНК входит в состав генов, поэтому размеры геномов у них выражают либо в молекулярной массе соответствующей геномной нуклеиновой кислоты, либо в количестве нуклеотидных пар, содержащихся в геномной нуклеиновой кислоте, либо в количестве имеющихся у них генов. Все эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит примерно из 1000 пар нуклеотидов, а вес одного нуклеотида ДНК составляет около 500 дальтон. Например, геном вируса гепатита В представлен двунитевой ДНК с м. м. 1,6 МД. Этот вирус имеет самое маленькое число генов среди возбудителей заболеваний человека. Его геном состоит всего из четырех генов (S, C, P и X). Геном вируса – возбудителя СПИДа представлен двумя идентичными молекулами РНК, которые состоят из 9213 нуклеотидов, образующих 9 генов. Геном бактериофага φХ174 состоит из 9 генов, у бактериофага Т4 – из 200 генов, у F-плазмиды – из 90 генов (94,5 тысяч пар нуклеотидов); у хламидий – из 400 – 600 генов, у риккетсий – из 1000 генов. Хромосома E. coli имеет молекулярную массу 2,8 ⋅ 10⁹ дальтон и содержит около 4,3 тысяч генов.

ДНК большинства растений и животных состоит из нескольких миллиардов пар нуклеотидов. Отличительная черта их геномов состоит в наличии в составе хромосомной ДНК помимо кодирующих последовательностей структурных генов некодирующих последовательностей и большого объема так называемых повторяющихся последовательностей нуклеотидов. На долю повторяющихся последовательностей, функция которых не известна, приходится от 10 до 70 % всего генома; у млекопитающих эта доля составляет в среднем 30 – 50 %.

Общий объем ДНК (генома) варьирует у разных ветвей эукариот. Геном человека составляет около 3 ⋅ 10⁹ нуклеотидных пар (н. п.). Этого количества достаточно для образования 3,0 ⋅ 10⁶ генов. В действительности же, согласно последним данным, генотип человека содержит около 30 000 – 35 000 генов, многие их которых уже картированы. Следовательно, понятия «геном» и «генотип» не равнозначны.

Под фенотипом данного индивидуума понимают всю совокупность реализованных у него генетически детерминированных признаков, т. е. индивидуальное проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип (например, у бактерий) изменяется при сохранении генотипа.

Генетическая система бактерий имеет по крайней мере четыре особенности, присущие только этим организмам:

1. Хромосомы бактерий (и соответственно плазмид) располагаются свободно в цитоплазме, не отграничены от нее никакими мембранами, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поскольку длина хромосомы (у E. coli около 1,6 мм) во много раз превышает длину бактериальной клетки (1,5 – 3,0 мкм в среднем), хромосома особым компактным образом в ней упакована: молекула хромосомной ДНК находится в суперспирализованной форме и свернута в виде петель, число которых составляет 12 – 80 на хромосому. Петли в центре нуклеоида объединяются за счет связывания ДНК с сердцевинной структурой, представленной молекулами особого класса РНК – 4,5S РНК. Такая упорядоченная упаковка обеспечивает постоянную транскрипцию отдельных оперонов хромосомы и не препятствует ее репликации. Возможно, что петли упакованной хромосомы способствуют компартментализации рибосом.

2. Хотя бактерии являются гаплоидными организмами, т. е. имеют один набор генов, содержание ДНК у них непостоянно, оно может при благоприятных условиях достигать значений, эквивалентных по массе 2, 4, 6 и даже 8 хромосомам. У всех прочих живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается (кроме вирусов и плазмид) перед делением.

3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т. е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации.

4. У бактерий очень часто помимо хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко – специфическим (приобретенным) иммунитетом к различным антибиотикам и другим химиопрепаратам.

Содержание ДНК у бактерий зависит от условий их роста: при благоприятных условиях оно возрастает до величин, соответствующих массе нескольких хромосом. Это уникальное свойство бактериального генома. Биологическое значение его состоит в том, что, регулируя содержание копий своих генов (а оно будет определяться количеством копий синтезируемых хромосом), бактерии одновременно приспосабливают скорость своего размножения к условиям роста. Наряду с увеличением содержания ДНК у бактерий в этом случае существенно возрастает и количество рибосом. Благодаря этому создаются необходимые условия для транскрипции и трансляции (а у бактерий они происходят одновременно) нескольких копий генов одновременно, возрастает суммарная скорость биосинтеза всех субклеточных и клеточных структур и соответственно скорость размножения бактерий. Время клеточного цикла бактерий сокращается от нескольких часов до 20 – 30 мин. Скорость размножения определяет возможность накопления в окружающей среде большого запаса клеток данного вида. Это и является причиной существования бактерий в природе многие миллионы лет. Возможность регулировать скорость собственного размножения – одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

У бактерий различают следующие типы репликации ДНК: вегетативную, конъюгативную, репаративную и стабильную. Вегетативная репликация хромосомной и плазмидной ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали, т. е. по наследству – от родительской клетки дочерним. Она контролируется соответственно хромосомными и плазмидными генами. Конъюгативная репликация осуществляется при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется только плазмидными генами. При конъюгативной репликации происходит достройка нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация является механизмом, посредством которого осуществляется устранение из ДНК структурных повреждений или заключительный этап генетической рекомбинации. Эти процессы контролируются хромосомными и плазмидными генами. Стабильная репликация так названа потому, что происходит независимо от наличия или отсутствия синтеза белка.

Вегететивная репликация. Репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы – оriC. Он включает в себя участки с так называемыми ДНК-боксами и расположенными между ними короткими последовательностями. Оба элемента примыкают к гену dnaA. У B. sublilis на oriC расположено 15 ДНК-боксов, с которыми связывается продукт гена dnaA. Это и служит сигналом для действия ДНК-хеликазы. Репликация имеет полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях и заканчивается также в строго фиксированной точке – terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5'-конца, другая – с 3'-конца), а ДНК-полимераза III осуществляет синтез ДНК только в направлении 5' → 3', репликация происходит своеобразно (рис. 42): на одной из расплетенных нитей – «прямой», или лидерной, или ведущей, – она идет непрерывно, а на другой – отстающей – ДНК-полимераза III должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5' → 3', прерывисто, через образование сегментов Оказаки, длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов (у эукариот – около 200 – 300 нуклеотидов).

Синтез каждого сегмента Оказаки происходит последовательно через следующие стадии (рис. 43):

1. Раскручивание нитей ДНК.

2. Расплетение (разделение нитей).

3. Стабилизация однонитевых участков.

Рис. 42. Схематическое изображение репликации ДНК прерывистой (отстающей) и непрерывной (ведущей) цепей

4. Формирование праймосомы. Праймосома – мультиферментный комплекс, в который входят фермент ДНК-праймаза и ряд других белков.

5. Синтез с участием ДНК-праймазы (англ. prime – подготавливать) затравочной РНК. Затравочная РНК необходима для синтеза каждого сегмента Оказаки потому, что сама ДНК-полимераза не способна инициировать синтез ДНК, для этого ей нужна специальная затравка, роль которой и выполняют короткие, длиной не более 10 нуклеотидов, фрагменты РНК, комплементарные ДНК-матрице.

6. Синтез сегмента Оказаки.

7. Вырезание затравочной РНК и замещение ее дезоксирибонуклеотидами, комплементарными основаниям ДНК-матрицы.

8. Сшивание сегмента Оказаки с предсуществующей нитью ДНК с помощью лигазы.

9. Суперспирализация вновь синтезированных участков нитей ДНК.

10. Ревизия ДНК-полимеразой вновь синтезированного фрагмента ДНК – нет ли ошибочного включения нуклеотидов.

Если произошла ошибка, то ошибочно включенный нуклеотид с частью этой нити вырезается и образовавшаяся брешь заполняется правильными нуклеотидами. Благодаря такой ревизии процент ошибок при репликации ДНК не превышает 1 ⋅ 10^– 9.

Скорость репликации ДНК у E. coli при температуре 37 °C соответствует включению 2 ⋅ 10³ пар нуклеотидов в 1 с. Участок хромосомы, в котором происходит разделение нитей и начинается репликация, имеет форму вилки, последовательно продвигающейся вдоль хромосомы. При благоприятных для роста бактерий условиях, когда еще не закончился один цикл репликации, могут возникать вторичные и третичные репликативные вилки, благодаря чему в клетке и происходит увеличение массы ДНК и числа копий хромосом.

Рис. 43. Схематическое изображение состава и функционирования компонентов репликативного комплекса

В осуществлении процессов репликации ДНК участвует целый комплекс ферментов, образующих единую структуру – реплисому. Наиболее важные из них указаны на рис. 43. Генетический контроль репликации ДНК осуществляется большим количеством генов (у E. coli не менее 25), локализованных в самой ДНК; это процесс саморегулируемый. Комплекс генов обеспечивает строгую временну́ю и пространственную координацию функционирования ферментов, участвующих в репликации.

Глава 10
Особенности регуляции выражения генетической информации у бактерий

В отличие от вегетативной репликации, цель которой – обеспечить передачу по наследству всех генов и которая происходит последовательно от начала до конца хромосомы, выражение генетической информации, т. е. работа генов, подчиняется другой цели, а именно – осуществлению за короткий срок жизненного цикла клетки. Поскольку он включает в себя множество биохимических реакций, сопряженных между собой, это предполагает хорошо согласованную во времени работу генов. Такая их согласованность возможна лишь при определенном жестком и четком управлении ими. Действительно, как было давно установлено, основной структурнофункциональной единицей хромосомы является оперон. Он представляет собой группу структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В состав оперона, как правило, входят структурные цистроны, определяющие синтез ферментов, которые участвуют в цикле связанных между собой биохимических реакций. Ген-оператор управляет одновременно всей группой структурных генов, которые образуют оперон, иначе говоря, оперон функционирует как самостоятельная единица. В свою очередь, оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора. Так возникает более сложная структурно-функциональная единица – регулон. Регулон представляет собой систему, состоящую из гена-регулятора и одного или нескольких оперонов, находящихся под контролем одного гена-регулятора.

Важным структурным элементом оперона является промQотор – область, с которой взаимодействует РНК-полимераза. В составе оперонов могут быть и различные другие регуляторные элементы – энхансеры, аттенуаторы, терминаторы и т. п.

Энхансер (англ. enhance – усиливать) – генетический элемент, усиливающий транскрипцию оперона.

Аттенуатор (англ. attenuate – разрежать, разбавлять) – генетический элемент, ослабляющий работу оперона. Аттенуатор – последовательность нуклеотидов, расположенная между промоторным операторным участком оперона и его первым структурным опероном; она кодирует лидерную РНК, ее длина около 150 пар нуклеотидов.

Терминатор (англ. terminate – заканчивать) – особый участок в структуре аттенуатора (лидерной последовательности), от которого зависит образование участка мРНК, блокирующего синтез лидерной РНК перед началом первого структурного гена соответствующего оперона.

Очень важным для понимания того, как регулируется выражение генетической информации, содержащейся в хромосоме, является вопрос о том, в какой последовательности работает оперон. До 1960-х гг. предполагали, что транскрипция сопряжена с репликацией, поскольку для той и другой необходимо разделение нитей. В соответствии с этой моделью транскрипция начиналась из той же точки, что и репликация, и осуществлялась последовательно вдоль всей ДНК. В 1969 г. А. И. Коротяевым было постулировано и обосновано положение о том, что репликация и транскрипция идут независимо друг от друга, поскольку скорости их не сопоставимы, и поэтому каждый оперон имеет равную возможность для своего выражения в ходе жизненного цикла клетки – гипотеза равновероятностного выражения оперонов. Образно говоря, хромосому клетки можно сравнить с пианино. В хромосоме гены располагаются последовательно один за другим, контролируя разные реакции. У пианино клавиши располагаются также последовательно – в соответствии с нотами и октавами. Законченное музыкальное произведение создается не путем последовательного извлечения звуков вдоль клавиатуры, а путем их избирательной композиции. Выбор композиции – это и есть произведение. Точно так же для того, чтобы в клетке осуществлялось такое сочетание биохимических процессов, которое бы приводило к образованию законченных продуктов-белков, необходим правильный выбор соответствующих генов, ибо совокупность биохимических реакций, ведущих к синтезу необходимого продукта (продуктов), – это и есть законченное произведение «генетического пианино». Партитура этих произведений написана эволюцией живой материи.

Классическим примером организации и работы оперона служит модель лактозного оперона. Лактоза – дисахарид, она состоит из галактозы и глюкозы, соединенных β-галактозидной связью. Поэтому фермент, разрушающий эти связи, получил название β-галактозидазы. Лактозный оперон (рис. 44) содержит гены, которые контролируют синтез ферментов, участвующих в превращении лактозы: β-галактозидазу (z), галактозидпермеазу (y) и тиогалактозидтрансацетилазу (a). Ген-оператор (о) управляет одновременно выражением всей группы этих генов. В его составе содержится промотор (р), с которым взаимодействует РНК-полимераза. Лактозный оперон содержит 5500 нуклеотидных пар, в том числе: область о + р – 50 нуклеотидных пар; цистрон z – 3700 нуклеотидных пар; цистрон y – 900 нуклеотидных пар; цистрон a – 900 нуклеотидных пар.

Рис. 44. Схема функционирования lac-оперона:

1 – работа оперона блокирована репрессором; 2 – оперон активно работает, молекулы репрессора инактивированы индуктором

Работа оперона находится под негативным контролем гена-регулятора (i), который контролирует синтез белка-репрессора. Белок-репрессор имеет м. м. около 150 – 200 кД. Он состоит из четырех субъединиц, имеющих м. м. 38 кД. Репрессор имеет два активных участка: с одним из них взаимодействует индуктор (лактоза или ее структурный аналог), а с помощью другого он прикрепляется к оператору. В отсутствие лактозы белок-репрессор связывается с оператором и блокирует выражение этого оперона. Когда в среде появляется лактоза, она связывается со вторым активным участком репрессора, это приводит к изменению его конформации по типу аллостерического эффекта, и он становится неактивным, репрессия оперона снимается, происходит активный синтез ферментов.

Негативный контроль работы лактозного оперона хорошо объясняет сущность феномена индукции: нет индуктора – оперон молчит, его работа заблокирована. Появился индуктор – оперон разблокирован и активно работает.

В основе другого феномена – феномена репрессии – лежит тот же принцип регуляции. Однако в репрессируемой системе ген-регулятор контролирует синтез апорепрессора, т. е. неактивного репрессора. Апорепрессор также имеет два активных центра: один – для взаимодействия с метаболитом (корепрессором), а другой – для специфического связывания с геном-оператором. Апорепрессор становится активным и подавляет работу оперона лишь после взаимодействия с соответствующим корепрессором (метаболитом).

Типичным примером репрессируемой системы является система синтеза ферментов пути образования триптофана у E. coli (рис. 45). В отсутствие триптофана апорепрессор неактивен и не блокирует работы триптофанового оперона. При избыточном содержании триптофана в среде, в которой размножается E. coli, он, выполняя роль корепрессора, связывается с апорепрессором и вызывает его аллостерическое превращение в активный репрессор. Последний связывается с геном-оператором, что и приводит к прекращению дальнейшей транскрипции структурных цистронов этого оперона и подавлению синтеза ферментов. Особенностью триптофанового оперона является наличие в нем между промоторно-операторным участком и его первым структурным цистроном особой последовательности приблизительно из 150 пар нуклеотидов, получившей название лидерной последовательности, или аттенуатора. Роль аттенуатора состоит в регуляции активности РНК-полимеразы. Суть феномена аттенуации заключается в том, что даже при незначительном избытке триптофана в клетке транскрипция оперона большинством молекул РНК-полимераз преждевременно обрывается в области аттенуатора (его терминатора). По мере же снижения концентрации триптофана все больше и больше молекул РНК-полимераз «проскакивают» этот участок и становятся способными транскрибировать весь оперон. Наоборот, при большом избытке триптофана его молекулы переводят апорепрессор в корепрессор, и транскрипция оперона подавляется. Следовательно, при наличии аттенуатора синтез ферментов может происходить как по правилу «все или ничего», так и по типу «больше – меньше». Аттенуаторы обнаружены и в других оперонах, осуществляя более экономичную их регуляцию.

Рис. 45. Функционирование триптофанового оперона:

а – аттенуатор; о – оператор; р – промотор

Помимо негативных, существуют и позитивные механизмы контроля выражения генетической информации. Они были обнаружены при изучении арабинозного оперона у E. coli (рис. 46). Этот оперон включает три гена – araA, araB, araD (1 мин), кодирующих синтез ферментов, и три гена – araE (61 мин), araF, araG (45 мин), кодирующих транспортные белки. Они расположены в разных участках хромосомы и образуют три самостоятельных оперона, один из которых состоит из трех сцепленных структурных генов (araBAD).

Выражение всех оперонов контролируется геном araC, расположенным рядом с проксимальным концом araBAD-оперона и отделенным от него общей регуляторной областью. Продукт гена araC – аллостерический белок, который может существовать в двух альтернативных конформациях: Р1 – сам белок; Р2 – белок в комплексе с арабинозой. Белок Р1 является репрессором для всех оперонов (araBAD, araE и araG). Белок Р2 в результате взаимодействия с арабинозой изменяет свою конформацию (аллостерический эффект) и выступает в качестве активатора araBAD-оперона. Следовательно, продукт гена araC осуществляет как негативную, так и позитивную регуляцию транскрипции.

В регуляторной области имеются следующие участки: промотор; инициатор (с ним связывается Р2); участок, с которым связывается белок-активатор катаболизма (БАК) в комплексе с цАМФ и оператор (место связывания Р1). При наличии в среде арабинозы Р1 связывается с ней и превращается в активатор Р2. Поэтому комплекс БАК – цАМФ присоединяется к соответствующему участку ДНК. В результате этого Р2 стабильно связывается с инициатором и стимулирует присоединение к промотору все новых молекул РНК-полимеразы, а последние осуществляют многократную транскрипцию araBAD-оперона и соответственно происходит многократная трансляция. При отсутствии арабинозы или при ее полном потреблении Р2 возвращается в репрессорную форму Р1 и блокирует оператор.

Рис. 46. Модель негативно-позитивного контроля выражения L-арабинозной системы.

Цифры обозначают число пар нуклеотидов в генах

Система позитивного контроля является необходимым атрибутом координированного управления различными оперонами. Так, например, в арабинозной системе пермеазный ген (araE) пространственно разобщен со всеми остальными генами. Если он является частью какого-то другого оперона (оперона Х), он требует позитивного контроля в форме активатора (Р2), чтобы вывести его из-под контроля, осуществляемого опероном Х.

Таким образом, благодаря сочетанию механизмов индукции и репрессии, негативного и позитивного контроля выражения генетической информации, обеспечивается определенная координация между различными функциональными группами оперонов.

В конце XX в. был обнаружен еще один механизм регуляции передачи генетической информации. Он получил название РНК-интерференция (RNA-interference), или РНК-и, а проще назвать этот процесс контролем, или цензурой потока генетической информации с помощью двухцепочечной РНК, поскольку именно такую, «цензорную» функцию выполняет двухцепочечная РНК.

Еще в начале 80-х гг. XX в. в опытах с E. coli было установлено, что введение в клетку синтетических фрагментов одноцепочечной РНК может приводить к блокированию некоторых генов. В 1997 г. американские ученые Эндрю Файер (Andrew Z. Fire) и Крэйг Мелло (Craig C. Mello) с группой соавторов в опытах с червем Caenorhabditis elegans установили, что такое блокирование генов происходит значительно эффективнее, если вводить короткие фрагменты не одно-, а двухцепочечной РНК. (Статья об этом открытии была опубликована в журнале «Nature», Vol. 391, 19 February 1998, pp. 806 – 811). К. Мелло дал этому феномену название «РНК-интерференция». Механизм РНК-интерференции пока полностью не изучен и заключается, по-видимому, в следующем. При попадании в клетку молекулы двухцепочечной РНК индуцируют работу группы ферментов, которые разрезают РНК на очень короткие фрагменты, затем расплетают их на отдельные нити и с помощью этих нитей удаляют из мРНК соответствующие участки. В результате этого содержащаяся в них информация утрачивается и не доходит до рибосом. Этот механизм оказался универсальным. Им владеют все живые существа от бактерий до млекопитающих. С помощью этого механизма прицельного блокирования (генной цензуры), осуществляемого РНК-и, разрушается попавшая в организм чужеродная генетическая информация (например, различных вирусов) и контролируется работа собственных генов, т. е. подавляется работа тех из них, в которых возникли опасные мутации, или вырезаются и уничтожаются транспозоны, которые могут вызвать опасные мутации. За открытие этого фундаментального механизма регуляции переноса генетической информации Э. Файер и К. Мелло в 2006 г. были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Эти исследования помогут разработке более эффективных способов профилактики и лечения тех заболеваний, от которых в настоящее время умирает больше всего людей, а именно: сердечно-сосудистых, онкологических и вирусных (в том числе ВИЧ-инфекции и гепатитов).