Текст книги "Медицинская микробиология, иммунология и вирусология"

Глава 11
Формы обмена генетическим материалом у бактерий

Помимо основного механизма передачи генов – по наследству (по вертикали), у бактерий существуют следующие формы обмена генетическим материалом по горизонтали, т. е. между отдельными особями в популяции клеток: трансформация, трансфекция, трансдукция, конъюгация и сексдукция.

Трансформация – перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная (искусственно получаемая) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду вследствие их лизиса или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Как спонтанная, так и индуцированная трансформация сводится, по сути, к поглощению трансформирующей ДНК и образованию рекомбинантов, причем спонтанная трансформация может происходить в результате взаимного обмена ДНК. Эффективность индуцируемой трансформации во многом зависит от физиологического состояния клеток-реципиентов. Они должны находиться в состоянии своеобразной компетентности для этого процесса. Предполагается, что в фазе компетентности происходят значительные изменения поверхностных слоев клетки, которые способствуют поглощению ДНК. В частности, аутолитические ферменты клетки растворяют клеточную стенку в тех участках, где происходит ее синтез. При этом мезосомы через образовавшиеся отверстия соприкасаются с внешней средой, адсорбируют и втягивают внутрь клетки трансформирующую ДНК, где она и вступает в рекомбинацию с ДНК реципиента. В результате этого образуется мерозигота, клетка делится, и ее потомки наследуют признаки, полученные от донора и реципиента. Однако в других случаях поглощенные фрагменты ДНК разрушаются нуклеазами клетки-реципиента, и трансформации не происходит. Ее эффективность зависит также от размеров трансформирующей ДНК: высокомолекулярная ДНК поглощается труднее, чем менее крупные ее фрагменты. Способность к трансформации обнаружена у ряда родов бактерий, но, по-видимому, роль ее в обмене генетическим материалом среди бактерий в естественных условиях менее существенна, чем роль других механизмов. Дело в том, что у многих бактерий имеются особые системы рестрикции и модификации. Эти системы модифицируют свою ДНК (чаще всего путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК, если она подобным образом не модифицирована, с помощью особых ферментов – рестрикционных эндонуклеаз.

Эффективность метода генетической трансформации во много раз повышается в том случае, если смесь ДНК и трансформируемых клеток с помощью специального прибора подвергнуть обработке электрическим импульсом. Метод электротрансформации является универсальным, он применим к любым видам бактерий. С помощью этого метода осуществлена трансформация более 100 видов бактерий, и он может стать важным инструментом получения ценных рекомбинантных штаммов бактерий.

Трансфекция – вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой.

С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий (без клеточной стенки)

вирусную инфекцию. Трансфекцию можно осуществить и с другими (не бактериальными) клетками, если ввести в них чужеродную ДНК, способную рекомбинировать с ДНК этих клеток, или воспроизводить вирионы, или самостоятельно реплицироваться.

Трансдукция – перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую.

Неспецифическая трансдукция – случайный перенос фрагментов ДНК от одной бактериальной клетки к другой.

Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены.

Механизмы неспецифической и специфической трансдукции описаны в главе 47.

Конъюгация – это процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном (англ. transfer – перенос). Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения. Аппаратом переноса являются специальные донорные ворсинки, с помощью которых устанавливается контакт между конъюгирующими клетками. Донорные ворсинки представляют собой длинные (1 – 20 мкм) тонкие трубчатые структуры белковой природы с внутренним диаметром около 3 нм. Число донорных пилей у каждой F⁺-клетки невелико и, очевидно, соответствует числу копий конъюгативной плазмиды в клетке. Донорные ворсинки обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые, адсорбируясь на них, проникают в клетку и вызывают ее лизис. Для каждой группы конъюгативных плазмид существуют свои донорспецифические фаги. Ворсинки выполняют следующие функции: 1) с их помощью устанавливается контакт между донорной и реципиентной клетками; 2) они облегчают перенос нити ДНК (она, вероятно, протаскивается через ворсинку); 3) стягивают спаривающиеся клетки, что повышает эффективность конъюгации.

Процесс конъюгации протекает через следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом, протаскивание нити ДНК от донора к реципиенту, достройка перенесенной нити ДНК комплементарной ей нитью в реципиентной клетке и рекомбинация между переданной хромосомой (ее фрагментами) и хромосомой клетки-реципиента, размножение мерозиготы и образование клеток, несущих признаки донора и реципиента.

Сущность поверхностного исключения заключается в том, что под контролем traгенов синтезируются белки наружной мембраны, препятствующие (исключающие возможность) проникновению в клетку, несущую плазмиду, другой, но близкородственной ей плазмиды, или подавляющие конъюгативную репликацию ее ДНК.

Конъюгативная репликация переносимой нити хромосомной или плазмидной ДНК осуществляется также под контролем плазмидных генов. Классическим примером конъюгативной плазмиды является половой фактор, или F-плазмида (F – англ. fertility – плодовитость). Эта плазмида представляет собой двунитевую кольцевидную молекулу ДНК, состоящую из 94,5 тыс. п. н.

Главная функция этой плазмиды – контроль конъюгации у бактерий кишечной группы. Ее tra-оперон содержит больше тридцати генов, которые контролируют процесс конъюгации. Эта плазмида может как находиться в автономном состоянии, так и интегрироваться в хромосому клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос, при котором F^--клетка (клетка, лишенная F-плазмиды) превращается в F⁺-клетку (клетку, содержащую F-плазмиду). F-плазмида может интегрироваться в определенные участки бактериальной хромосомы, в этом случае она станет контролировать конъюгативный перенос хромосомы клетки. При этом одна из нитей ДНК хромосомы в месте интеграции F-плазмиды разрезается, и ее 5'-конец через донорный мостик начинает протягиваться в клеткуреципиент. Репликация ДНК в этом случае протекает по принципу «крутящегося кольца» (рис. 47). Таким образом, конъюгация начинается с установления контакта между донором и реципиентом с помощью донорной ворсинки. Последняя смыкается с рецептором клеточной мембраны клетки-реципиента. Нередко такой контакт устанавливается не только между двумя клетками, а между многими клетками, образуя агрегаты спаривания. Предполагают, что нить ДНК в процессе конъюгации протаскивается через канал донорной ворсинки. Поскольку донорный мостик является непрочным, процесс конъюгации может в любой момент прерваться. Поэтому при конъюгации может переноситься или часть хромосомы, или, реже, полная хромосома. С помощью F-плазмид частота переноса генов между бактериями существенно возрастает. Поэтому клетки, у которых F-плазмида интегрирована в хромосому, обозначают как клетки Hfr (Hfr – англ. high frequency recombination – клетки, обеспечивающие высокую частоту рекомбинаций).

Рис. 47. Конъюгационный перенос бактериальной ДНК

В некоторых случаях интегрированная в хромосому F-плазмида может из нее исключаться и, подобно умеренному фагу, «выхватывать» из хромосомы ее ген или даже целую группу генов. Такая плазмида, содержащая в своей ДНК часть генов хромосомы клетки, называется F'-плазмидой.

Сексдукция – перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F'-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции.

Глава 12
Генетические рекомбинации у бактерий

Заключительным этапом при любой форме обмена генетическим материалом является рекомбинация между привнесенной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. Если переносится одна нить ДНК, то она вначале достраивается комплементарной ей нитью; рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Различают общую рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и рекомбинацию, контролируемую транспонируемыми элементами. Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация происходит за счет наличия специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК. Ее примером является специфическая рекомбинация между умеренным фагом λ и хромосомой E. coli. Как в бактериальной хромосоме, так и в ДНК фага λ имеются специфические участки (attB и attP соответственно), между которыми и происходит сайт-специфическая рекомбинация. Общая и сайт-специфическая рекомбинация контролируется геном recA.

Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, тоже являются сайт-специфическими, но специфичность этих сайтов связана с особыми нуклеотидными последовательностями, и эта форма рекомбинации не зависит от recA-гена.

Главным генетическим детерминантом всех путей рекомбинации является ген recA. Его повреждение полностью исключает возможность образования рекомбинантов. Основной способ recA-рекомбинации осуществляется с участием продуктов генов recB и recC (они кодируют синтез эндонуклеазы V). В случае мутации по recB и recC выход рекомбинантов составляет около 20 % от rec⁺. Однако эти мутации могут быть исправлены путем супрессии в двух генах: sbcA^- и sbcB^-. Супрессии sbcA^– открывают дополнительный путь рекомбинации через ген recE (его продукт – экзонуклеаза VIII). Супрессии sbcB^- реализуют рекомбинации через ген recF (структурный ген экзонуклеазы I). Таким образом, генетический контроль рекомбинаций носит сложный характер.

Изучение его механизма – одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболеваний человека. Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене поврежденного («больного») гена здоровым. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RecA и АТФ-независимой ренатуразой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансферазы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RecA-белком бактерий.

Решающая роль в гомологической рекомбинации у бактерии, как указано выше, принадлежит гену recA. Его продукт – белок RecA c м. м. 38 кД – выполняет ряд уникальных функций: 1) прочно связывается с одиночными нитями ДНК; 2) способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; 3) одновременно может присоединяться и к двойной спирали ДНК, и к одиночной нити и удерживать их вместе; 4) обладает свойством ДНК-зависимой АТФазы. Благодаря этому свойству обеспечивается серия конформационных изменений, которые обусловливают превращение трехнитевого комплекса с неспаренными основаниями в трехнитевый комплекс со спаренными основаниями. С помощью этой реакции происходит прямое комплементарное взаимодействие между одиночной нитью ДНК и двойной спиралью – главное событие в процессе рекомбинации. Энергия гидролиза АТФ RecA-белком используется последним для продвижения одиночной нити вдоль двойной спирали ДНК с целью нахождения того ее участка, который имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, необходимую для замыкания водородных связей, т. е. для спаривания.

Для объяснения механизма гомологической рекомбинации предложены разные модели. В соответствии с наиболее популярной моделью, рекомбинация инициируется с помощью однонитевого разрыва в одной из двух гомологичных молекул ДНК, вызываемого эндонуклеазой, которая кодируется генами recB и recC. Образующийся при этом конец (3'– или 5'-конец) однонитевой ДНК (онДНК) атакует двойную спираль другой молекулы ДНК, отыскивая в ней гомологичный участок, и образует временную трехнитевую структуру (рис. 48, 1). В результате спаривания атакующей молекулы онДНК с комплементарной нитью другой молекулы ДНК происходит выталкивание ее освобождающейся нити (рис. 48, 2), которая в свою очередь спаривается с комплементарной нитью другой молекулы ДНК. Во время этих событий часто наблюдается удаление некоторого количества нуклеотидов, репарация образующейся бреши и лигирование ДНК, но в конечном счете образуется (рис. 48, 3) предсказанная Р. Холидеем полухиазма (греч. chiasmos – расположение в виде греческой буквы Х – хи). Парными стрелками указаны места «разрешения» полухиазмы (см. рис. 48, 3). Разрешение в одном варианте (полые стрелки) приведет к обмену фрагментами онДНК между спаривающимися молекулами ДНК, в другом (черные стрелки) – к полному кроссинговеру на уровне двунитевых ДНК.

В случае обмена с перекрещиванием нитей обе гомологичные спирали ДНК после начального этапа спаривания удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену нитями из имеющихся четырех – по одной нити от каждой спирали. Структура, образующаяся при этом, обладает двумя важными свойствами:

1. Точка обмена между двумя гомологичными спиралями, т. е. место, где скрещиваются две их нити, может быстро мигрировать по спирали. Этот процесс получил название миграции ветвей. Миграция может значительно увеличивать области спаривания между двумя взаимодействующими нитями, изначально принадлежавшими разным молекулам ДНК.

2. Эта структура, благодаря вращению составляющих ее элементов относительно друг друга, может находиться в различных изомерных формах. Изомеризация изменяет положение двух пар нитей: две ранее перекрещивающиеся нити становятся неперекрещивающимися, и наоборот. Для прекращения процесса спаривания в каждой из двух нитей должен произойти разрыв. Если он произойдет до изомеризации, то у каждой спирали будет заменена только одна из нитей и только на коротком отрезке. Если же разрыв произойдет после изомеризации, наступит полный кроссинговер.

Рис. 48. Образование полухиазмы Холидея при асимметричном характере инициирования рекомбинации (по В. А. Ланцову):

1 – однонитевый разрыв в одной из двух гомологичных молекул ДНК; 2 – выталкивание высвобождающейся при спаривании нити ДНК и спаривание последней с комплементарной нитью другой молекулы ДНК; 3 – образование полухиазмы

Фермент ренатураза (33 кД) кодируется у E. coli геном recE. Он относится к классу «гомологических ДНК-синаптаз», которые, в отличие от RecA-белка, не обладают ДНК-трансферазной активностью и не зависят от АТФ. Эти белки участвуют в реакциях гомологической рекомбинации, индуцированных двунитевыми разрывами ДНК.

Ген recA участвует не только в процессе рекомбинации, его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и ряда других жизненно важных для бактерий функций. Рецессивные мутации в этом гене неизбежно отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность объединена в единую SOS-систему (англ. SOS – сигнал бедствия: save our souls – спасите наши души или save our ship – спасите наш корабль).

Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта recA-гена. SOSсистема срабатывает после любых воздействий на ДНК агентами, которые повреждают ее структуру, или нарушают нормальный процесс ее репликации, или нарушают другие функции. Поэтому recA-гену принадлежит ведущая роль в обеспечении самозащиты генетической системы бактериальной клетки.

Глава 13
Молекулярные механизмы изменчивости бактерий. Организация геномов

Бактерии в силу относительной простоты их организации и короткого срока жизни подвергаются изменчивости быстрее, чем многие другие организмы. В основе их изменчивости лежат мутации и генетические рекомбинации, особенно протекающие с участием транспонируемых элементов.

Мутации – изменения в генотипе, которые стабильно наследуются. Мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Спонтанные мутации возникают без каких-либо специальных воздействий, они происходят в результате ошибок при репликации и репарации. Средняя частота спонтанных мутаций составляет около 1 ⋅ 10^-6 (одна мутантная клетка на 1 млн клеток).

Индуцированные мутации происходят с гораздо большей частотой, они возникают в результате воздействия различных мутагенов. К ним относятся физические и химические факторы, повреждающие ДНК (ионизирующая радиация, УФ-облучение, различные аналоги оснований ДНК, алкилирующие соединения, акридины, антибиотики и т. п.). Молекулярные механизмы спонтанных и индуцированных мутаций одинаковы. Точечные мутации могут быть обусловлены заменой оснований, выпадением (делецией) основания или появлением дополнительного основания (вставки). Различают простую замену оснований, или транзицию, при которой пурин заменяется на пурин, а пиримидин – на пиримидин, и сложную, или трансверсию, при которой происходит замена пурина на пиримидин или наоборот. Точечные мутации могут иметь три последствия: замена одного кодона на другой, а стало быть, одной аминокислоты на другую;

сдвиг рамки считывания, что приведет к изменению целой серии последовательностей аминокислотных остатков; возникновение «бессмысленного» кодона (УАГ, УГА, УАА), что приведет к прекращению трансляции в данной точке. В результате таких точечных мутаций синтез белка может быть полностью заблокирован за счет «бессмысленного» кодона, либо будет синтезироваться измененный (неактивный) белок, что приведет либо к утрате какого-то фенотипического признака у мутанта, либо, реже, к появлению у него нового признака. Получение индуцированных мутаций (мутантов) – один из основных способов изучения генетики микроорганизмов.

Эффекты мутаций могут быть устранены либо путем репарации поврежденного участка гена, либо с помощью супрессорных мутаций, т. е. мутаций в других генах, устраняющих или нейтрализующих эффект первичной мутации. Помимо точечных мутаций, нарушение генома может быть следствием протяженных делеций, инверсии (поворот сегмента хромосомы на 180°) или транслокации (перемещение участка хромосомы из одной позиции в другую). Все это также будет приводить к изменению и нарушению различных функций клетки (организма).

Судьба мутантных организмов зависит от степени сохранения их жизнеспособности. Мутации у микроорганизмов, связанные с приобретением лекарственной устойчивости, придают им важные селективные преимущества в условиях повсеместного применения антибиотиков и различных других химиопрепаратов.

Известно, что многие белки близки по своим функциям и аминокислотной последовательности. Поэтому вполне вероятно, что они могли возникнуть от какого-то единственного предкового гена в результате процессов его дупликации и дивергенции. Возникновение новых генов путем дивергенции также играло важную роль в эволюции организмов.

Большая роль в изменчивости бактерий и других организмов принадлежит так называемым транспонируемым генетическим элементам, т. е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например от плазмидного генома к бактериальному и наоборот. Различают три класса транспонируемых элементов: IS-элементы, транспозоны и эписомы.

IS-элементы, или вставочные последовательности (англ. insertion sequence), имеют обычно размеры, не превышающие 2 тыс. пар оснований, или 2 кб (килобаза – тысяча пар оснований). IS-элементы несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают цифрами: IS1, IS2, IS3 и т. д.

Транспозоны (Tn) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Транспозоны также способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой, т. е. ведут себя как IS-элементы, но помимо генов, обеспечивающих их транспозиции, они содержат и другие гены, например гены лекарственной устойчивости.

Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в геномах плазмид, вирусов, прокариот и эукариот, поэтому с их способностью переносить гены из одного генома в другой связывается исключительно важная роль, которую играют транспозоны и вообще транспонируемые элементы в эволюции живой материи. Транспозоны, как и IS-элементы, обозначают порядковым номером: Tn1, Tn2, Tn3 и т. д.

Эписомы. К эписомам относятся еще более крупные и сложные саморегулирующиеся системы, содержащие IS-элементы и транспозоны и способные реплицироваться в любом из двух своих альтернативных состояний – автономном или интегрированном – в хромосому клетки-хозяина.

К эписомам относят различные умеренные лизогенные фаги; они отличаются от всех других транспонируемых элементов наличием собственной белковой оболочки и более сложным циклом репродукции. Собственно эписомы – это вирусы, обладающие, подобно другим транспонируемым элементам, способностью в интактной форме переходить из одного генома в другой.

Таким образом, природа использовала все возможности, вытекающие из особенностей структуры ДНК, для эволюции живой материи: мутации генов, их дупликации, генетические рекомбинации и мобильность некоторых генетических элементов.