Текст книги "Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии"

Литература

Коржевский Д. Э. Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2000. – Т. 118, № 5. – С. 68 – 70.

Коржевский Д. Э. Макрофаги сосудистого сплетения конечного мозга эмбриона человека // Морфология. – 2001. – Т. 119, № 1. – С. 20 – 23.

Коржевский Д. Э., Гилерович Е. Г., Зинькова Н. Н. [и др.]. Иммуногистохимическое выявление нейронов головного мозга с помощью селективного маркера NeuN // Морфология. – 2005. – Т. 128, № 5. – С. 76 – 78.

Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006а. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. Морфологические основы формирования гематоликворного барьера сосудистого сплетения головного мозга в пренатальном онтогенезе человека // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2001. – Т. 37, № 2. – С. 150 – 153.

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Неокесарийский А. А. [и др.]. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. – 2006б. – Т. 129, № 3. – С. 63 – 64.

Коржевский Д. Э., Талантова О. Е., Павлова Н. Г. Экспрессия белка bcl-2 в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2002. – Т. 122, № 5. – С. 31 – 34.

Глава 5.
ДЕМАСКИРОВАНИЕ АНТИГЕНОВ

5.1. Почему необходимо демаскирование антигенов?

В процессе фиксации тканевые антигены претерпевают конформационные изменения, связанные с коагуляцией белков и образованием перекрестных сшивок при воздействии альдегидов (формальдегида и глутарового альдегида) (Fraenkel-Conrat H. [et al.], 1947; 1948). Эти изменения во многих случаях приводят к маскировке антигенных детерминант, с которыми должны взаимодействовать полученные антитела к данным белкам. В результате оказывается, что при постановке иммуногистохимических реакций на фиксированном материале часть антител проявляет недостаточно высокую активность и окрашивание конечного продукта реакции слишком слабое либо вообще отсутствует. Степень повреждения антигенов зависит от условий фиксации и концентрации альдегидов в фиксирующей жидкости. Считается, что коагулирующие фиксаторы (спирты, уксусная кислота, соли металлов) вызывают меньшую потерю антигенных свойств, чем формальдегид. Хуже всего идут иммуноцитохимические реакции на препаратах, фиксированных глутаральдегидом.

Долгое время эта ситуация создавала неразрешимую проблему для использования в иммуногистохимической диагностике материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин – стандартный патологоанатомический материал. При необходимости иммуногистохимического исследования приходилось использовать замороженный нефиксированный материал или методы мягкой фиксации (холодный ацетон и др.). В настоящее время решение найдено. Восстановить антигенные детерминанты, которые были изменены при взаимодействии с формальдегидом, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка срезов в водных буферных растворах (Shi S. R. [et al.], 1991). Этот метод получил название «тепловое демаскирование антигенов». В англоязычной литературе он обычно называется heat-induced epitope retrieval. Следует отметить, что теоретические основы этого метода пока не разработаны. До сих пор непонятно, почему обработка материала при температуре свыше 100 °C приводит к восстановлению антигенных свойств белков, а не к их денатурации и дальнейшему разрушению антигенных детерминант. Тем не менее многочисленные исследования показывают высокую эффективность процедуры теплового демаскирования (Taylor C. R. [et al.], 1996; Evers P. [et al.], 1998; Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005; Сухорукова Е. Г. [и др.], 2012). Причем метод оказался пригоден не только для парафиновых срезов, но и для материала, залитого в целлоидин (Shi S. R. [et al.], 1992a; 1992b; 1993), и даже для срезов, полученных с блоков, залитых в эпоксидные смолы.

В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 – 100 °C, а в отдельных случаях – и до 120 °C при повышенном давлении.

5.2. Растворы, применяемые для теплового демаскирования антигенов

С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).

Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.

Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH ≈ 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bull’s Eye Decloaker (Biocare) и др.). В отдельных случаях эти растворы позволяют добиться лучшего демаскирующего эффекта, чем обычный цитратный буфер (pH = 6,0). Судя по литературе, среди коммерческих буферных растворов наибольшей популярностью у специалистов пользуется модифицированный цитратный буфер с pH = 6,1 (S-1700, Dako).

Одним из недавних усовершенствований технологии теплового демаскирования антигенов является объединение этого этапа обработки препарата с депарафинированием срезов. При этом используются водные растворы детергентов, а не ксилол и аналогичные органические растворители парафина. При прогреве срезов в водных растворах до температуры, близкой к 100 °C, парафин, имеющий сравнительно низкую температуру плавления, уже расплавлен. Трудность заключается в том, чтобы эффективно удалить расплавленный парафин из среза. Для этого в демаскирующий раствор вводятся детергенты. При обработке таким раствором образуется эмульсия парафина в демаскирующем растворе и, соответственно, происходит депарафинирование среза без применения органических растворителей. Наиболее известным коммерческим буферным раствором для одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов является раствор Trilogy (CellMarque, США). Метод одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов используется в автоматической системе иммуноокрашивания BenchMark (Ventana, США).

Приготовление цитратного буфера. Готовится цитратный буфер (0,01 М, рН = 6,0) следующим образом. Берется 29,4 г цитрата натрия и растворяется в 10 л дистиллированной воды. Затем добавляется 1 н соляная кислота (54 мл). Если pH полученного раствора больше 6, его следует довести до рН = 6, добавляя по каплям 1 % соляную кислоту. Неиспользуемую часть раствора можно хранить в холодильнике в течение недели. Без консерванта раствор нельзя долго хранить.

5.3. Техника теплового демаскирования

Поскольку тепловое демаскирование антигенов требует прогревания срезов в буферных растворах при температуре, близкой к 100 °C, а кипение раствора негативно сказывается на сохранности срезов, были исследованы возможности применения различных приборов для получения высокой температуры без кипения буфера. Оказалось, что для этих целей можно применять водяную баню (95 – 98 °C), микроволновую печь, пароварку, автоклав, скороварку. В последних двух случаях можно достичь температур выше 100 °C благодаря нагреванию при повышенном давлении. Использование более высоких температур позволяет уменьшить продолжительность процедуры.

Каждый из предлагавшихся способов разогрева инкубационной среды имеет свои преимущества и недостатки. При использовании водяной бани демаскирование антигенов происходит медленнее всего, поскольку температура раствора поддерживается на уровне 95–98 °C, ее удобно контролировать, применяя обычные термометры, и отсутствует необходимость приобретать дорогостоящее оборудование.

В свое время наиболее распространенным способом прогрева препаратов при тепловом демаскировании антигенов было использование микроволновой печи (Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005). Вероятно, это связано с не подтвердившимся впоследствии предположением о том, что микроволновое излучение (как физический фактор) само по себе способствует демаскированию.

Одним из наиболее удачных способов прогрева предметных стекол в микроволновой печи является способ E. Jessup (1994). Этот метод позволяет обрабатывать до 10 предметных стекол за один непрерывный цикл работы прибора (30 мин). На дно заполненного высокого пластикового контейнера, вмещающего 600 мл буферного раствора, ставится пластиковый держатель для предметных стекол. Во время прогрева происходит выкипание части раствора, но благодаря высоте исходного уровня жидкости предметные стекла со срезами в течение всего цикла работы прибора полностью омываются буфером. Нет необходимости останавливать инкубацию для пополнения выкипевшего раствора. Тем не менее большинство вариантов обработки препаратов в микроволновой печи предусматривают кипение буфера, что, в свою очередь, негативно сказывается на состоянии срезов, которые при энергичном перемещении жидкости, происходящем при кипении, могут отклеиться от предметного стекла. Применение пароварки – наиболее удобный, безопасный и экономически выгодный способ обработки небольших объемов материала. Приборы этого типа более безопасны, чем микроволновая печь и скороварка. Они имеют встроенный таймер, отключающий нагреватель. Температура раствора приближается к 100 °C, но раствор никогда не закипает. При использовании сосуда Хеллендахела, помещаемого в пароварку, одновременно можно обрабатывать до 16 препаратов. Расход буфера сравнительно небольшой (не более 100 мл), что особенно удобно при использовании коммерческих реагентов. Можно использовать и другие сосуды (желательно стаканы из термостойкого стекла). Не рекомендуется ставить в пароварку пластиковые сосуды Коплина и другую пластиковую посуду. Время обработки препаратов в пароварке для различных антигенов составляет от 25 до 45 мин (отсчет времени от момента включения прибора обеспечивает внутренний таймер).

Несмотря на очевидное удобство этого способа, следует заметить, что оптимальное время обработки необходимо выверять для каждого используемого прибора отдельно, поскольку невозможно контролировать время прогрева сосуда с предметными стеклами до рабочей температуры, которое зависит от мощности и устройства конкретного прибора, а также от объема нагреваемой жидкости. Лучшей стандартизации можно добиться, помещая препараты в уже подогретый буфер, однако применение этого подхода делает методику более трудоемкой.

В патологоанатомической практике наибольшее применение находит демаскирование в скороварке (Bancroft J. D. [et al.], 2002). Для работы со скороваркой необходим достаточно большой объем буферного раствора (3 л буфера для скороварки вместимостью 5 л). Такие объемы делают процедуру достаточно дорогостоящей, если только буферный раствор не готовят самостоятельно сотрудники лаборатории.

Предметные стекла в металлическом держателе помещают на дно скороварки, закрывают крышку и начинают нагрев. Время обработки начинают отсчитывать после достижения рабочего давления. Для большинства антигенов оно составляет около 2 мин. Скороварка достаточного объема позволяет одновременно обрабатывать до 25 препаратов.

Следует заметить, что существуют антигены, которые разрушаются при тепловом демаскировании (например, эпитоп ламинина, выявляемый моноклональными мышиными антителами 4С7).

Для срезов, полученных с объектов, фиксированных в коагулирующих фиксаторах и в фиксирующих жидкостях сложного состава, эффект теплового демаскирования не столь очевиден, как для материала, фиксированного в формалине и цинк-формалине. В отдельных случаях использование высокочувствительных систем детекции позволяет обойтись без теплового демаскирования и получить результаты высокого качества с меньшими временными затратами. Если есть подозрение, что фиксация объектов производилась не в оптимальном режиме (длительная фиксация в растворе формалина, приготовленного «на глаз», и т. п.), обязательно тепловое демаскирование.

Эффективность процедуры теплового демаскирования антигенов удобно контролировать, параллельно с изучаемой серией предметных стекол производя обработку положительного контроля, в котором имеются пролиферирующие клетки (любой лимфатический узел и т. п.). После демаскирования на этом препарате необходимо поставить реакцию, выявляющую пролиферативный маркер – антиген Ki-67. Для его определения следует использовать моноклональные антитела MIB-1 (ткани человека) и MIB-5 (ткани крысы). В случае, когда демаскировка антигенов проведена неправильно, пролиферативные маркеры в положительном контроле не будут обнаружены. Наш опыт показывает, что для оценки эффективности демаскирования подходящим антигеном является виментин (Кирик О. В. [и др.], 2012). Особенно удобно использовать при этом моноклональные мышиные антитела клона V9 и учитывать эффективность демаскирования виментина в составе эндотелия мелких кровеносных сосудов и капилляров. Удобство этой реакции обусловлено в первую очередь тем, что кровеносные сосуды присутствуют в большинстве подвергаемых иммуноцитохимическому исследованию объектов. Таким образом, эндотелий кровеносных сосудов будет выполнять функцию внутреннего положительного индикатора, подтверждающего эффективность теплового демаскирования.

Более полно оценить возможности использования методов теплового демаскирования для конкретных антител можно, проводя предварительную проверку материала положительного контроля на способность к детекции присутствующего в нем антигена после теплового демаскирования, выполненного при разных режимах с использованием различных буферных систем. Для этих целей D. J. Dabbs (2006) рекомендует использовать трис-солянокислый буфер в трех вариантах (I – pH = 1-2; II – pH = 7 – 8; III – pH = = 10 – 11). На наш взгляд, использование различных температурных режимов не имеет особого смысла, поскольку все варианты высокотемпературной инкубации позволяют получать эквивалентные результаты. Напротив, изменение времени инкубации при стандартной температуре (95 °C – при использовании водяной бани, 99 °C – пароварки, 100 °C – микроволновой печи, 120 °C – автоклава) помогает определить, нуждается ли материал в продолжительном демаскировании (например, при выявлении антигена Ki-67 моноклональными антителами клона Ki-67).

5.4. Протеолитическое демаскирование антигенов

Метод протеолитического демаскирования антигенов получил большое распространение до появления методов теплового демаскирования антигенов, в настоящее время он утратил свое значение, но все же используется для демаскировки отдельных антигенов (Huang S. N., 1975). Этот метод основан на способности протеолитических ферментов разрывать перекрестные сшивки между белками, образовавшиеся при фиксирующем действии альдегидов. Антигенные детерминанты, скрытые при фиксации, вновь оказываются доступными для взаимодействия с антителами.

Для протеолитического демаскирования обычно применяют трипсин (реже – химотрипсин, протеазу, пепсин и др.). О желательности проведения протеолитического демаскирования, как правило, говорится в аннотации к первичным антителам. Следует отметить, что после использования коагулирующих фиксаторов (этанола, метанола) нежелательно применять протеолитическое демаскирование антигенов, так как это может привести к разрушению срезов.

Для обеспечения лучшей сохранности срезов при протеолитическом демаскировании для их наклейки следует использовать специ альные предметные стекла с повышенными адгезионными свойствами (SuperFrost+ или стекла, покрытые аминоалкилсиланом).

Протеолиз проводят после блокировки эндогенной пероксидазы. Для этого препараты после промывки в буфере помещают в 0,05 – 0,10 % водный раствор фермента на 0,5 – 10,0 мин при температуре 37 °C. Для трипсина и протеазы рН раствора следует довести до 7,8 при помощи 0,1 М NaOH.

Недостатками протеолитического демаскирования являются возможность развития неспецифической реакции при незначительном увеличении продолжительности инкубации срезов в растворе фермента, необходимость индивидуального подбора параметров процедуры с учетом различных материалов и разных условий фиксации. Кроме того, существует проблема подбора оптимальных условий протеолиза при работе с разными антителами. По мнению ряда исследователей (Leong A. S. [et al.], 1988 и др.), этот способ демаскирования недостаточно эффективен. Несмотря на вытеснение метода протеолитического демаскирования другими способами повышения чувствительности ИГХ-реакций, он сохраняет свое значение для ряда антигенов. Так, его рекомендуется использовать при выявлении иммуноглобулинов и компонентов комплемента в почечных биоптатах, фиксированных в формалине (Bancroft J. D. [et al.], 2002).

Раствор трипсина для протеолитического демаскирования антигенов (Эллиниди В. Н. [и др.], 2002).

1-й вариант. 100 мл дистиллированной воды прогреть и добавить 100 мл чистого трис-HCl-буфера, добавить 100 мг CaCl₂, размешать и поставить в термостат (+37 °C) на 15 мин. Перед самой реакцией добавить 100 мг трипсина.

2-й вариант. 0,1 % трипсин в 0,1 % водном растворе CaCl₂ (доводят до рН 7,8 с помощью 0,1 % NaOH или 2 % HCl).

Литература

Кирик О. В., Коржевский Д. Э. Виментин в клетках эпендимы и субвентрикулярной пролиферативной зоны конечного мозга крысы // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2012. – № 4. – С.210 – 214.

Коржевский Д. Э., Юмкина Е. А. Применение методов демаскирования антигенов на парафиновых срезах головного мозга крысы // Морфология. – 2005. – Т. 127, № 2. – C. 76 – 77.

Сухорукова Е. Г., Захряпин М. С., Аничков Н. М. [и др.]. Выявление микроглии в препаратах головного мозга, длительное время хранившихся в растворе формалина // Морфология. – 2012. – Т. 142, № 5. – С. 68 – 71.

Bancroft J. D., Gamble M. Theory and practice of histological techniques. – Edinburgh; London; N.Y.: Churchill Livingstone, 2002. – 796 p.

Dabbs D. J. Diagnostic Immunohistochemistry. – Philadelphia: Churchill Livingstone, Elsevier, 2006. – 817 p.

Evers P., Uylings H. B., Suurmeijer A. J. Antigen retrieval in formaldehyde-fixed human brain tissue // Methods. – 1998. – Vol. 15, № 2. – P. 133 – 140.

Fraenkel-Conrat H., Brandon B. A., Olcott H. S. The reaction formaldehyde with proteins. IV: Participation of indole groups // J. Biol. Chem. – 1947. – Vol. 168, № 1. – P. 99 – 118.

Fraenkel-Conrat H., Olcott H. S. Reaction of formaldehyde with proteins. VI: Cross-linking of amino groups with phenol, imidazole, or indole groups // J. Biol. Chem. – 1948. – Vol. 174, № 3. – P. 827 – 843.

Huang S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis В core and surface antigens in paraffin sections // Lab. Invest. – 1975. – Vol. 33, № 1. – P. 88 – 95.

Jessup E. Antigen retrieval techniques for the demonstration immunoglobulin light chains in formalin-fixed paraffin embedded sections // UK NEQUAS Newsletter. – 1994. – Vol. 4. – P. 12 – 16.

Leong A. S., Milios J., Duncis C. G. Antigen preservation in microwave-irradiated tissues: A comparison with formaldehyde fixation // J. Pathol. – 1988. – Vol. 156, № 4. – P. 275 – 282.

Shi S. R., Cote C., Kalra K. L. [et al.]. A technique for retrieving antigens in formalin-fixed, routinely acid-decalcified celloidin-embedded human temporal bone sections for immunohistochemistry // J. Histochem. Cytochem. – 1992. – Vol. 40, № 6. – P. 787 – 792.

Shi S. R., Tandon A. K., Cote C. [et al.]. S-100 protein in human inner ear: Use of a novel immunohistochemical technique on routinely processed, celloidin-embedded human temporal bone sections // Laryngoscope. – 1992. – Vol. 102, № 7. – P. 734 – 738.

Shi S. R., Key M. E., Kalra K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: An enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections // J. Histochem. and Cytochem. – 1991a. – Vol. 39, № 6. – P. 741 – 748.

Shi S. R., Tandon A. K., Haussmann R. R. [et al.]. Immunohistochemical study of intermediate filament proteins on routinely processed, celloidin-embedded human temporal bone sections by using a new technique for antigen retrieval // Acta Otolaryngol. – 1993b. – Vol. 113, № 1. – P. 48 – 54.

Taylor C. R., Shi S. R., Chen C. [et al.]. Comparative study of antigen retrieval heating methods: Microwave, microwave and pressure cooker, autoclave, and steamer // Biotech. Histochem. – 1996. – Vol. 71, № 5. – P. 263 – 270.