Текст книги "Стоматологические конструкционные материалы: патофизиологическое обоснование к оптимальному использованию при дентальной имплантации и протезировании."

Глава 2
Методология исследования

Работа выполнена на 96 крысах линии Вистар, массой 150–200 г. обоего пола и одинакового возраста, полученных из питомника Рапполово. До проведения экспериментов животные содержались в стандартных условиях вивария, получали соответствующее питание и уход.

Все мероприятия с животными проводились в надлежащих условиях в экспериментальной клинике животных ВМедА им. С.М. Кирова. Хирургические мероприятия проводились под общей анестезией с соблюдением правил и требований, предъявляемых к оборудованию, инструментарию, асептике и антисептике, в соответствии с ныне действующими «Правилами произведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Министра здравоохранения № 755 от 12 августа 1977 г.).

Выведение животных из опыта проводилось методом передозировки эфирного наркоза через дыхательные пути.

Для обоснования и разработки оптимальных условий применения различных типов стоматологических материалов было выполнено исследование местной реакции подкожной соединительной ткани, ткани внутренних органов (печени) на внедрение в подкожную соединительную ткань пластмассовых и металлических имплантатов.

2.1. Методика хирургического внедрения пластмассовых и металлических имплантатов в подкожную соединительную ткань

Анестезию экспериментальных животных выполняли наркотизацией эфиром через дыхательные пути. Такой способ наркотизации обеспечивал возможность безболезненного проведения хирургических мероприятий, в достаточной степени обездвиживал животных, позволял быстро и достаточно легко выйти из наркоза и вернуться к нормальному функционированию. Кроме того, использование данного способа анестезии практически полностью исключало возможность летальных исходов от передозировки или индивидуальной повышенной чувствительности животных к наркозу, т. к. позволяло визуально контролировать их состояние и глубину наркоза. По достижении достаточной глубины наркоза животных фиксировали в специальном станке, оборудованном крепежной планкой для дополнительного обездвиживания. Шерсть в области оперативного вмешательства выстригали ножницами, затем выбривали, что позволяло уменьшить вероятность нанесения поверхностных ссадин на коже.

На боковой поверхности животного проводили разрез длиной 1–1,5 см, захватывающий кожу и в незначительной степени подкожную жировую клетчатку и рыхлую соединительную ткань. Аккуратно раздвигали прослойки рыхлой волокнистой ткани, стараясь при этом минимально повредить ее целостность. В полость раны помещали имплантат, предварительно простерилизованный, с таким расчетом, чтобы он был со всех сторон окружен мягкими тканями. Ткань зашивали, поверхность кожи обрабатывали раствором 1 % бриллиантового зеленого. Антибактериальной терапии в послеоперационный период не проводили.

Животных на весь период эксперимента помещали в отдельные клетки, где за ними осуществлялся уход и наблюдение. Уже через 20-З0 минут после окончания хирургических мероприятий животные легко выходили из наркотического состояния, проявляя стандартные поведенческие реакции.

Летальных исходов использованный способ наркотизирования и хирургического вмешательства не вызывали.

В течение всего периода послеоперационных наблюдений визуальных признаков развития воспалительного процесса ни у одного животного обнаружено не было.

В качестве контроля были использованы интактные крысы (группа 1 контроля) и животные, которым при стандартных условиях, одновременно с экспериментальными животными, была сделана ложная операция, во время которой в полость раны ничего не помещалось (группа 2 контроля).

Выведение животных из опыта проводили в различные сроки от 12 часов до 12 месяцев (в том числе на 1, З, 5 и 7-е сутки).

Необходимо отметить, что зафиксировать образцы пластмассы или металла в полости рта крыс невозможно. Подшивание образцов хирургическим шелком к слизистой оболочке в связи с анатомическими особенностями полости рта крысы может быть осуществлено только с помощью очень тонкого шелка (№ 0 или 1), из-за чего образцы отрываются и утрачиваются уже в первые часы эксперимента.

2.2. Методы светооптического изучения экспериментального материала

Для изучения местной реакции на имплантаты фрагменты ткани, взятые в непосредственной близости от имплантата, помещали в 10 %-й нейтральный забуференный формалин на несколько суток. Затем несколько часов промывали в холодной проточной водопроводной воде и обезвоживали в порциях этилового спирта возрастающей концентрации. Помещали материал (кусочки соединительнотканной капсулы) в смесь 100 %-го спирта с хлороформом. Затем в смеси хлороформа и парафина исследуемую ткань выдерживали ночь в термостате при +37 °C, пропитывали в двух порциях чистого парафина при +62 °C по 2 часа в каждой, после чего кусочки заливали в новую порцию парафина.

Срезы толщиной 5–7 мкм размещали на специально подготовленных обезжиренных стеклах и депарафинировали. После обезвоживания в 80 %-м этаноле выдерживали 12 часов в термостате при +37 °C и окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизон и заключали под покровное стекло для дальнейшего изучения и фотографирования.

Кроме описанного выше метода, для изучения общей картины развития патологического процесса использовали полутонкие срезы с блоков ткани, залитой в смолу аралдит по электронно-микроскопической методике. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм, полученные с этих блоков на ультрамикротоме Ultracut E (Reichert), окрашивали 1 %-м раствором метиленового синего или толуидинового синего.

Просмотр и фотографирование срезов при различных увеличениях производили в светооптическом микроскопе фирмы OPTON при различных увеличениях объектива и окуляра.

2.3. Электронная микроскопия

Электронная микроскопия была использована в данной работе в качестве основного метода исследования. Это связано с тем, что данный метод является исключительно чувствительным для выявления патологических процессов в организме. Возникающие изменения удается обнаружить на уровне отдельных клеток, причем еще на доклинической стадии.

Для достижения оптимальной фиксации материала нами была разработана методика введения фиксирующего раствора шприцем с инъекционной иглой предварительно наркотизированному животному в подкожную соединительную ткань в оперированной области до вскрытия кожных покровов над имплантантом и вычленения материала образовывавшихся вокруг имплантата грануляционной ткани или соединительнотканной капсулы. Такой прием позволял обеспечить более раннее начало процесса фиксации ткани, избежать развития клеточной гипоксии во время взятия материала и его подсыхания, что неизбежно исказило бы результаты электронно-микроскопического анализа состояния ткани, создав дополнительные артефактные изменения в ультраструктуре клеток.

Затем ткань вокруг имплантата иссекали и помещали в охлажденный фиксирующий раствор, состоящий из 2,5 %-го раствора глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере (рН 7,4). Через 2–4 часа материал трижды промывали холодным 0,1 М какодилатным буфером (рН 7,4) по 5-10 мин. в каждой порции. Дофиксация материала осуществлялась 1 %-м раствором четырехокиси осмия на 0,1 М какодилатном буфере 1,5 часа. После 3 кратного промывания буфером по 5 мин. в каждой порции ткань обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации. Первое контрастирование материала проводили в блоках ткани в 3 % растворе уранилацетата на 70 % этаноле не менее 12 часов. Затем осуществляли окончательное обезвоживание в 96 % и 100 % спиртах. Пропитка и заливка материала в аралдитовые смолы осуществлялась по стандартной схеме.

Для предварительной оценки повреждений и выбора необходимого участка использовали полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашенные раствором метиленового синего.

Ультратонкие срезы толщиной 70–80 нм получали на ультратоме Ultracut Е, контрастировали растворами уранилацетата 20 мин. и цитрата свинца 2–5 мин. при комнатной температуре. Просмотр и фотосъемку ультратонких срезов проводили в электронном микроскопе Hitachi 11 E (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Общая характеристика использованного для работы материала представлена в табл. 3.

Таблица 3

Общая характеристика экспериментальных данных

2.4. Материалы и методы клинических исследований

С целью решения поставленных в работе целей и задач, весь клинический материал был разбит на три большие подгруппы. Характеристики подгрупп приведены ниже в табл. 4.

Таблица 4

Характеристика подгрупп клинических исследований

* – третья группа клинического наблюдения подразделялась на три подгруппы:

Подгруппа А из 32 человек. В этой подгруппе работы проводились в условиях прямого контакта пластмассовых коронок (акриловых пластмасс) с тканями ротовой полости. В тактике лечения таких больных использовали установку временных пластиковых коронок из акриловых пластмасс с погружением их под десну;

Подгруппа Б из 18 человек. В этой подгруппе основной тактикой было установление временных пластмассовых коронок на стальной абатман с зазором до десневого края до 1 мм.

Подгруппа В из 24 человек. В этой подгруппе применялась тактика лечения без использования временных коронок, то есть после установки титановых имплантатов сразу проводили ушивание десны.

Согласно данным табл. 4 в первой подгруппе нами было обследовано 256 больных с различными проявлениями на слизистой оболочке полости рта и десен признаков протезных стоматитов после протезирования съемными и несъемными протезами.

В этой подгруппе сведения об общих и местных реакциях в полости рта после зубного протезирования обобщались по 13 подгруппам параметров, среди которых выделялись признаки протезного стоматита, глоссалгии, гипосаливации, гиперсаливации, хронического гингивита, аллергических реакций (ринит), хейлита, а также такие общие проявления как обострение заболеваний печени, неврастения, извращение вкусовой чувствительности и другие заболевания.

Анализ проводился в динамике в течение года после окончательного протезирования.

Во второй подгруппе на основании динамического наблюдения за клиническими и рентгенологическими признаками у 256 больных, оценивались проявления периимплантита.

При этом обращали внимание на шесть его базовых признаков: чувство дискомфорта, болевые признаки, состояние и окраску слизистой, наличие свищевых ходов, состояние импланто-десневого кармана, и, наконец, динамику резорбции костной ткани или лизиса костной ткани вокруг имплантата.

И, наконец, в третье подгруппе, включавшей 74 случая, оценивались результаты поиска оптимизации тактики и стратегии различных подходов к лечению сложных форм зубной патологии при имплантации современных систем.

Мы апробировали преимущественно три тактики ведения таких больных:

А-тактика: использовали установку временных пластиковых коронок из акриловых пластмасс с погружением их под десну сроком до полугода и более.

Б-тактика: использовали установку временных пластмассовых коронок на стальной абатман с зазором до десневого края до 1 мм.

В-тактика: тактика лечения без использования временных коронок, то есть после установки титановых имплантов сразу проводилось ушивание десны.

Динамику состояния слизистой (при осмотре) и кости (с помощью ренгенографического динамического наблюдения) проводили ежемесячно как перед началом и в ходе лечения, так и после окончательного протезирования сроком до 1 года.

2.5. Статистическая обработка результатов

Воспаление, уровень фибробластической и ангиобластической пролиферации, а также фиброз ткани, окружающей имплантаты, подсчитывали в каждой экспериментальной и контрольной группе животных во все сроки наблюдения. При этом оценивали наличие или отсутствие признака и его интенсивность в баллах:

0 – отсутствие данного признака

1 – незначительная степень проявления признака

2 – средняя степень проявления признака

3 – максимальная степень проявления признака

При статистической обработке данных, полученных в результате работы, пользовались методом непараметрической статистики. Подсчитывали среднюю величину и полуамплитуду отклонений. Для оценки достоверности различий количественных данных использовали t– критерий Стьюдента. Значимыми считали различия при Р (меньше) 0,05.

Глава 3
Организация изученных биологических тканей в норме

Для изучения возможной токсичности используемых в дентологической практике материалов – базисных пластмасс, металлов, металлических сплавов – изучали реакцию элементов рыхлой соединительной ткани, непосредственно контактирующей с имплантатами, и гепатоцитов печени на их подкожную имплантацию. Для оценки значимости обнаруженных изменений необходимо коротко остановиться на особенностях интактной организации изученных тканей

3.1. Интактная структура подкожной рыхлой соединительной ткани

Основными компонентами соединительной ткани, оправдывающими ее название, являются волокнистые структуры коллагенового и эластического типа, интегративно-буферная метаболическая среда (основное вещество) и клеточные элементы, создающие и поддерживающие количественное соотношение неклеточных компонентов. Основными клетками соединительной ткани являются фибробласты (фибриллообразующие клетки), макрофаги (фагоцитирующие клетки), тучные клетки (тканевые базофилы), плазматические и адвентициальные клетки. В соединительной ткани каждого конкретного органа имеются стволовые клетки, которые дают начало камбиальным соединительнотканным клеткам (полустволовым клеткам-предшественникам).

Фибробласты – это клетки, синтезирующие компоненты внеклеточного матрикса: белки (коллаген, эластин), фибронектин, протеогликаны, выделяющие их во внеклеточное пространство. Различают малодифференцированные, дифференцированные фибробласты (зрелые, активно функционирующие), фиброциты (дефинитивные формы клеток), а также миофибробласты и фиброкласты. С деятельностью фибробластов связано образование основного вещества и волокон, формирование соединительнотканных оболочек, капсулы вокруг инородного тела, заживление ран, развитие рубцовой ткани и др. [Афанасьев Ю., 1989; Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Юрина Н.А., Радостина А.И., 1990]. Малодифференцированные, «юные» фибробласты – малоотростчатые клетки с овальным или округлым ядром и небольшим ядрышком, базофильной цитоплазмой, богатой РНК (рис. 1).

Размер клеток не превышает 20–25 мкм. В цитоплазме обнаруживается большое количество свободных рибосом. Шероховатый эндоплазматический ретикулум и митохондрии развиты слабо.

Комплекс Гольджи представлен скоплениями коротких трубочек и пузырьков, расположенных главным образом, по полюсам клетки около ядра. На этой стадии развития фибробласты обладают очень низким уровнем синтеза и секреции белка.

Рис. 1. Малодифференцированные «юные» фибробласты соединительной ткани. Электронограмма. Ув. 10 000. Малодифференцированные фибробласты способны к размножению митотическим путем. Они могут возникать также из клеток-предшественников. Полагают, что существуют две популяции фибробластов – короткоживущие (несколько недель) и долгоживущие (несколько месяцев)

Зрелые фибробласты крупнее и в распластанном виде на пленочных препаратах могут достигать 40–50 мкм и более. Это активно функционирующие клетки (рис. 2). Ядра у них светлые, овальные, содержат 1–2 крупных ядрышка. Цитоплазма слабо базофильна, содержит хорошо развитую гранулярную эндоплазматическую сеть (ГЭС), которая местами контактирует с цитолеммой. Комплекс Гольджи в виде цистерн и пузырьков распределен по всей клетке. Митохондрии и лизосомы развиты умеренно. Биосинтез веществ, необходимых для формирования волокон и основного вещества, осуществляется довольно интенсивно, особенно в условиях пониженной концентрации кислорода. Клеточная поверхность фибробластов является важной рецепторной зоной, которая опосредует воздействие различных регуляторных факторов. Активизация фибробластов сопровождается накоплением гликогена и повышенной активностью гидролитических ферментов и ферментов гликолитических процессов.

Фиброциты – дефинитивные формы фибробластов. Они имеют веретеновидную форму и крыловидные отростки. Содержат небольшое число органелл, вакуолей, липидов и гликогена. Синтез коллагена и других веществ у этих клеток резко снижен.

Рис. 2. Зрелые активно функционирующие фибробласты соединительной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400

Установлено, что фибробласты могут превращаться в миобласты, функционально сходные с гладкомышечными клетками, но в отличие от последних имеющие хорошо развитую ГЭС. Они наблюдаются в грануляционной ткани в условиях раневого процесса.

Фиброкласты – клетки с более высокой фагоцитарной и гидролитической активностью, принимающие участие в «рассасывании» межклеточного вещества. Они сочетают в себе структурные признаки фибриллообразующих клеток (развитую ГЭС, комплекс Гольджи, относительно крупные, но немногочисленные митохондрии), а также лизосомы, с характерными для них гидролитическими ферментами (рис. 3).

Фибробласты в процессе жизнедеятельности выделяют ряд факторов, обеспечивающих как регуляцию своей популяции и функции, так и взаимодействие с другими клетками (макрофагами, лимфоцитами).

Макрофаги образуют перемещающуюся специализированную клеточную популяцию защитной системы организма. Защитная функция макрофагов проявляется в форме поглощения и дальнейшего расщепления или изоляции чужеродного материала, в обезвреживании его при непосредственном контакте, в передаче информации о чужеродном материале иммунокомпетентным клеткам, способным его нейтрализовать, в оказании стимулирующего воздействия на другую клеточную популяцию защитной системы организма. Важная роль принадлежит вырабатываемым ими медиаторам (Карр, 1978).

Выделяют две группы макрофагов: свободные и фиксированные. Каждая группа представлена несколькими разновидностями. К свободным относят макрофаги рыхлой соединительной ткани, или гистиоциты (рис. 4), макрофаги воспалительных экссудатов и макрофаги печени (купферовские клетки). Размер и форма макрофагов варьируют в связи с их функциональным состоянием. Встречаются клетки уплощенные, округлые, вытянутые и неправильной формы. Наиболее характерной особенностью макрофага является наличие различного рода выростов цитоплазмы, с помощью которых эти клетки захватывают инородные частицы. Число отростков значительно увеличивается у активированных клеток. На плазмолемме находятся многочисленные рецепторы различных гормонов, биологически активных аминов, Т– и В – лимфоцитов, антигенов, иммуноглобулинов. Наличие рецепторов к иммуноглобулинам обусловливает участие макрофагов в иммунных реакциях.

Другим характерным морфологическим признаком макрофагов является присутствие в их цитоплазме значительного количества различных везикул, связанных с эндоцитозом и деградацией попавшего в клетку материала, лизосом всех видов, синтезирующих ферменты для внутриклеточного и внеклеточного расщепления чужеродного материала, антибактериальные и другие биологически активные вещества. В цитоплазме макрофагов умеренно развиты митохондрии, ГЭС, комплекс Гольджи. Ядра макрофагов небольшого размера, овальной или бобовидной формы.

Рис. 3. Фрагмент цитоплазмы фиброкласта – клетки с высокой фагоцитарной и гидролитической активностью. Электронограмма. Ув. х15 000

Рис. 4. Гистиоцит (макрофаг) рыхлой соединительной ткани. Электронограмма. Ув. х10 000

Рис. 5. Тучная клетка (стрелка). Цитоплазма заполнена большим количеством гранул. Рядом с клеткой располагается мелкий кровеносный сосуд. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х40010 мкм.

Рис. 6.: Плазматическая клетка, синтезирующая антитела. Цитоплазма заполнена гранулярным эндоплазматическим ретикулумом. Электронограмма. Ув. х10 000

Одной их разновидностей макрофагов являются многоядерные гигантские клетки, например, «гигантские клетки инородных тел». Это симпласты, содержащие 10–20 и более ядер, возникших либо путем слияния одноядерных макрофагов, либо путем деления ядер без разделения цитоплазмы на две клетки. В многоядерных гигантских клетках присутствует развитый синтетический и секреторный аппарат и обилие секреторных гранул. Цитолемма образует многочисленные складки. Кроме защитной функции, макрофаги принимают участие в поддержании гомеостаза. Клетки макрофагической системы представляют собой мощный защитный аппарат, принимающий участие как в общих, так и местных защитных реакциях организма.

Тучные клетки (тканевые базофилы) – специализированная клеточная популяция, участвующая в обеспечении локального гомеостаза соединительной ткани, поддержании отдельных параметров функциональных систем организма (свертываемость крови и др.), защитных реакций (воспаление) (рис. 5). Чаще всего они сопровождают мелкие кровеносные и лимфатические сосуды, встречаются вблизи желез, а также под эпителиальными пластами, в особенности под теми, которые чаще подвергаются антигенным воздействиям – под эпителием дыхательных путей, пищеварительного тракта и под эпидермисом. Форма тучных клеток разнообразна. Она может быть неправильной, овальной, веретенообразной, иногда с широкими короткими отростками. Размер клеток колеблется от 4 до 10 мкм.

Ядра сравнительно невелики, обычно округлой или овальной формы с плотно расположенным хроматином, более конденсированным по периферии. Митохондрии, комплекс Гольджи, ГЭС имеют обычное для этих органелл строение. В цитоплазме тучных клеток описано присутствие микрофиламентов под плазмолеммой, а также микротрубочек в перинуклеарных областях. Характерной чертой тучных клеток является наличие в их цитоплазме специфических крупных (0,З-1 мкм) метахроматически окрашивающихся гранул, которые занимают ее большую часть. Тинкториальные свойства гранул и их структура зависят от степени зрелости, функционального состояния, локализации тучной клетки. Зрелые гранулы более плотные и более гомогенные, а незрелые обладают большим полиморфизмом. Состав гранул определяет функциональные возможности тучных клеток. В основном, это биологически активные вещества, являющиеся медиаторами, с помощью которых тучные клетки влияют на свое микроокружение – на проницаемость сосудов микроциркуляторного русла и функции клеток соединительной ткани и крови.

Синтезирующийся и накапливающийся в тучных клетках гистамин и другие биологически активные вещества выделяются при самых различных воздействиях: физических (механическое раздражение, травма, холод и т. п.), химических (полимеры, нейромедиаторы и др.). Важнейшим из углеводных соединений тучных клеток является гепарин. Выделившись из тучных клеток, гепарин оказывает как общее, так и местное влияние. Он является антикоагулянтом прямого действия, т. е. действующим на факторы свертывания, находящиеся непосредственно в крови.

Плазматические клетки (плазмоциты) – представители группы иммуноцитов, синтезирующие и секретирующие иммуноглобулины (антитела) в ответ на появление в организме антигена. Форма зрелых плазмоцитов – округлая или овальная, размер 7-20 мкм. Ядра относительно небольшие, округлой или овальной формы, расположены в основном эксцентрично.

Рис. 7. Адвентициальная клетка (стрелка), расположенная в соединительной ткани подкожной жировой клетчатки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х400

Цитоплазма этих клеток базофильна. Базофилия цитоплазмы обусловлена хорошо развитой ГЭС, с многочисленными рибосомами на поверхности ее мембран и большим количеством мелких вакуолей (рис. 6). Для плазматических клеток характерна высокая скорость синтеза и секреции антител. Хорошо развитый секреторный аппарат позволяет синтезировать и секретировать несколько тысяч молекул иммуноглобулинов в секунду.

Адвентициальные клетки – это малодифференцированные клетки, сопровождающие кровеносные сосуды. Они имеют уплощенную или веретенообразную форму со слабо развитой базофильной цитоплазмой, овальным ядром (рис. 7). В процессе дифференцировки эти клетки могут превращаться, по-видимому, в фибробласты, миофибробласты и липоциты. Некоторые авторы считают их малодифференцированными клетками фибробластического ряда.

Межклеточное вещество соединительной ткани состоит из коллагеновых и эластических волокон, а так же основного вещества.