Читать книгу "Структурная биохимия"

4. (α + β) -Белки, в которых α-спирали и отрезки β-структуры не чередуются, а скорее группируются с себе подобными так, что часть молекулы приобретает пространственную укладку чисто α-спирального типа (тип 1, см. выше), другая – чисто β -типа (тип 2), нередко с элементами– (α / β) -структуры. К этому типу относится лизоцим куриного яйца.

Существуют также уникальные структуры.

Денатурация белка

Денатурацией называют существенное изменение вторичной и третичной структуры белка, т. е. нарушение, разупорядочение системы нековалентных взаимодействий, не затрагивающее его ковалентной структуры. Денатурация, как правило, сопровождается утратой белком функциональных свойств, его инактивацией. Однако инактивация сама по себе не может служить надежным критерием денатурации. К денатурации не следует относить конформационные переходы в белке, при которых одна кооперативная система нековалентных взаимодействий перестраивается в другую.

Принципиальная разница состоит в том, что в этом случае оба состояния упорядочены, тогда как характерным признаком денатурации является именно утрата упорядоченности, которая приводит к возрастанию энтропии системы. Однако встречаются, по-видимому, и случаи, когда белок претерпевает частичную денатурацию, например, вследствие утраты пространственной организации одним из образующих его доменов или нарушения системы нековалентных взаимодействий в каком-либо участке супервторичной структуры. Качественное рассмотрение показывает, что денатурация белка может быть вызвана действием ряда факторов.

По агентам воздействия выделяют два типа денатурации: физическая и химическая. Физическим денатурирующим агентом является температура. Так, повышение температуры приводит к возрастанию вклада энтропийного фактора, что обусловливает тепловую денатурацию, происходящую, как правило, скачкообразно. Температура денатурации белков различается и существенно зависит от других условий, например, многие белки заметно стабилизируются ионами кальция. Некоторые белки отличаются термостабильностью. Это особенно свойственно белкам термофильных организмов, адаптировавшихся к жизни при повышенных температурах. Например, протеолитический фермент, секретируемый термофильными бациллами, – термолизин – сохраняет активность до 80°С. Денатурация под действием температуры необратима, то есть при восстановлении оптимальной температуры белок не восстанавливает свою структуру.

Химическая денатурация происходит под воздействием на белок реагентов, нарушающих нековалентные взаимодействия, прежде всего систему водородных связей. Так как в составе третичной структуры белка существует несколько типов связей, и как следствие несколько механизмов.

Первый механизм – это конкуренция за водородные связи. Денатурирующий агент содержит частично положительные и отрицательные заряды, которые образуют водородные связи с группировками белка. И группировки в место связей между собой образуют связи с агентом и глобула распадается. Так действуют мочевина в больших концентрациях (6—8 М) гуанидин хлорид, гуанидин изотиоцианат.

Второй механизм – это изменение заряда групп. Это происходит при изменениях рН, при изменении рН среды группировки или протонируются, или депротонируются в результате взаимодействия между заряженными группировка разрушаются за счет изменения заряда, и как следствие молекула белка денатурирует. По этому механизму происходит денатурация с использованием кислот и щелочей.

Третий механизм – разрушение гидрофобного ядра. Так происходит денатурация с использованием органических растворителей. Органические растворители гидрофобные, и когда белок в них попадает уже поверхностные гидрофильные аминокислоты можно сказать «самоизолируются», тогда как гидрофобные аминокислоты ядра начинают взаимодействовать с растворителем, а не друг с другом, молекулу как будто выворачивает на изнанку. Но если правильно подобрать органический растворитель, то можно сохранить гидратную оболочку и тогда связи и среда белка не будут нарушены, и денатурация не произойдет, это позволяет использовать органические растворители для выделения и разделения белков.

Четвертый механизм совмещает в себе первый и третий. Заряженная группировка конкурирует за водородные связи, гидрофобная часть молекулы разрушает гидрофобные связи ядра. К таким агентам относя ионные детергенты, самый известный из них додецилсульфат натрия или (SDS), по такому же механизму осуществляют денатурацию мыла.

Ренатурация белка

Денатурацию белка в определенных условиях in vitro удается обратить, перейдя от развернутой полипептидной цепи к компактной глобуле, имеющей вполне определенную пространственную структуру. Этот процесс, называемый ренатурацией, моделирует, хотя и не в полной мере, свертывание полипептидной цепи в глобулу в ходе трансляции при биосинтезе белка. Как известно, пространственная структура белка определяется его первичной структурой. Известное соотношение один ген – один белок, в сущности, эквивалентно утверждению, что генетически детерминированной последовательности аминокислот достаточно, для того чтобы однозначно предопределить ее свертывание в свойственную тому или иному белку третичную структуру. Разумеется, в общем случае такое заключение справедливо лишь для условий, близких к существующим в данной клетке при биосинтезе данного белка, которые могут включать в себя определенный диапазон рН, присутствие некоторых ионов, например ионов кальция, а также кофакторов, присущих этому белку, например коферментов, гема и т. п.

При соблюдении указанных условий будет достигнуто рассмотренное выше соотношение факторов, от которого зависит стабильность белковой глобулы, т. е. создадутся термодинамические предпосылки формирования нативной структуры – ренатурации белка. Это положение было подтверждено успешными опытами по ренатурации белков in vitro, проведенными впервые К. Анфинсеном и сотрудниками в 60-х годах, на панкреатической рибонуклеазе и лизоциме, а затем и на ряде других объектов. Однако не для всех белков химическая денатурация обратима, многие белки ренатурировать не удается, скорей всего это связано с тем, что нет возможности создать полностью необходимые для сворачивания условия, или в природе есть факторы не учитываемые исследователем.

Установлено, что при формировании пространственной структуры белка in vivo полипептидная цепь не предоставлена сама себе, а взаимодействует с целым рядом специализированных белков, получивших название шаперонов, функция которых – обеспечить быстрое нахождение правильной пространственной структуры. Известен ряд семейств шаперонов, которых особенно много среди так называемых белков теплового шока. Последние названы так, потому что они синтезируются клетками в больших количествах в ответ на воздействия, неблагоприятные для эффективного свертывания третичной структуры белков, в частности на повышение температуры. Однако они образуются и действуют и в нормальных условиях. Одно из семейств шаперонов составляют так называемые стресс-белки 70 эукариотических клеток, имеющие молекулярную массу около 70 кДа. Они образуют комплексы с еще не завершившими свертывание полипептидными цепями, предотвращая их взаимодействие между собой и нежелательную агрегацию. Эти белки состоят из двух взаимодействующих между собой доменов. Один из доменов образует комплекс с участками развернутой полипептидной цепи, другой – связывает АТР и способен расщеплять его, являясь медленно действующей АТР-азой. При гидролизе АТР белок переходит в другое конформационное состояние и его комплекс с полипептидной цепью распадается. То есть шаперон не сворачивает правильно, а разворачивает неправильное, критерием является количество энергии, поступившей в систему при гидролизе АТФ, хватило для разворачивания значит свернуто не правильно, не хватило – правильно.

Полипептидные цепи белков, которые подлежат транспорту из цитоплазмы, за счет образования комплексов со стресс-белками 70 удерживаются в развернутом, наиболее приспособленном для переноса через мембрану состоянии. Продолжительность жизни таких комплексов задается, по-видимому, временем, требующимся для внутримолекулярного гидролиза АТР, связанного стресс-белками 70. Пока не ясно, катализируют ли эти белки непосредственно само образование вторичной или третичной структуры. Не исключено, что их роль ограничивается предотвращением нежелательных для этого процесса межмолекулярных взаимодействий, агрегации еще не свернутых полипептидных цепей. Еще одну группу широко распространенных белков, вовлеченных в формирование третичной структуры, составляют так называемые шаперонины – белки, кодируемые генами GroEL и GroES у E. coli. Белки GroEL образованы субъединицами с молекулярной массой около 60 кДа, которые формируют своеобразную четвертичную структуру, построенную из двух лежащих одно на другом колец по семь субъединиц в каждом. Предполагают, что частично свернутая полипептидная цепь располагается на поверхности такого кольца. Отдельные ее участки, связанные субъединицами шаперонина с различной прочностью, могут высвобождаться из комплекса и формировать свойственную им вторичную структуру, не встречая помех со стороны соседних участков или других полипептидных цепей, удерживаемых в связанном состоянии. В таких условиях формирование регулярных элементов вторичной структуры происходит как бы поочередно. По завершении этого процесса комплекс распадается, что зависит, как и в рассмотренном выше случае, от расщепления АТР, связанного GroEL-белком. Белки GroES с молекулярной массой 10 кДа ассоциируют с белком GroEL и каким-то образом регулируют его АТР-азную активность и, значит, время жизни комплекса.

Четвертичная структура белка

Четвертичной структурой называют размещение в пространстве взаимодействующих между собой субъединиц, образованных отдельными полипептидными цепями белка.

В формировании четвертичной структуры участвуют не пептидные цепи сами по себе, а глобулы, образованные каждой из этих цепей в отдельности. Таким образом, понятие четвертичной структуры относится к ансамблю глобул. Взаимодействие между последними достаточно сильно, так что ансамбль выступает как единая молекула, в то же время каждая из объединившихся глобул – субъединиц – сохраняет значительную автономию, как правило, выраженную гораздо ярче, чем автономия домена в рамках третичной структуры. Известны, однако, случаи, когда два или несколько полипептидов составляют единую глобулу. Как правило, это является следствием ограниченного протеолиза – локального расщепления на отдельные отрезки первоначально целостной полипептидной цепи, образовавшей глобулу по обычным правилам формирования третичной структуры. Такие белки, естественно, не следует относить к числу имеющих четвертичную структуру (Рисунок 77).

Примером может служить инсулин. Его мономер построен из двух пептидных цепей А и В, содержащих соответственно 21 и 30 аминокислотных остатков.

В некоторых белках полипептидная цепь образует при свертывании несколько глобул (доменов), между которыми устанавливается система нековалентных взаимодействий. Последующее протеолитическое разрезание участков цепи, соединяющих домены между собой, делает их вполне автономными, переводит в ранг субъединиц, формирующих четвертичную структуру. Иногда в литературе используют термин «агрегат» как синоним понятия «четвертичная структура», с чем трудно согласиться, поскольку последнее подразумевает весьма высокий уровень организации – объединение субъединиц в. молекулу, стабилизированную системой нековалентных взаимодействий. Точно так же нет оснований классифицировать, как четвертичную структуру надмолекулярные (например, мультиферментные) комплексы или протяженные структуры, такие, например, как оболочки фагов или белковые кристаллические тела включения в некоторых бациллах, хотя в механизме их образования немало общего с формированием четвертичной структуры.

Четвертичная структура – последний уровень в организации белковой молекулы, к тому же не обязательный – до половины известных белков ее не имеют. Граница между белками, имеющими четвертичную структуру и лишенными ее, не всегда вполне определенна. Некоторые белки сравнительно легко диссоциируют на субъединицы уже, в которой одна из субъединиц (С – каталическая) ответственна за собственно ферментную активность и катализирует перенос фосфата АТФ на белок, а другая является регуляторной (Е). В отсутствие циклического AMФ последняя связана с С-субъединицей в комплекс R – С и ингибирует ее. При образовании комплекса с цАМФ четвертичная структура распадается и С-субъединица оказывается способной фосфорилировать белковые субстраты. Ярким примером гетеромерного белка может служить РНК-полимераза. В гомомерных белках субъединицы одинаковы. С ними сходны и такие, строго говоря, гетеромерные белки, субъединицы которых не одинаковы, но достаточно сходны как по способу свертывания полипептидной цепи, так и функционально. Частоты, с которыми встречаются белки, построенные из двух, трех, четырех и т. д. субъединиц, весьма различны. Так, для более или менее случайной выборки из примерно 200 белков с молекулярной массой не более 300 кДа оказалось димеров 102, тетрамеров 58, гексамеров 23, тогда как тримеров только 9, пентамеров ни одного, октамеров 3. Таким образом, подавляющая часть белков, имеющих четвертичную структуру, приходится на димеры, тетрамеры и гексамеры, причем последние встречаются у белков с молекулярной массой, большей 100 кДа. Геометрия симметричных димеров очевидна. То же относится и к тримерам, которые весьма редки, однако встречаются в природе. В частности, они могут играть существенную роль при образовании трансмембранных каналов, поскольку своего рода пучок из трех субъединиц сам по себе образует внутренний канал. В тетрамерных белках субъединицы могут размещаться в вершинах квадрата, что встречается редко, или же занимать вершины тетраэдра. Последний тип четвертичной структуры, в котором каждая субъединица взаимодействует с тремя остальными с различной силой, а молекула в целом оказывается весьма компактной, наблюдается особенно часто.

Для гексамерных белков характерна октаэдрическая упаковка, гораздо реже встречаются плоские гексагональные структуры. Субъединицы, образующие симметричную четвертичную структуру, бывают идентичными, но могут и отличаться, будучи в то же время однотипными, эволюционно родственными белками, которые обладают одинаковым способом свертывания пептидной цепи в пространстве. В этих случаях формирование четвертичной структуры имеет характерные особенности. Если, например, тетрамерный белок образован структурно гомологичными однотипными субъединицами а и в то в зависимости от степени их отличия возможны две ситуации. Другие же наборы субъединиц нестабильны и практически не обнаруживаются. Типичным примером является лактатдегидрогеназа человека, построенная из четырех субъединиц. Последние могут быть двух типов: М– (от англ. muscle – мышечная) субъединица, преобладающая в гладких мышцах, и Н– (от англ. heart – сердечная) субъединица, преимущественно синтезируемая в сердечной мышце. Для лактатдегидрогеназы возможен следующий набор множественных форм: Н4, М3Н1, M2H2, M1H3, H4. Заметим, что множественные формы, различия между которыми обусловлены генетически, а не вызваны посттрансляционными модификациями или повреждением белка, принято называть изоформами.

Разница в первичной структуре субъединиц отражается на соотношении катионных и анионных групп, что приводит к различиям в заряде изоформ и позволяет легко разделить их методом электрофореза. Такой анализ изоферментного состава лактатдегидрогеназы крови позволяет следить за поступлением в кровь лактатдегидрогеназы некоторых органов, в частности сердца при развитии соответствующей патологии, Например при некрозе сердечной мышцы. В последнем случае возрастет содержание изоформ, обогащенных Н-субъединицей. Этот подход нашел применение в медицинской диагностике и биохимической генетике.

Учитывая, что четвертичная структура не является обязательной для функционирования белка, очень много белков функционируют без наличия четвертичной структуры, но у четвертичной структуры есть определенные преимущества:

Увеличение активностей с одной компактной структуре, то есть это можно назвать возникновение четвертичной структуры необходимым механизмом эволюции доменов, когда домены окончательно становятся автономными и превращаются в отдельные субъединицы. Данные комплексы позволяют быстро осуществлять различные последовательности реакций метаболитических процессов.

Возможность регуляции.

Взаимодействие с изменением активности. (кооперативность изменения конформации протомеров)

Для отдельных субъединиц олигомерных белков и белковой глобулы в целом также характерны кооперативные изменения конформации. Рассмотрим это на примере гемопротеинов гемоглобина и миоглобина. Миоглобин – мономерный белок, гемоглобин – состоит из 4 протомеров двух типов. Первичная структура протомеров гемоглобина типов α и β отличается примерно на половину остатков (из 141 и 147 соответственно). Еще сильнее отличается первичная структура миоглобина. В то же время вторичная и третичная структуры протомеров гемоглобина и миоглобина очень сходны, они выполняют сходные функции, в основе которых лежит способность обратимо связывать кислород. Простетическая группа этих белков – гем – представляет собой плоскую молекулу, содержащую 4 пирольных кольца и соединенный с ними атом железа.

Гем соединяется с белковой частью (глобином) гидрофобными связями между пиррольными циклами и гидрофобными радикалами аминокислот. Кроме того, имеется координационная связь между атомом железа и имидазольным кольцом одного из остатков гистидина в глобине. За счет еще одной координационной связи к атому железа может присоединяться молекула кислорода с образованием оксигемоглобина или оксимиоглобина. Валентность железа при этом не изменяется.

Рисунок 77. А – структура гема; Б – третичная структура миоглобина; В – четвертичная структура гемоглобина

Пиррольные кольца гема находятся в одной плоскости, в то время как атом железа выступает из этой плоскости. Присоединение кислорода «выпрямляет» молекулу гема: железо перемещается в плоскость пиррольных колец. Поскольку железо связано с остатком гистидина глобина, происходит перемещение участка цепи, то есть изменение конформации белка. Для миоглобина изменение конформации ограничивается единственной полипептидной цепью. В гемоглобине же имеется четыре протомера, каждый из которых содержит гем и может присоединять кислород:

Hb ↔ HbO₂ ↔ Hb (O₂) 2 ↔ Hb (O₂) 3 ↔ Hb (O₂) 4

Первая молекула кислорода изменяет конформацию протомера, к которому она присоединилась. Поскольку этот протомер соединен с тремя остальными, изменяется конформация и других протомеров (Рисунок 78). Это явление называют кооперативностью изменения конформации протомеров. Следствием изменения конформации после присоединения первой молекулы кислорода является увеличение сродства трех остальных протомеров к кислороду. Присоединение второй молекулы еще сильнее облегчает присоединение кислорода к оставшимся двум свободным гемам. Сродство гемоглобина к четвертой молекуле кислорода примерно в 300 раз больше, чем к первой. Вследствие этого график зависимости насыщения гемоглобина кислородом от парциального давления кислорода представляет собой не гиперболу, как в случае насыщения миоглобина, а S-образную кривую.

Гемоглобин присоединяет кислород из альвеолярного воздуха, где парциальное давление близко к 100 мм рт. ст., здесь насыщенность гемоглобина близка к 100%. Отдается кислород при парциальном давлении около 40 мм рт. ст., здесь насыщенность гемоглобина кислородом близка к 75%. Далее цикл повторяется. Из представленных кривых видно, что миоглобин не смог бы справиться с задачей: при обоих парциальных давлениях насыщенность белка к кислороду близка к 100%. Функция миоглобина – промежуточное звено транспорта кислорода к митохондриям (основным потребителям кислорода) и создание в мышцах некоторого запаса кислорода (главным образом имеет значение для ныряющих животных). Кооперативные изменения конформации протомеров – важнейший механизм регуляции, в частности для аллостерических ферментов. Кстати, на этом же примере можно отметить еще две особенности. Гем в составе гемоглобина и миоглобина обладает способностью высокоспецифично присоединять молекулу кислорода. Эта специфичность обусловлена отличным от структурной комплементарности механизмом, зависящим в основном от реакционной способности атома железа. Однако и в этом случае специфичность определяется влиянием полипептида. Гем в составе других гемопротеинов – цитохромов – не способен присоединять кислород и служит переносчиком электронов. В процессе принятия и передачи электрона валентность железа гема цитохромов меняется. Вторая особенность. Протомеры дезоксигемоглобина могут избирательно связываться с 2,3-дифосфоглицератом, содержащимся в эритроцитах, причем участок связывания дифосфоглицерата отличен от участка связывания кислорода. Дифосфоглицерат несет 5 отрицательных зарядов, распределенных между 5 атомами кислорода. Его молекула оказывается во впадине, образованной двумя β-субъединицами, где она взаимодействует сразу с 7 катионными группами этих цепей (α-аминогруппы Val-1, имидазольные кольца His-2 и His-143 обеих цепей и аминогруппа Lis-82 одной из цепей). Вследствие связывания происходит стабилизация дезоксиформы и снижение сродства к кислороду. В отсутствие дифосфоглицерата HbA насыщается кислородом на 50% при его парциальном давлении 12 мм рт. ст., в присутствии – при 50 мм рт. ст. Это типичный пример так называемого аллостерического («другое место») механизма регуляции активности белков. Возможность воздействия эффектора на структурно удаленный функциональный центр белка основана на способности четвертичной структуры отвечать на относительно слабые воздействия. Природа приспособилась подстраивать рассмотренный механизм к конкретным условиям существования организмов. У высокогорных лам, живущих в условиях дефицита кислорода His-2 заменен на аспарагин, не несущий положительного заряда. В фетальном гемоглобине His-143 заменен на серин. В обоих случаях результатом является меньшее сродство к дифосфоглицерату и, как следствие, большее сродство гемоглобина к кислороду. В первом случае это позволяет достигать нужного насыщения крови кислородом в условиях разряженного воздуха, во втором – «отбирать» плоду кислород из крови матери. С олигомерными белками сходны белки доменного строения. Они также содержат в значительной мере обособленные глобулы – домены, однако эти глобулы образованы одной и той же полипептидной цепью.

Рисунок 78. Кооперативное взаимодействие протеомеров. А– механизм связывания кислорода гемом; Б – график насыщения гемоглобина и миоглобина в зависимости от парциального давления кислорода

Пептидных перемычек между доменами может быть и две. Изложенные представления позволяют понять механизм точечных мутаций. Точечные мутации предполагают замену одного нуклеотида гена на другой с изменением кода и, следовательно, с заменой одной из аминокислот полипептида. Последствия этой замены могут быть самыми разными и зависят от:

1. Различий свойств R-групп (гидрофобность, заряд, размер, жесткость цепи, способности образовывать водородные или дисульфидные связи). В зависимости от этого может произойти (а может и не произойти) существенное изменение вторичной, третичной или четвертичной структуры.

2. «Ответственности» участка цепи, в котором произошла замена аминокислоты, – наиболее критическими являются активный центр и точки перегибов.

Замена только одной аминокислоты в 6-м положении полипептидной последовательности гемоглобина (глутамата на валин) приводит к тяжелому заболеванию – серповидноклеточной анемии. На поверхности глобулы появляется «липкий» гидрофобный участок, в результате дезоксигемоглобин А слипается и образует аномально длинные нитевидные агрегаты, которые и обуславливают серповидную форму эритроцитов. Физические характеристики белка как полимера полностью определяются его способностью формировать компактную глобулу, от особенностей которой зависит и олигомеризация многих белков. Химические и функциональные свойства белков зависят от специфических взаимодействий функциональных групп, сближенных в его пространственной структуре. Вследствие этого поведение этих групп коренным образом отличается от их реакционной способности в аминокислотах и небольших пептидах. Белок может функционировать, то есть выступать в роли фермента, структурного или транспортного белка, регулятора, токсина, ингибитора только потому, что он обладает вполне определенным пространственным строением молекулы гидрофобных радикалов.