Читать книгу "Структурная биохимия"

Каталитический центр

Размеры белков намного превышают размеры низкомолекулярных субстратов, в связи с чем возникло представление о том, что в катализе участвует лишь ограниченная область молекулы фермента. Эту область мы и называем каталитическим центром. Каталитический центр – это несколько аминокислотных остатков, формирующих особую часть белка, в которой происходит ферментативная реакция. Вначале было непонятно, почему молекулы ферментов столь велики, если только часть их структуры участвует в связывании субстрата и непосредственно в катализе. Однако, как показал анализ трехмерной структуры ферментов, с субстратом взаимодействует намного большая часть белковой молекулы, чем предполагалось ранее. Если еще учесть включение в работу ферментов аллостерических центров такого же размера не приходится удивляться объемности ферментов.

Связь фермента с субстратом

Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом. Благодаря такой «трехточечной фиксации» симметричная молекула может проявлять асимметрию. Чтобы это пояснить, представим область фермента, связывающую субстрат, как участок плоской поверхности (хотя, как мы вскоре увидим, субстратсвязывающая «площадка» фермента редко бывает плоской, а возможно, и не бывает совсем). Если молекула субстрата может подойти к этому участку только с одной стороны, и взаимодействовать могут только комплементарные структуры субстрата и фермента (в реальных ферментах оба этих условия соблюдаются), то молекула субстрата может связываться с ферментом единственным способом, даже если группы 1 и 3 идентичны. Перебирая мысленно все возможные пространственные ориентации молекулы субстрата, можно убедиться, что с тремя точками плоской поверхности (с одной и той же стороны) молекула может связаться только в одной ориентации. Отсюда следует, что группы 1 и 3, хотя они и идентичны, при связывании с ферментом становятся неэквивалентными из-за различия в их окружении. Химические изменения будут происходить только с группой 1, но не с группой 3 (или наоборот). Обобщая эти рассуждения, можно объяснить теперь, почему ферментативное восстановление оптически неактивного пирувата приводит к образованию именно L-, а не D, L-лактата. Именно такой способ присоединения обеспечивает специфичность фермента.

Рисунок 81. Механизм связывания минимум в 3-х точках

Специфичность ферментов

Специфичность ферментов – это способность фермента катализировать одну и только одну специфическую реакцию является, пожалуй, наиболее важным его свойством. Благодаря этому скорости специфических метаболических процессов могут регулироваться путем изменения каталитической активности специфических ферментов. Правда, многие ферменты катализируют реакции одного типа (перенос фосфата, окислительно-восстановительные реакции и т. д.), субстратами при этом является небольшое число структурно сходных соединений. Реакции с альтернативными субстратами происходят в тех случаях, когда эти субстраты присутствуют в высоких концентрациях. Протекают ли в живых организмах все реакции, возможные при участии данного фермента, зависит от относительной концентрации альтернативных субстратов в клетке и относительного сродства фермента к этим субстратам.

Оптическая специфичность ферментов

За исключением эпимераз (рацемаз), которые катализируют взаимопревращение оптических изомеров, ферменты в общем случае проявляют абсолютную оптическую специфичность, по крайней мере, по отношению к одному из участков молекулы субстрата. Так, ферменты гликолитического и прямого окислительного пути катализируют превращения только D-, но не L-фосфосахаров. За единичными исключениями (например, почечная оксидаза D-аминокислот) большинство ферментов млекопитающих катализирует превращение только L-изомеров аминокислот.

Оптическая специфичность может относиться как к фрагменту молекулы, так и к молекуле в целом. Иллюстрацией служит специфичность гликозидаз. Эти ферменты катализируют гидролиз гликозидных связей между сахаром и спиртовой группой: они высоко-специфичны как к сахарному фрагменту, так и к характеру гликозидной связи (α или β), но относительно неспецифичны к спиртовому фрагменту молекулы.

Группоспецифичность ферментов

Литические ферменты действуют на специфические химические группировки: гликозидазы – на гликозидные связи, пепсин и трипсин – на пептидные связи. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов – иначе их потребовалось бы намного больше.

Отдельные литические ферменты отличаются более высокой группоспецифичностью. Так, химотрипсин гидролизует преимущественно пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит ароматическим аминокислотам – фенилаланину, тирозину или триптофану. Карбоксипептидазы и аминопептидазы отщепляют аминокислоты по одной с карбоксильного или с амино-конца соответственно.

Некоторые оксидоредуктазы способны использовать в качестве акцепторов электронов и NAD+, и NADPH, но большая их часть использует только один из них. Обобщая, можно сказать, что оксидоредуктазы млекопитающих, которые участвуют в биосинтетических процессах (например, в синтезе жирных кислот или стероидов), обычно используют в качестве восстановителя NADPH, тогда как в катаболизме участвуют оксидоредуктазы использующие NADH.

Модель «ключ – замок»

Первоначальная модель каталитического центра, предложенная Эмилем Фишером, трактовала взаимодействие субстрата и фермента по аналогии с системой «ключ – замок». Эта модель, которую иногда называют моделью «жесткой матрицы», не утратила своего значения для понимания некоторых свойств ферментов, например их способности к строго определенному связыванию двух или большего числа субстратов, или для объяснения кинетики насыщения субстратом (Рисунок 82 А).

Рисунок 82. Модели взаимодействия фермента и субстрата. А-модель «ключ-замок», Б-модель индуцированного соответствия

Модель индуцированного соответствия

Недостатком модели Фишера является подразумеваемая в ней жесткость каталитического центра. Более общий характер имеет модель индуцированного соответствия (Рисунок 82 Б), предложенная Кошландом. Эта модель основывается на весьма убедительных экспериментальных данных. Ее существенной чертой является гибкость каталитического центра. В модели Фишера каталитический центр считается заранее подогнанным под форму молекулы субстрата. В модели же индуцированного соответствия субстрат индуцирует конформационные изменения фермента, и лишь в результате этих изменений аминокислотные остатки и другие группы фермента принимают пространственную ориентацию, необходимую для связывания субстрата и катализа. При этом другие аминокислотные остатки могут погрузиться в глубь молекулы фермента. Субстрат по мере сближения с ферментом индуцирует в последнем конформационные изменения, в результате которых соответствующие группы занимают положение, необходимое для связывания субстрата и для катализа. Одновременно меняется пространственное расположение других остатков – Lys и Met теперь оказываются сближенными. Аналоги субстрата тоже могут вызывать конформационные изменения, но не все из них являются «правильными». При связывании истинного субстрата (А) все группы занимают нужное положение. При связывании же аналога субстрата – более объемного или, наоборот, меньшего по размеру – индуцируется неправильное расположение этих групп.

Факторы, влияющие на каталитическую активность

В лабораторных условиях на скорость ферментативных реакций влияют следующие факторы:

концентрация фермента

концентрация субстрата,

температура,

рН,

присутствие ингибиторов.

Температура

В некотором ограниченном интервале температур скорость ферментативной реакции повышается с ростом температуры. Коэффициент, указывающий, во сколько раз повышается скорость реакции при повышении температуры на 10°, называется температурным коэффициентом и обозначается Q₁₀. Для многих биологических реакций при повышении температуры на 10° скорость удваивается (Q₁₀ = 2) и, аналогично, при понижении температуры на 100 уменьшается вдвое. Многие физиологические процессы (например, скорость сокращения изолированной сердечной мышцы) тоже характеризуются коэффициентом Q₁₀, близким к двум. Однако при некой оптимальной температуре скорость реакции максимальна. Повышение скорости реакции по мере приближения к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул. При дальнейшем повышении температуры кинетическая энергия молекулы фермента становится достаточной для разрыва связей, поддерживающих вторичную структуру фермента в нативном, каталитически активном состоянии (происходит тепловая денатурация фермента). Вторичная и третичная структура фермента разрушается, что сопровождается потерей каталитической активности. Денатурация фермента приводит к уменьшению скорости реакции из-за уменьшения концентрации фермента (катализатора).

Для большинства ферментов оптимальная температура равна или выше той температуры, при которой в норме находятся клетки. Для ферментов микроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию в природных горячих источниках, оптимальная температура может быть близка к точке кипения воды.

рН

Умеренные изменения рН оказывают влияние на ионное состояние фермента, а зачастую и субстрата. Как показывают измерения ферментативной активности при различных рН, оптимум активности находится обычно между рН 5,0 и 9,0. Вместе с тем отдельные ферменты, например пепсин, активны при значениях рН, лежащих далеко за пределами этого интервала.

Зависимость активности от рН определяется следующими факторами.

1. Денатурацией фермента при очень высоких или очень низких рН. При изменении рН ферменты могут претерпевать конформационные изменения. Для поддержания активной третичной или четвертичной структуры может оказаться необходимым присутствие определенного заряда на группе, удаленной от области связывания субстрата; именно такая ситуация наблюдается в случае гемоглобина. Если заряд этой группы изменится, могут произойти частичное развертывание белковой цепи, или, наоборот, компактизация молекулы, или же ее диссоциация на протомеры – во всех случаях с потерей активности.

2. Изменением величины заряда молекул субстрата или фермента. Активность фермента может изменяться в результате изменений либо его структуры, либо заряда функциональных остатков, участвующих в катализе или связывании субстрата. Рассмотрим для примера взаимодействие отрицательно заряженного фермента (Enz^-) с положительно заряженным субстратом (SH⁺). При низких рН происходит протонирование Enz^-, при высоких рН – депротонирование субстрата. Поскольку, взаимодействовать друг с другом могут только SH⁺ и Enz^-, при крайних значениях рН эффективная концентрация Enz^- или SH⁺ будет низкой, что приведет к снижению скорости реакции.

Концентрация фермента

Во многих случаях бывает недостаточно знать, что данный фермент присутствует в системе, нужна еще информация о его количестве. При определенных условиях скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента. Это бывает не всегда, что можно проиллюстрировать на примере прямой реакции, идущей в равновесных условиях. Даже если мы знаем, что прямая реакция действительно идет, нам будет казаться, что скорость ее равна нулю, поскольку с такой же скоростью идет и обратная реакция. Когда же ферментативная реакция только начинается, продукт еще практически отсутствует и обратная реакция не идет. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата соответствует его исходному количеству. Поэтому скорость в начале реакции, т. е. ее начальная скорость (г), будет прямо пропорциональна концентрации фермента [Enz].

Фермент является реактантом, который соединяется с субстратом, образуя фермент-субстратный комплекс Enz – S, распадающийся на свободный фермент и продукт Р. В простейшей форме можно записать

Таким образом, концентрация фермента не оказывает влияния на константу равновесия. Кeq не зависит от того, каким образом достигается равновесие – с участием фермента или без него (вспомним о величине ΔG°). Фермент меняет путь, по которому идет реакция, но не конечные (равновесные) концентрации реагентов и продуктов, от которых зависят Кeq и ΔG°.

Таким образом концентрация фермента оказывает влияние на скорость ферментативной реакции только на начальных этапах ферментативной реакции, следовательно данный механизм воздействия на скорость ферментативной реакции не эффективен, поэтому не используется. С другой стороны можно использовать малые количества ферментов для полного прохождения реакции.

Концентрация субстрата

При изучении зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата были рассмотрены ферментативные реакции, в которых имеется единственный субстрат и единственный продукт. Такая ситуация действительно наблюдается для некоторых ферментативных реакций, однако большинство из них протекает с участием двух и более субстратов и продуктов. Это, однако, нисколько не снижает ценности дальнейших рассуждений. То, что справедливо для одного субстрата, остается верным и для двух.

При увеличении концентрации субстрата [S] и сохранении всех остальных условий начальная скорость v (скорость, измеряемая в период, когда израсходована очень малая доля субстрата) будет повышаться до максимальной величины Кmах, после чего останется постоянной.

По мере повышения концентрации субстрата скорость будет расти до тех пор, пока не произойдет насыщения фермента субстратом. Измеренная в таких условиях начальная скорость уже не будет возрастать при дальнейшем повышении концентрации субстрата. Отметим, что субстрат обычно берут в значительном молярном избытке по отношению к ферменту. Например, если фермент с мол. массой 100000 взаимодействует с субстратом с мол. массой 100 и оба присутствуют в концентрации 1 мг/мл, то на каждый моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. Более реальными являются следующие величины:

[Enz] = 0,1 мкг/мл = 10^—9 М, [S] = 0,1 мг/мл = 10^—3 М,

т. е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет 10⁶.

Даже если [S] уменьшить в 100 раз, его концентрация все еще в 10000 раз будет превышать концентрацию фермента. В точках А и В в комплексе с субстратом находится лишь часть молекул фермента, хотя молекул субстрата намного больше, чем молекул фермента. Это происходит потому, что константа равновесия реакции Enz + S +± Enz – S (образование комплекса Enz – S) хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках А и В повышение или понижение [S] будет приводить к увеличению или уменьшению доли молекул Enz, связанных с S (т. е. доли молекул Enz – S), и v будет зависеть от [S]. В точке С практически все молекулы фермента связаны с субстратом, и дальнейшее повышение [S], хотя и повысит частоту столкновений Enz с S, не сможет привести к повышению скорости реакции – среди молекул фермента уже не будет таких, которые были бы свободны для реакции с субстратом.

Случай В представляет особый теоретический интерес, поскольку при этом ровно половина молекул фермента насыщена субстратом. Соответственно скорость равна половине максимальной скорости (V_mdJ2), достижимой при данной концентрации фермента.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Уравнение Михаэлиса – Ментен описывает зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ES-комплекс; константа скорости этого процесса – k₁. Судьба ES-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на Е и S с константой скорости k₂, либо подвергаться дальнейшему превращению, образуя продукт Р, с константой скорости k₃ (Рисунок 83—1). Постулируется, что продукт реакции Р не превращается в исходный субстрат S; это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта не достигает ощутимого количества.

Как связана скорость катализа с концентрацией субстрата и фермента и скоростями отдельных этапов реакции? Начнем с того, что скорость ферментативной реакции равна произведению концентрации комплекса ES на константу k₃ (Рисунок 83—2).

Выразим [ES] через известные величины. Скорости образования и распада ES (Рисунок 83—3,4).

Определим скорость катализа в стационарных условиях. Стационарные условия характеризуются тем, что концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрации исходных и конечных продуктов меняются. Это имеет место в том случае, когда скорость синтеза ES-комплекса оказывается равной скорости его распада. Если левые части равенств равны между собой, то равны и правые (Рисунок 83—5).

Преобразуем это уравнение (Рисунок 83—6).

Уравнение можно упростить, если ввести новую константу Км, называемую константой Михаэлиса (Рисунок 83—7).

Введем Км в уравнение (Рисунок 83—8).

Рассмотрим числитель в последнем выражении. Концентрация несвязанного субстрата [S] практически равна общей концентрации субстрата при условии, что концентрация фермента значительно ниже концентрации субстрата. Концентрация несвязанного фермента (Е) равна общей концентрации фермента Ет минус концентрация комплекса ES (Рисунок 83—9).

Подставим это выражение в уравнение (Рисунок 83—10).

Решение уравнения относительно [ES] дает (Рисунок 83—11) или (Рисунок 83—12).

Подставим это выражение в уравнение скорости реакции (Рисунок 83—13).

После преобразования получаем окончательный вариант уравнения Михаэлиса – Ментен (Рисунок 83—15).

Рисунок 83. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен

Графическое определение константы Михаэлиса Км

Концентрация субстрата, при которой скорость составляет половину максимальной, обозначается через Км и называется константой Михаэлиса. Ее можно определить из графика зависимости v от [S]. Обратите внимание, что Км имеет размерность молярной концентрации.

Рисунок 84. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (описывается уравнением Михаэлиса-Ментен)

Когда [S] приближается к Км, v становится весьма чувствительной к изменению [S]; в этой области фермент работает со скоростью, равной половине максимальной. Многие ферменты характеризуются такими значениями Км, которые примерно соответствуют физиологическим концентрациям их субстратов.

Уравнение Михаэлиса – Ментен описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации субстратов (Рисунок 84). Используя это уравнение, зависимость начальной скорости ферментативной реакции от [S] и Км можно проиллюстрировать на следующих конкретных примерах.

1. [S] много меньше Км (точка А).

В этом случае величину [S] в знаменателе можно опустить, и он будет практически равен Км. Отношение двух констант, Vmax и Км, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т. е. значительно меньше Км), начальная скорость v пропорциональна концентрации субстрата [S].

2. [S] много больше Км (точка С). В этом случае член Км в знаменателе можно опустить, т. е. Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей Kм начальная скорость v равна максимальной Vmax

3. [S] = Км (точка В). Это означает, что при концентрации субстрата, равной Км, начальная скорость реакции v составляет половину максимальной. Отсюда же следует способ оценки Км: надо экспериментально определить концентрацию субстрата, при которой начальная скорость равна половине максимальной.

Как видно из рисунка график, описываемый уравнением Михаэлиса-Ментен, является кривой, чтобы кривая была точной необходимо максимальное количество точек для ее построения, следовательно, необходимо множество замеров скорости реакции с разными концентрациями субстрата. Тогда как для построения прямой требуется всего 3—5 точек, следовательно 3—5 замеров, именно поэтому было проведено преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен (Рисунок 85, 86). График делается в обратных координатах 1/V и 1/ [S]. Для преобразования необходимо 1 разделить на уравнение:

Рисунок 85. Преобразование Лайнуивера-Бэрка

Как видно из преобразования, данное уравнение можно свести к уравнению прямой у = ах + b, где y = l/V; x = 1/ [S]. Данное преобразование по фамилиям авторов получило название – преобразование Лайнуивера-Бэрка.

Используя график Лайнуивера-Бэрка на практике для оценки Км, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в том случае, когда измерения проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [S], которые соответствуют равным интервалам по шкале обратных величин.

Рисунок 86. График преобразования Лайнуивера-Бэрка

Оценки Км имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих Км, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость (Vmах) будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Значение Км позволяет ориентироваться, какое количество субстрата следует добавить для определения Vmax. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при оценке действия ингибиторов.

С другой стороны Км связана с константой диссоциации фермент-субстратного комплекса то есть со сродством фермента к субстрату (Рисунок 87).

Рисунок 87. Соотношение между Км и Кd

Сродство фермента к субстрату равно величине, обратной константе диссоциации К комплекса Enz – S:

Иными словами, чем слабее выражена тенденция фермент-субстратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату. Мерой Kd может ориентировочно служить значение Км для данного фермента по отношению к его субстрату. Однако это возможно только в том случае, если справедливо допущение, использовавшееся при выводе уравнения Михаэлиса – Ментен. Оно состояло в том, что первая стадия ферментативной реакции идет быстро и при этом всегда на этой стадии поддерживается равновесие. Другими словами, скорость диссоциации Enz – S на Enz + S намного выше, чем скорость диссоциации на фермент – продукт: Из уравнения Михаэлиса – Ментен следует, что величина [S], при которой v = 1/2Vmax, равна

При этих условиях 1/KM =1/Кd и равно сродству фермента к субстрату. Если k2 + k-1 не равно k-1, то 1/Км даст заниженную оценку сродства.