Читать книгу "Структурная биохимия"

Липопротеины

Ряд липидов образует комплексы со специфическими белками; эти комплексы называют липопротеинами. В плазме крови имеются три основных класса липопротеинов плазмы, причем содержание липидов в них может составлять от 50 до 90%. Молекулы липидов и полипептидов в липопротеинах прочно связаны друг с другом, хотя и не образуют ковалентных связей. Липопротеины плазмы содержат полярные липиды и триацилглицеролы, а также холестерол, которые спрятаны внутри под оболочкой, образованной водорастворимыми, гидрофильными участками полипептидных цепей и полярными головами молекул фосфоглицеридов. Наличие внешней гидрофильной оболочки в липопротеидах делает эти богатые липидами структуры растворимыми в воде и хорошо приспособленными для транспорта липидов из тонкого кишечника в жировые депо и в различные ткани. Классификация липопротеидов плазмы крови основана на величине их плотности, которая в свою очередь зависит от содержания липидов. Чем выше содержание липидов, тем ниже плотность липопротеидов и тем больше скорость, с которой они движутся вверх, т. е. всплывают, во время центрифугирования плазмы крови при очень высоких скоростях вращения ротора.

Липопротеины низкой плотности содержат много липидов, а следовательно более гидрофобны, чем липопротеины большей плотности, именно поэтому они мало растворимы в плазме крови, и легко выпадают в осадок на стенках сосудов. Разрастание этих осадков приводит в уменьшению просвета сосудов, увеличению артериального давления, и как следствие увеличение риска инфарктов и инсультов. Таким образом, увеличение содержания в плазме крови липопротеинов низкой плотности является симптомом увеличения риска гипертонии, инфарктов и инсультов. Кроме липопротеидов трех классов, в плазме крови содержатся также хиломикроны (особенно после приема жирной пищи). Хиломикроны представляют собой капельки, состоящие практически из чистых триацилглицеролов, окруженных очень тонким слоем белков. По размеру они значительно больше липопротеидов. Хиломикроны переносят триацилглицеролы из тонкого кишечника, где они всасываются во время пищеварения, в жировые депо. Многочисленные факты позволяют предположить, что высокое содержание в плазме липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) при низком содержании липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) является важным фактором возникновения атеросклероза – заболевания, протекающего с образованием обильных отложений холестерола и его эфиров.

Мембраны

Термин «мембрана» используется вот уже более 100 лет для обозначения клеточной границы, служащей, с одной стороны, барьером между содержимым клетки и внешней средой, а с другой – полупроницаемой перегородкой, через которую могут проходить вода и некоторые из растворенных в ней веществ. В 1851 г. немецкий физиолог X. фон Мол описал плазмолиз клеток растений, предположив, что клеточные стенки функционируют как мембраны. В 1855 г. ботаник К. фон Негели наблюдал различия в проникновении пигментов в поврежденные и неповрежденные растительные клетки и исследовал клеточную границу, которой он дал название плазматическая мембрана. Он предположил, что клеточная граница ответственна за осмотические свойства клеток. В 1877 г. немецкий ботаник В. Пфеффер опубликовал свой труд «Исследование осмоса», где постулировал существование клеточных мембран, основываясь на сходстве между клетками и осмометрами, имеющими искусственные полупроницаемые мембраны.

В 80-х годах прошлого столетия датский ботаник X. де Фриз продолжил осмометрические исследования растительных клеток, предположив, что неповрежденный слой протоплазмы между плазмалеммой и тонопластом функционирует как мембрана. Его исследования послужили фундаментом при создании физико-химических теорий осмотического давления и электролитической диссоциации голландцем Я. Вант-Гоффом и шведским ученым С. Аррениусом. В 1890 г. немецкий физико-химик и философ В. Оствальд обратил внимание на возможную роль мембран в биоэлектрических процессах.

Между 1895 и 1902 годами Э. Овертон измерил проницаемость клеточной мембраны для большого числа соединений и наглядно показал зависимость между растворимостью этих соединений в липидах и способностью их проникать через мембраны. Он предположил, что мембрана имеет липидную природу и содержит холестерин и другие липиды. Современные представления о строении мембран как подвижных липопротеиновых ансамблей были сформулированы в начале 70-х годов нашего столетия. Быстрое развитие биоорганической химии мембран и, прежде всего, широкое исследование структуры мембранных белков и липидов во многом обусловили прогресс в познании важнейших функций биомембран, таких, как транспорт различных метаболитов, генерация энергии, взаимодействие клеток и их деление, передача нервного возбуждения, рецепция сигналов внешней среды и т. п.

Рисунок 53. Структура А-мицеллы, Б-монослоя, В-бислоя. Водная среда обозначена серым цветом.

Как и мыла, полярные липиды обладают амфипатическими свойствами. При взбалтывании в воде или водных растворах полярные липиды спонтанно формируют мицеллы (Рисунок 53), в которых углеводородные хвосты липидов спрятаны от воды, а электрически заряженные гидрофильные головы располагаются на поверхности частицы, взаимодействуя с водным окружением. Такие мицеллы могут состоять из тысяч липидных молекул. Полярные липиды способны также растекаться по поверхности водных растворов, образуя слой толщиной в одну молекулу – монослой (Рисунок 53). В таких системах углеводородные хвосты обращены к воздушной среде и избегают, таким образом, контакта с водой, а гидрофильные головы погружены в полярную водную фазу. На поверхности раздела двух водных фаз полярные липиды легко и самопроизвольно формируют очень тонкие бислои (Рисунок 53). В таких структурах углеводородные хвосты липидных молекул направлены внутрь от обращенных к каждой из фаз поверхностей и образуют внутренний непрерывный углеводородный слой, а располагающиеся снаружи гидрофильные головы оказываются погруженными в водный раствор. В зависимости от природы содержащихся в них жирных кислот фосфолипидные бислои имеют толщину от 6 до 7 нм, они лишены жесткости, находятся в жидком состоянии и легко могут изгибаться. В лабораторных условиях такие бислои нетрудно получить путем сильного встряхивания водных суспензий фосфолипидов; при этом образуются липосомы – замкнутые пузырьки, окруженные непрерывным бислоем. Фосфолипидные бислои можно получить также на маленьких отверстиях перегородок, разделяющих два водных раствора. Липидные бислои и липосомы служат предметом интенсивных исследований, так как оказалось, что по своим свойствам они очень сходны с природными мембранами. Например, и полярные липидные бислои, и природные мембраны обладают высоким электрическим сопротивлением, вследствие чего и те и другие непроницаемы для катионов или анионов, но легко пропускают молекулы воды.

Еще одно важное свойство липидного бислоя – это кооперативностъ его структуры. Цельность бислоя обеспечивается множеством усиливающих друг друга нековалентных взаимодействий. Фосфолипиды и гликолипиды образуют в воде конгломераты (кластеры), в которых контакт углеводородных цепей с водой сведен до минимума. Эту ситуацию можно сравнить с овцами, сбившимися в тесную кучу в холодную погоду, чтобы снизить потерю тепла. Образованию кластеров способствуют также ван-дер-ваальсовы взаимодействия между соседними углеводородными цепями. Все эти взаимодействия обеспечивают связи между молекулами называются гидрофобными связями. Гидрофобные связи – это результат взаимодействия углеводородных остатков. Гидрофобные участки молекулы не могут взаимодействовать с водой и поэтому устраняются от водной среды, взаимодействуя только друг с другом. Эти связи достаточно слабые. Эти энергетические факторы приводят к трем биологически важным последствиям:

1) липидные бислои имеют тенденцию к увеличению своей поверхности, чем больше площадь, тем больше молекул участвующих в образовании связей, следовательно структура становится более устойчивой из-за увеличения количества связей;

2) липидные бислои стремятся замкнуться на себя так, чтобы на концах не оставалось доступных для контакта с водой углеводородных цепей; в результате замыкания возникает отграниченное пространство (компартмент);

3) липидные слои способны самозапечатываться (самосшиваться), поскольку любая дырка в бислое энергетически невыгодна.

Общие свойства биологических мембран

Мембраны различаются как по функции, так и по структуре. Однако всем им присущи следующие основные свойства.

1. Мембраны представляют собой плоскую структуру толщиной в несколько молекул, образующую сплошную перегородку между отдельными отсеками (компартментами). Толщина мембран составляет обычно 60 – 100Å.

2. Мембраны состоят главным образом из липидов и белков. Весовое соотношение белков и липидов для большинства биологических мембран лежит в пределах от 1:4 до 4:1. В мембранах имеются также углеводные компоненты, связанные с липидами и белками,

3. Липиды мембран представлены относительно небольшими молекулами, несущими гидрофильные и гидрофобные группы. В водной среде эти липиды спонтанно образуют замкнутые бимолекулярные слои. Такие липидные двойные слои (бислои) служат барьером для полярных соединений.

4. Отдельные функции мембран опосредуются специфическими белками. Белки выполняют роль насосов, каналов, рецепторов, ферментов и преобразователей энергии. Белки мембран встроены (интеркалированы) в липидный бислой, что создает пригодную для проявления их активности среду.

5. Мембраны – нековалентные надмолекулярные структуры; составляющие мембрану белки и липиды удерживаются вместе благодаря возникновению множества нековалентных взаимодействий, кооперативных по своему характеру.

6. Мембраны асимметричны: их наружная и внутренняя поверхности отличаются друг от друга.

7. Мембраны – жидкие структуры. Если молекулы липидов, так же как и белков, не зафиксированы в определенном месте силами специфического взаимодействия, то они легко диффундируют в плоскости мембраны.

Состав мембраны

Мембраны можно рассматривать как двумерные растворы определенным образом ориентированных белков и липидов.

Во всех мембранах имеются полярные липиды в количестве, составляющем в зависимости от типа мембраны от 20 до 80% ее массы, остальное приходится главным образом на долю белков. Так, в плазматических мембранах животных клеток количество белков и липидов, как правило, примерно одинаково; во внутренней митохондриальной мембране содержится около 80% белков и только 20% липидов, а в миелиновых мембранах мозга, наоборот, около 80% липидов и только 20% белков. Липидная часть мембран представляет собой смесь различного рода полярных или амфипатических липидов.

В мембранах животных клеток присутствуют в основном фосфоглицериды и в меньших количествах сфинголипиды. Триацилглицеролы обнаруживаются лишь в следовых количествах. К числу важных липидных компонентов многих мембран относится и холестерол. Он присутствует у эукариот, и его нет у большинства прокариот. Как правило, холестеролом богаты плазматические мембраны клеток эукариот, тогда как мембраны клеточных органелл содержат относительно мало этого нейтрального липида. В клеточных мембранах эукариот содержится от 2 до 10% углеводов в форме гликолипидов и гликопротеинов.

Как было сказано выше, гликолипиды высших организмов представлены производными сфингозина с одним или более остатками сахара. В мембранных гликопротеинах одна или несколько углеводных цепей присоединены к боковым цепям серина, треонина или аспарагина (обычно через N-ацетилглюкозамин или N-ацетилгалактозамин). Возможно, что углеводные группы служат для ориентирования гликопротеинов в мембране. Обладая ярко выраженными гидрофильными свойствами, остатки сахаров в гликопротеинах или гликолипидах должны располагаться на поверхности мембраны, а не в ее углеводородной сердцевине. Энергетическая цена встраивания олигосахаридной цепи в углеводородное окружение внутри мембраны очень высока. Стало быть, существует барьер, препятствующий свободному вращению гликопротеина от одной стороны мембраны к другой.

Углеводные компоненты мембранных гликопротеинов способствуют поддержанию асимметрии биологических мембран. Для каждого типа мембран любой животной клетки характерен свой относительно постоянный липидный состав. В различных мембранах на долю белков приходится от 20 до 80% массы. В мембране эритроцита, например, содержится около 20 различных белков, а во внутренней митохондриальной мембране их значительно больше. Некоторые белки в мембранах обладают ферментативной активностью, другие обеспечивают связывание и перенос молекул полярных веществ через мембраны.

Мембранные белки различаются по характеру связи с мембранными структурами. Одни белки, называемые внешними, или периферическими, непрочно связаны с поверхностью мембраны; другие, называемые внутренними, или интегральными, погружены внутрь мембраны и даже могут пронизывать ее насквозь. Периферические белки обычно легко экстрагируются из мембран, тогда как интегральные белки могут быть выделены только при помощи детергентов или органических растворителей.

Строение мембраны

В 1972 г. Джонатан Сингер и Гарт Николсон предложили жидкостно-мозаичную модель, объясняющую в общих чертах организацию биологических мембран. Согласно этой модели, мембраны представляют собой двумерные растворы определенным образом ориентированных глобулярных белков и липидов (Рисунок 54). В пользу предложенной модели свидетельствует большое количество экспериментальных данных. Основные положения жидкостно-мозаичной модели сводятся к следующему.

Рисунок 54. Схема строения мембраны

1. Большая часть мембранных фосфолипидов и гликолипидов представлена в виде бислоя. Липидный бислой играет двоякую роль, будучи одновременно растворителем для интегральных белков мембраны и барьером проницаемости.

2. Небольшая часть мембранных липидов специфически связана с определенными мембранными белками и, вероятно, необходима для их функционирования.

3. Мембранные белки свободно диффундируют в липидном матриксе в латеральном направлении, но не могут перемещаться в поперечном направлении, т. е. от одной поверхности мембраны к другой.

Природные мембраны характеризуются очень малой толщиной (от 6 до 9 нм), эластичностью, а также тем, что они находятся в жидком состоянии. Через мембраны легко проходит вода, но они практически полностью непроницаемы для заряженных ионов типа Na⁺, Сl^‒ или Н⁺ и для полярных, но не заряженных молекул, например сахаров.

Гликокаликс – это «пушистая оболочка» состоит из гидрофильных олигосахаридных групп гликопротеинов и гликолипидов, ее толщина – около 100 нм, что приблизительно в 10 раз превышает толщину липидного бислоя.

Мембраны – жидкие кристаллы

Биологические мембраны – это не застывшие структуры. Напротив, и липиды, и многие белки мембран постоянно перемещаются в латеральном направлении (Рисунок 55). Быстрое движение белков мембраны выявляется с помощью флуоресцентной микроскопии при следующей постановке опыта. Культивируемые клетки человека и клетки мыши можно заставить слиться друг с другом; образующаяся при этом гибридная клетка называется гетерокарион. Одна часть плазматической мембраны гетерокариона происходит из клетки мыши, а другая – из клетки человека. Остаются ли мембранные белки мыши и человека разделенными в гетерокарионе или они смешиваются? Для ответа на этот вопрос использовали маркеры, а именно антитела с флуоресцентной меткой и далее визуально наблюдали за ними с помощью светового микроскопа. Антитело к мембранным белкам мыши имело зеленую флуоресценцию, а антитело к мембранным белкам человека – красную.

В новообразованном гетерокарионе одна половина поверхности светилась зеленым, а другая – красным. Однако меньше чем через час (при 37°С) участки зеленой и красной флуоресценции полностью смешивались. Этот опыт показывает, что мембранный белок способен диффундировать на расстояние порядка нескольких микрон примерно за 1 мин. Экспериментально установленная величина коэффициента диффузии показывает, что вязкость мембран примерно в 100 раз выше вязкости воды и близка к вязкости оливкового масла.

В отличие от липидов белки очень неоднородны в отношении латеральной подвижности. Некоторые белки почти так же подвижны, как липиды, другие – практически неподвижны. В отличие от движения в плоскости мембраны спонтанное перемещение липидов от одной поверхности мембраны к другой происходит очень медленно. Перемещние молекулы с одной поверхности мембраны на другую называют поперечной диффузией (или «flip-flop» -перескок), тогда как диффузию молекул в плоскости мембраны называют латеральной диффузией. Методом электронного парамагнитного резонанса было проведено прямое определение поперечной диффузии фосфолипидных молекул в фосфатидилхолиновых пузырьках; оказалось, что переход молекулы фосфолипида с одной стороны бислоя на другую совершается один раз за несколько часов. Таким образом, поперечная диффузия молекулы фосфолипида на расстояние 50 А занимает в 10⁹ раз больше времени, чем диффузия на то же расстояние в латеральном направлении.

Энергетический барьер для поперечной диффузии молекул белка еще выше, чем для липидов, поскольку в белках значительно больше полярных участков. Проведенные исследования не выявили поперечной диффузии белка. Следовательно, асимметрия мембран сохраняется на довольно длительное время.

Мембрана должна обладать определенной текучестью, но изменение окружающей температуры может ее изменять, это связано с температурой плавления липидов в бислое. Текучесть мембран зависит от состава жирных кислот и содержания холестерола.

Рисунок 55. Доказательства жидко-кристалличности мембраны. А – схема доказательства, что мембрана жидкая; Б – схема упорядоченности мембраны и механизмы ее нарушающие

В мембранном бислое цепи жирных кислот в молекулах липидов могут находиться либо в строго упорядоченном жестком, либо в относительно дезорганизованном, жидком состоянии. В упорядоченном состоянии все связи С – С имеют транс-конформацию, тогда как в неупорядоченном – гош-конформацию. Переход от твердого (полностью транс-) к жидкому (частично гош-) состоянию происходит при повышении температуры выше точки плавления Т_пл. Этот температурный переход зависит от длины цепи и степени ненасыщенности ацильного остатка. Наличие насыщенных ацильных остатков благоприятствует жесткому состоянию, так как прямые углеводородные цепи легко взаимодействуют между собой. Наличие же двойной связи цис-конфигурации приводит к изгибу углеводородной цепи, из-за которого нарушается строгая упорядоченность укладки ацильных остатков, и в результате Т_пл снижается. Температура перехода из жесткого состояния в жидкое зависит также от длины цепи. Длинные углеводородные цепи образуют более прочные связи друг с другом, чем короткие. В частности, каждая дополнительная группа – СН₂– изменяет свободную энергию связи двух прилежащих углеводородных цепей на – 0,5 ккал/моль.

Прокариоты регулируют текучесть своих мембран путем изменения числа двойных связей и длины ацильных цепей. Так, соотношение насыщенных и ненасыщенных остатков жирных кислот в мембране Е. coli снижалось с 1,6 до 1,0 при понижении температуры среды с 42°С до 27°С. Такое уменьшение доли насыщенных жирных кислот предотвращает чрезмерное затвердевание мембраны при пониженной температуре. У эукариот ключевым регулятором текучести мембран является также холестерол.

Находясь между ацильным и цепями, холестерол препятствует их кристаллизации. В сущности, из-за холестерола исчечает фазовый переход. С другой стороны, холестерол стерически блокирует сильное перемещение ацильных цепей и тем самым снижает текучесть мембран. Таким образом, благодаря этим взаимопротивоположным эффектам холестерола текучесть мембран поддерживается на каком-то среднем уровне.

С другой стороны липиды и белки являются кристаллами. Степень кристалличности определяется упорядоченностью структуры. Максимально упорядочены хвосты насыщенных жирных кислот, взаимодействующие между собой за счет ван-дер-ваальсовых связей. Двойные связи изменяют углы связей, образуя Г-подобные структуры, нарушая упорядоченность. Холестерин, «раздвигая» хвосты, также нарушает упорядоченность.