Читать книгу "Структурная биохимия"

Ограничения, присущие уравнению Михаэлиса-Ментен

Некоторые ферменты и другие лигандсвязывающие белки, например гемоглобин, не подчиняются классической кинетике насыщения Михаэлиса – Ментен. График зависимости v от [S] носит в этом случае сигмоидный характер. Это обычно указывает на кооперативное связывание субстрата многими центрами – связывание с одним центром влияет на связывание с другим, как это происходит с гемоглобином. В таком случае описанный выше метод графической оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, оказывается непригодным (прямой в соответствующих координатах уже не получается). Здесь следует обратиться к графическому представлению уравнения Хилла, первоначально предложенного для описания кооперативного связывания О₂ с гемоглобином.

Рисунок 88. Уравнение Хилла и график, им описываемый

Уравнение Хилла, преобразованное так, чтобы график в соответствующих координатах представлял собой прямую, имеет вид, где ќ – константа. Из уравнения следует, что в условиях, когда [S] мало по сравнению с ќ, скорость реакции возрастает как n-я степень [S]. Приведен график Хилла, построенный по кинетическим данным для фермента, характеризующегося кооперативным связыванием субстрата (Рисунок 88). График зависимости log (V/Vmax – V) от log [S] представляет собой прямую с тангенсом угла наклона, равным n, где п – эмпирический параметр, зависящий от числа субстрат связывающих центров и характера взаимодействия между ними. При п = 1 связывающие центры не зависят друг от друга. При п> 1 между центрами имеется кооперативное взаимодействие; чем больше п, тем выше степень кооперативности и тем более выражена сигмоидность кривых насыщения. При п <1 говорят об отрицательной кооперативности. Когда скорость реакции равна половине максимальной (V = Vmax/2, V/ (Vmax -V) = 1 и log [V/ (Vmax —V)] = 0. Таким образом, чтобы определить величину S50 (концентрацию субстрата, при которой скорость вдвое меньше максимальной), нужно из точки на прямой, для которой log [V/ (Vmax – V)] = 0, опустить перпендикуляр на ось х.

Ингибирование активности ферментов

Ингибиторы – это химические вещества, которые уменьшают скорость ферментативной реакции.

Различают два больших класса ингибиторов ферментативной активности – конкурентные и неконкурентные – на основании того, ослабляется (конкурентное ингибирование) или не ослабляется (неконкурентное ингибирование) их ингибирующее действие при повышении концентрации субстрата. На практике многие ингибиторы не проявляют тех свойств, которые характерны для чисто конкурентного или чисто неконкурентного ингибирования. Другой способ классификации ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в том же месте, что и субстрат (в каталитическом центре), а другие – на значительном расстоянии от активного центра (в аллостерическом центре). Так же ингибирование подразделятся

Конкурентное ингибирование аналогами субстрата

Классическое конкурентное ингибирование основано на связывании ингибитора с субстрат-связывающим (каталитическим) центром. Химическая структура аналога субстрата, действующего как ингибитор (I), обычно сходна со структурой субстрата (S). Поэтому ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя вместо Enz – S комплекс Enz – I, т. е. фермент-ингибиторный комплекс. Когда в реакционной смеси одновременно присутствуют и субстрат, и. ингибитор указанного типа, они конкурируют за один и тот же связывающий центр на поверхности фермента. Один из наиболее подробно изученных примеров конкурентного ингибирования – это ингибирование сукцинатдегидрогеназы малонатом (I), конкурирующим за один и тот же центр с субстратом сукцинатом (S). В случае конкурентного ингибирования идет воздействие на Км, при повышении концентрации субстрата, вероятность связывания с ингибитором уменьшается и скорость реакции увеличивается, таким образом при конкурентном ингибировании скорость реакции может быть близкой к максимальной в норме, но при больших концентрациях субстрата.

Обратимое неконкурентное ингибирование

Как следует уже из самого названия, в этом случае конкуренция между субстратом (S) и ингибитором (I) отсутствует. При этом ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как можно предположить, связывается с другим участком фермента. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают максимальную скорость, достижимую при данном количестве фермента (понижают Vmax),но, как правило, не влияют на Км. Поскольку I и S связываются с разными центрами, возможно образование как комплекса Enz – I, так и комплекса Enz – IS. Комплекс Enz – IS тоже распадается с образованием продукта, однако с меньшей скоростью, чем Enz – S; поэтому реакция будет замедляться, но не остановится. Таким образом, могут протекать следующие конкурентные реакции:

Необратимое неконкурентное ингибирование

Ферментативная активность может уменьшаться в присутствии многих «ядов», таких, как иодацетамид, ионы тяжелых металлов (Ag⁺, Hg²⁺) окисляющие агенты и т. д. В присутствии одного или нескольких субстратов или продуктов скорость инактивации фермента может снижаться. В данном случае ингибирование происходит за счет частичной денатурации фермента.

Способы регуляции работы ферментов in vivo

Клетка также регулирует скорость ферментативных реакций, для контроля своего метаболизма. Но клетка не может изменять температуру и рН своей среды, а изменение концентрации субстратов является сигналом для изменения скорости реакций. Такая ситуация связна с понятием гомеостаза. Гомеостаз – это состояние постоянных состава внутренней среды клетки и организма и их физиологических функций (температура и рН).

Поэтому в живой клетке скорость ферментативных реакций можно регулировать, изменяя следующие параметры:

1) абсолютное количество присутствующего фермента;

2) пул реагентов (помимо фермента);

3) каталитическую эффективность фермента.

Большинство форм жизни использует все три типа регуляции.

Регуляция количества фермента путем регуляции скорости его синтеза и распада

Абсолютное количество фермента в клетке определяется скоростями его синтеза (K_синт) и распада (K_расп). Соответственно количество фермента увеличивается либо в результате повышения скорости его синтеза (увеличением K_синт), либо снижения скорости распада (уменьшением K_расп), либо обоими способами сразу. Регуляция осуществляется на уровне экспрессии генов. Увеличивая скорость экспрессии генов прежде всего транскрипции и в меньшей степени трансляции можно увеличивать количество белка. Блокируя транскрипцию генов можно уменьшать до полного исчезновения количество закодированного в гене белка.

Превращение проферментов в активные ферменты

Ферментативная активность может регулироваться путем превращения неактивного профермента в каталитически активную форму. Чтобы перейти в такую форму, профермент должен подвергнуться ограниченному протеолизу, сопровождающемуся конформационными изменениями; при этом происходит либо демаскирование каталитического центра, либо его формирование. Синтез в форме каталитически неактивных проферментов является характерным свойством пищеварительных ферментов, а также ферментов системы свертывания крови и системы фибринолиза.

Компартментация ферментов

Роль компартментации (пространственного разделения) метаболических процессов в клетках эукариот, в том числе в клетках млекопитающих, трудно переоценить. Локализация специфических метаболических процессов в цитозоле или в клеточных органеллах облегчает независимую регуляцию этих процессов. Развитая компартментация метаболических процессов особенно характерна для высших форм живых организмов – она позволяет осуществлять наиболее тонкую регуляцию метаболизма. Одновременно при этом возникает новая проблема – прохождение метаболитов через разделяющие барьеры. Эта проблема решается с помощью «челночных механизмов», переводящих метаболит в форму, которая способна проходить через барьер. Затем по другую сторону барьера происходит обратное превращение метаболита в первоначальную форму. В связи с наличием барьеров возникает потребность в функционировании, например, цитозольной и митохондриальной форм некоторых ферментов. Поскольку эти формы фермента физически разделены, их независимая регуляция облегчается.

Аллостерическая регуляция

В случае аллостерической регуляции низко-молекулярные соединения или аллостерические регуляторы связываются с ферментом в результате происходит изменение конформации белка. Необходимо вспомнить что при при встраивании этой молекулы изменяются связи в составе белка, что характерно для связывания белка с любой молекулой в результате происходит перераспределение связей и как результат изменение конформации белка, эти молекулы могут привести к двум противоположным результатам. В зависимости от молекулы связи могут различаться, а, следовательно, и перестройки в молекуле белка, поэтому аллостеричекие модуляторы могут изменять конформацию белка либо в направлении увеличения сродства к субстрату, следовательно, увеличению активности белка, тогда молекула является положительным модулятором. И наоборот молекула, встраиваясь, изменяет конформацию белка, и в результате конформация белка становится менее активной, то есть происходит неконкурентное обратимое ингибирование.

Примерно в 1963 г. Моно обратил внимание на отсутствие структурного сходства между ингибитором, действующим на фермент по принципу обратной связи, и субстратом этого фермента. Отсутствие изостеричности с субстратом позволяет говорить об аллостеричности соответствующих эффекторов. Исходя из этого, Моно предположил, что ферменты, регулируемые такими аллостерическими эффекторами (в частности, ингибиторами по принципу обратной связи), связывают эффектор в аллостерическом центре, физически не совпадающем с каталитическим центром. Таким образом, аллостерические ферменты – это ферменты, активность каталитического центра которых изменяется под действием аллостерических эффекторов, связывающихся в аллостерическом центре. Данные о наличии у регуляторных ферментов физически обособленных аллостерических центров сводятся к следующему.

1.Регуляторные ферменты после модификации химическими или физическими методами часто становятся нечувствительны к аллостерическим эффекторам, сохраняя каталитическую активность.

2.Аллостерические эффекторы часто защищают каталитический центр от денатурации в условиях, когда субстрат такого защитного действия не оказывает.

3.Обнаружены мутантные клетки бактерий и млекопитающих, в которых регуляторные ферменты имели существенно иные регуляторные свойства, чем ферменты из клеток дикого типа, но обладали в точности такими же каталитическими свойствами.

4.Показано, что связывание субстратов и аллстерических эффекторов с регуляторным ферментом происходит независимо.

5.В некоторых ферментах (например, в АТКазе) аллостерический и каталитический центры локализованы в разных протеомерах.

Ковалентная модификация ферментов

Обратимое изменение каталитической активности ферментов может осуществляться путем ковалентного присоединения фосфатной группы (преобладает у млекопитающих) или нуклеотида (преобладает у бактерий). Ферменты, подверженные ковалентной модификации, которая сопровождается изменением их активности, называют обратимо модифицируемыми ферментами.

Обратимо модифицируемые ферменты могут находиться в двух состояниях, одно из которых характеризуется высокой, а другое – низкой каталитической эффективностью. В зависимости от конкретного случая более активным катализатором может быть либо фосфо-, либо дефосфофермент.

Обычно фосфорилируется специфический остаток серина и образуется остаток О-фосфосерина; реже фосфорилируется остаток тирозина с образованием остатка О-фосфотирозина. Хотя обратимо модифицируемый фермент может содержать много остатков серина или тирозина, фосфорилирование происходит в высшей степени избирательно и затрагивает лишь небольшое число (1—3) остатков. Эти участки, по всей вероятности, не являются частью каталитического центра; мы, таким образом, имеем еще один пример аллостерических эффектов.

Для модификации необходимы молекула – донор модифицирующей группировки и фермент, осуществляющий модификацию. У эукариот донором фосфатной группы для модификации является АТФ, модификацию осуществляют ферменты протеин киназы. Протеинкиназы – это очень большой класс белков, специфично фосфорилирующих различные ферменты. У прокариот донором АДФ-рибозы является NAD. Различие модифицирующих групп повлекло за собой расхождение модифицирующих и демодифицирующих ферментов. По этому у эукариот нет ферментов снимающих АДФ-рибозу с модифицированного фермента. Эта особенность стала основой для действия некоторых токсинов. Например дифтерийный токсин АДФ-рибозилирует рибосому, полностью блокируя ее функции, у клетки человека нет ферментов, удаляющих модифицирующую группу, а следовательно, клетка погибает без возможности запустить биосинтез белка. Холерный токсин необратимо АДФ-рибозилирует аденилатциклазу в цитоплазматической мембране клеток эпителия тонкого кишечника, в результате все процессы всасывания полностью нарушаются.

Изоферменты

Изоферменты – это ферменты отличающиеся активностью у одного организма в разных тканях или в ходе онтогенеза а так же у разных особей одного вида.

Изоферменты отличаются как распределением в популяции, так в тканях организма. Также как и изобелки изоферменты могут по разному распределяться как в тканях организма, так и в ходе онтогенеза. Термин «изофермент» («изоэнзим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изоэнзимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах. При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфосфорилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам.

Изоэнзимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол. массой около 34000). Каталитической активностью обладает только тетрамерная молекула. Если порядок соединения протомеров не имеет значения, то протомеры могут быть скомпонованы пятью способами:

НННН

НННМ

ННММ

НМММ

ММММ

Маркерт подобрал условия для разрушения и реконструкции четвертичной структуры и сумел выяснить взаимоотношения между изоэнзимами лактатдегидрогеназы. Расщепление и реконструкция лактатдегидрогеназ I₁ и I₅ не приводят к образованию новых изоэнзимов. Следовательно, эти два изоэнзима содержат только один тип протомеров. Когда такой же процедуре была подвергнута смесь лактатдегидрогеназ I₁ и I₅, появились также формы I₂, I₃ и I₄. Соотношение изозимов соответствует приведенному ниже субъединичному составу:

I₁– НННН

I₂– НННМ

I₃-ННММ

I₄– НМММ

I₅ -ММММ

Синтез Н– и М-субъединиц детерминируется разными генетическими локусами, и они по-разному экспрессируются в разных тканях (например, в сердечной и скелетной мышцах).

Также примером могут быть изоформы цитохрома Р450, существующего в двух изоформах нормальной и высокоактивной, которая является причиной предрасположенности организма к различным онкозаболеваниям. Чаще всего причиной возникновения изоформ белков являются точечные мутации, не подвергшиеся давлению естественного отбора.

Список использованной литературы

Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т. 1. Пер. с англ. – М.:Мир, 1985.-367с.

Комов, Вадим Петрович. Биохимия: учебник / В. П. Комов, В. Н. Шведова. – 2-е изд., испр.. – М.: Дрофа, 2006. – 640 с.: ил.

Метревели, Тина Валерьяновна. Биохимия животных: учеб. пособие / Т. В. Метревели; под ред. Н. С. Шевелева. – СПб.: Лань, 2005. – 296 с.: ил.. – (Ветеринарная медицина). – Библиогр.: с. 293

Физиология и биохимия сельскохозяйственных растений: учебник / под ред. Н. Н. Третьякова. – М.: КолосС, 2005. – 656 с

Степанов, Валентин Михайлович. Молекулярная биология. Структура и функции белков: учебник / В. М. Степанов; под ред. А. С. Спирина. – М.: Изд-во МГУ: Наука, 2005. – 336 с.

Биохимия: руководство к практическим занятиям: учеб. пособие / под peд. Н. Н. Чернова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009

Энзимология: метод. указания к самостоят. работе студентов / ВятГУ, БФ, каф. МБ; cocт. И. А. Лундовских, В. А. Пятков. – Киров: [б. и.], 2010. – 48

Кухта, Виктор Климентьевич. Основы биохимии: учебник / В. К. Кухта, А. Д. Таганович. – 2-е изд., перераб. и доп.. – М.: Медицина, 2007. – 416 с.

Биохимия растений / Л. А. Красильникова [и др.]; под ред. Л. А. Красильниковой. – Ростов н/Д: Феникс; Харьков: Торсинг, 2004.