Текст книги "Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги"

Изменение дисперсионной среды коллоидной системы водного извлечения чаги

Изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги при использовании в экстракции комплексонов. Применение комплексонов при получении водных извлечений чаги продиктовано тем, что они имеют высокое содержание зольных элементов – K, Na, Ca, Mg, Mn, Fe, Al, Si. Среди перечисленных – К и Na составляют около 52 % от всех зольных элементов, при этом калия в 5 – 6 раз больше, чем натрия. Наличие большого количества калия в препаратах чаги не показано, особенно для лечения и профилактики язвенной болезни, гастритов и рака IV стадии. [56, 141, 160, 196, 197] Поэтому снижение содержания зольных элементов в препаратах из чаги актуально.

При получении водных извлечений с применением комплексонов может произойти изменение структуры золя водного извлечения за счет взаимодействия комплексонов с сырьем, меланином, зольными элементами и другими компонентами дисперсионной среды золя водного извлечения.

Были использованы два способа введения комплексона в процесс экстракции: 1) предварительное замачивание сырья в растворе комплексона, 2) применение раствора комплексона в качестве экстрагента. Экстракция проводилась методом ремацерации и реперколяции. Были выбраны два комплексона, широко применяемые в фармацевтической промышленности: гидроксиэтилендифосфоновая кислота (ОДЭФ) и натриевая соль этилендиамин-N,N,N¹,N¹-тетрауксусной кислоты (трилон Б) [198, 167, 199]. При применении комплексонов на стадии замачивания раствор после настаивания сливали, обработанное сырье экстрагировали водой. Варьировали время замачивания от 30 минут до тринадцати часов, а также подбирали концентрацию комплексонов от 0,5х10 ^-3 до 0,3 г/л. Оценку полученных извлечений проводили по содержанию в них меланина. Оптимальное время замачивания сырья в растворах комплексонов составило один час. Выход меланина был максимальным при концентрации комплексонов 0.03 г/л. Получение водных извлечений чаги ремацерацией проведено с использованием растворов комплексонов в той же концентрации, что и при замачивании. Результаты проведенного отбора, а также контрольные опыты, в которых в качестве экстрагента применена вода, приведены в таблице 10. Золи, формируемые при использовании разных способов получения водных извлечений, отличаются содержанием и составом экстрагируемых из сырья компонентов. Согласно данным таблицы, оба способа экстракции с применением комплексонов на стадии замачивания приводят к уменьшению сухого остатка получаемых извлечений с уменьшением их зольности и увеличением содержания дисперсной фазы золя. В данном случае природа используемого комплексона мало влияет на изменения анализируемых компонентов золя, исключением можно считать только разное количество углеводов в полученных извлечениях.

Таблица 10 Физико-химические показатели водных извлечений чаги, полученных с применением комплексонов

* – проведение ремацерации водой с предварительным замачиванием сырья в воде; ** – проведение ремацерации водой

При применении ОДФК содержание углеводов несколько снижается, а использование трилона Б не приводит к увеличению их содержания по сравнению с контролем. Вне зависимости от того, каким способом проводится дальнейший процесс экстракции, обработка сырья растворами комплексонов (замачивание) приводит к изменению дисперсионной среды. Это изменение позволяет увеличить содержание дисперсной фазы в золе по сравнению с контролем. Но проведение экстракции реперколяцией позволяет увеличить содержание меланина на 42 %, а ремацерацией только на 5 % по сравнению с контролем.

Проведение экстракции чаги ремацерацией, растворами комплексонов в той же концентрации, что и при замачивании сырья, приводит к более существенным изменениям в формируемых золях. В этом случае проявляются особенности действия комплексонов.

Использование трилона Б увеличивает выход меланина на 26 % по сравнению с контролем. При применении ОДФК выход меланина повышается только на 15 %, однако показатели зольности и сухого остатка несколько ниже, чем в контроле. В этом случае в действии комплексонов, вероятно, проявляется не только их взаимодействие с сырьём, но, в большей мере, с зольными элементами водного извлечения и другими компонентами золя.

ОДФК как комплексон, способный образовывать прочные комплексы со щелочноземельными металлами в кислой среде (рН водной вытяжки около 5), по-видимому, должен несколько дестабилизировать золь водного извлечения [200-202]. Это приводит к снижению сухого остатка при сохранении показателей зольности и количества углеводов на уровне с контролем. Поскольку выход меланина возрастает, его стабилизацию могут осуществлять зольные элементы и другие соединения водного извлечения за счет более слабых взаимодействий с его полярными группами.

В случае применения трилона Б происходит увеличение всех анализируемых параметров водного извлечения, даже его зольности. Известно [200, 277-280], что комплексообразование при рН 5 трилоном Б затруднено, так как наиболее прочные комплексы им образуются при рН среды 8-9 с двух-валентными ионами. Их количество в водной вытяжке намного меньше, чем ионов щелочных металлов. Однако стабилизации комплексов с зольными элементами водной вытяжки в этой среде могут способствовать вспомогательные комплексообразователи. В этой роли могут выступать натриевые/калиевые соли органических кислот, содержание которых в водной вытяжке значительно. Высокая зольность водной вытяжки может быть обусловлена либо связыванием трилона Б с сырьем и облегчением выхода из него зольных элементов, либо связыванием их в водной вытяжке в комплексные соединения, что облегчает их диффузию по градиенту концентраций.

Согласно данным [190], меланин имеет достаточно большое количество полярных групп, таких, как метоксильные 5.81 %, карбонильный кислород 4.50 %, карбоксильные 6.50 млэкв/г (в расчете на чистое органическое вещество). Взаимодействие зольных элементов с ними, а также, например, с органическими кислотами и фенолами, находящимися в водном извлечении в количестве 0.9-1.7 и 0.1-0.12 (в процентах на сухой вес гриба) соответственно [43] , вероятно, приводит к стабилизации её золя.

Для определения состояния этих групп в меланине использована ИК-спектроскопия [198]. Изменения в этой области спектра существенны. Они зависят от способа получения меланина, связанного с применением комплексонов. На спектре меланина, выделенного из водного извлечения, полученного ремацерацией, наблюдается сильное поглощение в области 1600 см^-1 и 1400 см^-1, что, согласно [188], можно отнести к колебаниям карбоксилат аниона, следовательно, в нем преобладают карбоксильные группы, имеющие ионную связь с атомами металлов по сравнению с свободными гидроксильными группами.

В спектрах меланинов, выделенных из водных извлечений, полученных ремацерацией с применением трилона Б и ОДФК на стадии замачивания, на фоне снижения её зольности наблюдается освобождение карбоксильных групп меланинов. Перераспределение полос поглощения в анализируемой области этого спектра и смещение интенсивности колебаний от 1400 к 1200 см^-1 и 1600 к 1700 см^-1 свидетельствует об увеличении в этих меланинах числа свободных карбоксильных групп. В меланинах, полученных ремацерацией с применением растворов ОДФК и трилона Б, свободные карбоксильные группы максимально преобладают над связанными по сравнению с описанными до этого [198]. В спектрах этих меланинов поглощение в области 1400 см^-1 минимально, интенсивность пика при 1200 см^-1 увеличилась, а в области 1600-1700 см^-1 произошло перераспределение поглощения в пользу 1700 см^-1. Эти изменения в спектре могут быть объяснены связыванием зольных элементов примененными комплексонами в процессе экстракции, как и предполагалось ранее.

При проведении экстракции чаги с применением комплексонов ОДФК и трилона Б на стадии замачивания и на протяжении всей экстракции изменяется дисперсионная среда и дисперсная фаза полученных коллоидных извлечений по сравнению с водным извлечением. На основании полученных результатов предположены возможные варианты участия комплексонов в описанных процессах экстракции, в зависимости от их физико-химических свойств. ИК спектроскопия меланинов, выделенных из извлечений, полученных ремацерацией, позволяет заключить, что, несмотря на различные механизмы взаимодействия комплексонов с зольными элементами водного извлечения, процесс комплексообразования приводит к освобождению карбоксильных групп меланинов. Такое поведение коллоидной системы водного извлечения чаги при введении комплексообразователей свидетельствует об участии зольных элементов в её формировании.

АОА извлечений и полученных с применением комплексонов меланинов приведены в таблице 11 [207]. Как и в случае экстракции различного сырья чаги (таблица 7), при увеличении в извлечениях содержания меланина АОА извлечений с применением комплексонов ниже, чем в контроле. Применение комплексонов в экстракции чаги приводит к увеличению антиоксидантной активности меланина.

Причем антиоксидантная активность меланинов, полученных с применением трилона Б, почти в полтора раза выше контроля, а антиоксидантная активность меланинов, полученных с применением ОДЭФ, более чем в три раза.

С помощью метода ЯМР-релаксации [207] показано, что при использовании ОДЭФ в экстракции формируется меланин, имеющий значительно большие размеры, связность и жесткость полимерной цепи. Если представить модель структуры меланина в виде пористой среды, то в присутствии ОДЭФ формируется пористый кластер максимальных размеров с более широким, чем у остальных меланинов, распределением размеров капилляров и пор, функциональных групп или иных активных центров. Его отличают от остальных исследованных меланинов не только максимальные геометрические параметры, но и высокие энергетические характеристики рабочей поверхности. Он обладает наибольшим объемом и наиболее доступными активными центрами, что объясняет максимальное значение его антиоксидантной активности.

Таблица 11 Антиоксидантная активность водных извлечений чаги при использовании в экстракции комплексонов и предварительного замачивания в растворе гидроокиси натрия

Изменение дисперсионной среды при применении предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия обусловливается лучшей растворимостью полифенолов чаги именно в слабощелочной среде. Было выдвинуто предположение, что создание слабощелочной среды на стадии замачивания облегчит диффузию меланина в водное извлечение при проведении экстракции ремацерацией и повысит его содержание в водном извлечении. Извлечения из чаги, полученные с применением щелочи в той же концентрации (0,03 г/л) в качестве экстрагента из сырья разных партий, по содержанию в них меланина и его АОА незначительно отличаются от контроля [207, 208]. Физико-химические характеристики и антиоксидантная активность извлечений, полученных из различных партий сырья, приведены в таблице 11. Антиоксидантная активность меланинов, выделенных из водных извлечений с предварительным замачиванием сырья в растворах гидроокиси натрия из всех партий сырья, намного превышает антиоксидантную активность контрольных опытов. Вне зависимости от сырья, взятого на экстракцию, антиоксидантная активность ПФК составляет 51-52 кКл/100 г. Очевидно, что проведение предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия существенно влияет на формирование золя водного извлечения и зависит от доступности и растворимости в воде различных компонентов из различных партий сырья. Кроме того, в этих коллоидных системах дисперсионная среда приводит к стабилизации частиц меланина, отличающихся от частиц водного извлечения (по размерам, упаковке компонентов ассоциата), что приводит к увеличению его антиоксидантной активности. С точки зрения практического применения важно, что растворимость в воде высушенного меланина, выделенного из извлечения, полученного с применением в экстракции комплексонов или из извлечения с предварительным замачиванием сырья в растворах гидроокиси натрия, возрастает по сравнению с меланином, выделенным из водного извлечения, полученного ремацерацией.

Изменение дисперсионной среды предварительным замачиванием сырья в растворах гидроокиси натрия, а также с применением в экстракции чаги ОДЭФ позволяет повысить антиоксидантную активность меланинов в два – три раза по сравнению с меланином, выделенным из водного извлечения чаги. Это делает перспективным разработку на их основе лекарственных препаратов с высокими антиоксидантными свойствами.

Изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги при использовании в экстракции чаги гидролаз некрахмалистых полисахаридов. Для изменения дисперсионной среды и дисперсной фазы золя водного извлечения применены ферментные препараты, которые используются в спиртопроизводстве для гидролиза некрахмалистых полисахаридов, содержащихся в сырье [209].

Согласно химическому составу чаги, в ней содержатся целлюлоза – 2.09 % и гемицеллюлозы – 12.50 % [55]. Известно, что нативную целлюлозу, в особенности целлюлозу, содержащую лигнин, гидролизовать ферментами невозможно. [209] Поэтому для проведения гидролиза целлюлазами её подвергают предобработке. Удаление лигнина – очень важный шаг в предобработке нативной целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов. Целлюлоза, содержащаяся в чаге, прошла предварительную биологическую предобработку. Она очищена от лигнина в процессе метаболизма гриба, то есть, с теоретической точки зрения, гидролиз целлюлазами возможен. Для сравнения: берёза, на которой растет гриб, содержит целлюлозы 39.4 %, гемицеллюлоз 26.5 %, лигнина 19.7 % и зольных элементов 0.4 %; верховой торф, прошедший природную обработку (степень разложения 15-20 %), содержит гемицеллюлоз 16-36 %, целлюлозы 20-24 %, не содержит лигнина и зольных элементов [209].

Гемицеллюлозы – это полисахариды, значительно различающиеся структурными элементами, которые соединены β-1,4связью. Довольно часто в них встречаются ответвления от основной цепи по β-1,3– и β-1,6-связям. Гемицеллюлозы, такие как ксиланы, глюканы и маннаны редко имеют фибриллярное, гораздо чаще ветвистое строение. Кроме гемицеллюлоз, растворимых в щелочах, чага в процессе жизнедеятельности образует большое количество водорастворимых полисахаридов – 6-8 % (от сухого остатка) [159]. При химическом гидролизе водных извлечений и выделяемых из них объектов обнаруживают глюкозу, ксилозу, следы галактозы, иногда фруктозу [210-213]. Следовательно, гемицеллюлозы и другие полисахариды чаги, содержащиеся в сырье и переходящие в состав водного извлечения, могут отличаться по своей структуре.

При получении извлечений чаги для изменения дисперсионной среды были выбраны микробиологические ферментные препараты «Целлюкласт» и «Шеарзим», содержащие в своём составе гидролазы некрахмалистых полисахаридов [214]. Ферментный препарат «Целлюкласт» обладает выраженной целлюлазной активностью, составляющей 400 ед/г, с оптимумом действия 50-60 Т, ºС, рН=4,56,0. «Шеарзим» обладает выраженной пентозаназной активностью, составляющей 500 ед/г, с оптимумом действия 60-80 Т, ºС, рН=4,55,5. [215]. Экстракцию проводили в оптимальных условиях работы ферментных препаратов «Шеарзима» и «Целлюкласта» – рН = 5.5, Т = 70 ºС. Для определения эффективности действия ферментных препаратов проведено исследование их применения в интервале концентраций 0.01-0.1 %. Результаты эксперимента приведены в таблице 12.

Согласно табличным данным, применение ферментных препаратов «Целлюкласт» и «Шеарзим» при экстракции чаги в концентрации 0.01 % оптимально увеличивает выход экстрактивных веществ в исследованном интервале концентраций по сравнению с контролем.

Таблица 12 Получение водных извлечений чаги с применением ферментных препаратов «Шеарзим» и «Целлюкласт».

Примечание: * – процент от сухого остатка.

При этом в них наблюдается увеличение сухого остатка, возрастает содержание меланина, зольных элементов и количества углеводов [214]. Проведено исследование антиоксидантной активности полученных извлечений из чаги и, соответственно, меланинов. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13 Антиоксидантная активность извлечений чаги и меланинов, полученных с применением целлолютических ферментных препаратов

Применение в экстракции чаги ферментных препаратов «Шеарзима» и «Целлюкласта» приводит к существенному снижению антиоксидантной активности как получаемых извлечений, так и выделенных из них меланинов [214]. При введении в экстрагент целлюлолитических ферментов происходит гидролиз соответствующих субстратов, присутствующих в сырье. Можно предположить, что выделяемые продукты гидролиза целлюлозы, гемицеллюлоз и полисахаридов чаги влияют на формирование дисперсионной среды и дисперсной фазы золя, получаемого извлечения, что приводит к снижению как его АОА, так и формируемого в этих условиях меланина. Критические концентрации (С_кр) этих извлечений приведены в таблице 14 [178]. Интересно отметить, что в коллоидных системах, полученных с применением ферментов, количество С_кр и их значения совпадают.

Таблица 14 Значения критических концентраций для извлечений из чаги, полученных с применением целлолютических ферментных препаратов

Это как раз и может быть связано с различием в составе их дисперсионных сред по сравнению с дисперсионной средой водных извлечений чаги, что приводит к изменению дисперсных фаз в коллоидных системах, полученных с применением ферментов. Как показано на рисунках 10 и 11, в извлечениях, полученных с применением ферментных препаратов, во всех исследованных концентрациях меланина, в отличие от водных извлечений (рисунки 8 и 9), дисперсная фаза содержит крупные и мелкие частицы. Вероятно, именно с этим связано то, что у этих извлечений С_кр имеют одинаковые значения. Можно предположить, что при изменении концентрации меланина в получаемых при разбавлении золях происходит обмен компонентов частиц дисперсной фазы. При этом в золе остаются как крупные частицы, так и стабилизируются мелкие частицы, отличающиеся по размерам от предыдущего разбавления исследуемого объекта (рисунки 10 и 11) [178].

Этому, вероятно, способствует то, что содержание дисперсной фазы в извлечениях, полученных с помощью ферментных препаратов, выше, чем в водном извлечении, полученном из сырья XI (контроль), и приближается к содержанию в водном извлечении, полученном из сырья XII.

Рисунок 10 Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы коллоидной системы водного извлечения чаги, полученного с применением ферментного препарата «Шеарзим».

Содержание меланина (по оси абсцисс): 1 – 0,0043 мг/мл; 2 – 0, 0175 мг/мл; 3 – 0,14 мг/мл; 4 – 0,55 мг/мл; 5 – 8,92 мг/мл

Рисунок 11 Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы коллоидной системы водного извлечения чаги, полученного с применением ферментного препарата «Целлюкласт».

Содержание меланина (по оси абсцисс): 1 – 0,0162 мг/мл; 2 – 0,1300 мг/мл; 3 – 0,55 мг/мл; 4 – 8,85 мг/мл

В извлечениях, полученных с применением ферментных препаратов, изменяется и состав дисперсионной среды по сравнению с водным извлечением из этого сырья. Например, кроме повышения зольности полученных извлечений, за счёт протекания в процессе экстракции ферментативного гидролиза в них увеличивается содержание углеводов. При том, что С_кр коллоидных систем, полученных с применением в экстракции ферментов, совпадают, процессы, происходящие вблизи С_кр в этих системах, различаются. Так, в коллоидной системе, полученной при применении «Шеарзима» (рисунок 10) с концентрацией 0,55 мг/мл (С_{кр 1}), произошли процессы перестройки как крупных, так и мелких частиц, а в коллоидной системе, полученной при применении «Целлюкласта» (рисунок 11), в той же концентрации, произошел процесс перестройки мелких частиц (сравнение с коллоидными системами с более высокой концентрацией меланина). В коллоидных системах с более низкими концентрациями меланина также имеются отличия в перестройке их дисперсных фаз вблизи С_кр. В коллоидных системах, полученных при применении «Шеарзима», преобладают процессы, приводящие к снижению размера крупных частиц дисперсной фазы, а в коллоидных системах, полученных при применении «Целлюкласта» только в коллоидной системе с концентрацией меланина 0,1300 мг/мл наблюдается максимальный для них размер крупных частиц. Различия в поведении дисперсных фаз рассматриваемых коллоидных систем при разбавлении как раз и обусловлены тем, что при гидролизе полисахаридов в каждой из них образуются различные по физико-химическим свойствам олиго и моносахариды, которые изменяют их дисперсионные среды. Наблюдается корреляция между содержанием дисперсной фазы в коллоидной системе извлечения с размером формируемых в ней частиц меланина, что продемонстрировано в таблице 15 [178].

Примечание: * – в процентах к сухому остатку

Для коллоидных систем, полученных с применением ферментных препаратов, как и для водных извлечений, наблюдается та же закономерность: меньшие размеры дисперсной фазы исследуемой коллоидной системы обеспечивает её более высокую антиоксидантную активность.

Изменение дисперсионной среды водного извлечения чаги при применении ферментов желудочно-кишечного тракта. Один из важных вопросов, касающийся проявления водными извлечениями чаги терапевтических свойств, связан с выяснением изменений, происходящих в коллоидной системе водного извлечения чаги под действием ферментов желудочно-кишечного тракта. На основании литературных данных [140,153,216], можно предположить, что к наиболее существенным изменениям в коллоидной системе может привести действие протеаз желудочно-кишечного тракта. Массовая доля сырого протеина в водном извлечении чаги составляет 2,5 % [216] – 2,772 % [217] от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание белка в водном извлечении чаги, определённое по методу Флореса, составило 1,32 % от сухих веществ водного извлечения чаги. Его содержание в фильтрате после осаждения меланина хлористоводородной кислотой составляет 0,14 %[217]. Следовательно, основная часть белка водного извлечения чаги находится в связанном с меланином состоянии. Поэтому его доступность для действия протеаз желудочно-кишечного тракта может быть ограничена. Кроме того, подбор методов обнаружения продуктов протеолиза при исследовании этого процесса осложняется присутствием в водном извлечении чаги хромогенов.

При попадании в желудок водное извлечение чаги поступает в среду с рН 1 – 3,5, при этом, in vivo, должна наблюдаться седиментация дисперсной фазы изучаемой коллоидной системы. В желудке (рН~2) белки гидролизуются ферментами желудочного сока до пептидов. При переходе содержимого желудка в двенадцатипёрстную кишку рН изменяется до 7,8, при этом меланин будет переходить в растворённое состояние. Это должно облегчить протекание протеолиза ферментами поджелудочной железы. При проведении гидролиза ферментами желудочно-кишечного тракта белков, входящих в состав водного извлечения чаги, созданы условия (рН и температура), соответствующие протеканию этого процесса в организме человека [217]. Гидролиз проведен последовательно в две стадии.

На первой стадии гидролиза проведена оптимизация этого процесса по времени его проведения и по соотношению водного извлечения чаги и препарата «сок желудочный». Найдено оптимальное время протеолиза, которое составляет 90 минут, оптимальным является соотношение – водное извлечение чаги: препарат «сок желудочный» – 1:1. На второй стадии протеолиза к гидролизату водного извлечения чаги, полученного в оптимальных условиях, добавлен препарат «энзистал». Определены оптимальные время протеолиза -160 минут и концентрация ферментного препарата «энзистал» – 32 мг/мл [217].

Анализ полученных гидролизатов по накоплению в них образующихся в результате протеолиза аминокислот и пептидов проведен с помощью бумажной хроматографии. Для подтверждения и уточнения полученных результатов применен метод ТСХ, который обладает высокой чувствительностью по сравнению с бумажной хроматографией [218]. Для проведения ТСХ использованы три системы проявителей. Системы растворителей н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (8:2:2) и н-пропанол – гидроксид аммония (7:3) являются универсальными, то есть в них проявляется большинство аминокислот [219]. Наиболее часто используют систему растворителей бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (8:2:2). Однако проявление хроматограмм в этой системе растворителей даёт нечёткое разделение пятен. Применение системы растворителей нпропанол – гидроксид аммония (7:3) позволило получить лучшее разделение пятен. Систему проявителей пиридин – изоамиловый спирт – вода (4:1:1) используют для разделения α-аминомасляной кислоты, треонина, α-аланина, серина, и глутаминовой кислоты [220]. По ходу протекания гидролиза на хроматограммах наблюдалось высвобождение глутаминовой кислоты. Все полученные с помощью ТСХ результаты подтверждают то, что к 250 минутам (4 часа 10 минут) проведения гидролиза водного извлечения чаги ферментами желудочно-кишечного тракта в гидролизате накапливается максимальное количество аминокислот.

Для количественной оценки протекания этого процесса применен нингидринового метода. Результаты представлены в таблице 16 [217]. Оптимум накопления аминокислот в гидролизате также регистрируется при 250 минутах проведения гидролиза. Поскольку водное извлечение чаги имеет в своем составе природные хромогены, то применение для анализа спектральных методов часто затруднено из-за изменения окраски цветных комплексов, используемых для колориметрии анализируемых объектов.

Таблица 16 Концентрация аминокислот в исследуемых объектах

Примечание: * – сразу после внесения в гидролизат препарата «Энзистал»

Проведено сравнение результатов анализа водных извлечений чаги и гидролизатов на содержание в них белка по Бенедикту и по Флоресу [53, 217]. При применении первого метода проведение реакции образования комплекса белка с сульфатом меди сопровождается изменением окраски исследованных объектов из-за присутствия в них хромогенов. Результаты, полученные при применении метода Флореса, дают более реальные значения содержания белка по сравнению с методом определения сырого протеина. Метод Флореса использован для оценки динамики протекания протеолиза. Полученные результаты приведены в таблице 17 [217]. При гидролизе желудочным соком концентрация белка не изменяется, что объясняется особенностью пепсина расщеплять белки до крупных пептидов, регистрируемых этим методом как белки. При проведении последующего гидролиза препаратом «Энзистал» наблюдается существенное снижение количества белка в гидролизате. Уже после 190 минут гидролиза 87,1 % белка водного извлечения чаги расщепляется. Оптимум времени протекания протеолиза, полученный с помощью бумажной хроматографии, подтверждается и составляет 250 минут.

Таблица 17 Концентрация белка в исследуемых объектах

Примечание: * – сразу после внесения в водное извлечение чаги препарата «сок желудочный»; ** – сразу после внесения в гидролизат препарата «энзистал»; *** – от сухих веществ водного извлечения чаги

Для оценки изменений, происходящих в коллоидной системе при оптимальных условиях проведения гидролиза, со снижением в ней содержания меланина, определена электропроводность образцов, получаемых при разбавлении гидролизата [217]. При анализе зависимости электропроводности от концентрации меланина были обнаружены 3 точки перегиба, соответствующие С_кр, которые представлены в таблице 18.

Таблица 18 Значения критических концентраций для гидролизата и водного извлечения чаги

С_кр гидролизата и водного извлечения чаги существенно различаются, что свидетельствует об отличии организации этих коллоидных систем.

Размеры частиц дисперсной фазы гидролизата определены с применением метода динамического светорассеяния (рисунок 12). При разбавлении в водном извлечении чаги и гидролизате, в некоторых диапазонах концентрации меланина происходит отделение от крупных частиц мелких, достаточно близких по размеру частиц. При этом в сравниваемых объектах перестройка частиц дисперсной фазы протекает различно [217].

При изменении концентрации дисперсной фазы в коллоидных системах в водном извлечении чаги крупные частицы меланина мало варьируются по размеру, и имеют радиус 148-160 нм (рисунок 12).

Рисунок 12 Эффективный радиус (нм) частиц дисперсной фазы коллоидной системы водного извлечения чаги (А), и в гидролизате (Б):

А – Содержание меланина (по оси абсцисс): 1 – 0,0028 мг/мл; 2 – 0,0053 мг/мл; 3 – 0,03 мг/мл; 4 – 1,08 мг/мл; 5 – 8,7 мг/мл.

Б – Содержание меланина (по оси абсцисс): 1 – 0,013 мг/мл; 2 – 0,2 мг/мл; 3 – 6,52 мг/мл.

В гидролизате, при снижении концентрации меланина в коллоидных системах (рисунок 12, ось абсцисс от 3 к 1) размер крупных частиц меланина становится более чем в три раза меньше. В то же время при концентрации меланина в коллоидной системе 6,52 мг/мл наблюдаются крупные частицы с радиусом, превышающим радиус частиц дисперсной фазы водного извлечения чаги. Это, вероятно, связано с тем, что в гидролизате с высоким содержанием меланина преобладают процессы ассоциации частиц либо компонентов дисперсионной среды. Этому может способствовать высокое содержание аминокислот, накапливающихся в процессе проведённого гидролиза. За счёт высоких полярных свойств этих соединений они могут ассоциироваться с мицеллами меланина, придавая устойчивость как крупным, так и мелким частицам [15,178]. При более низких концентрациях меланина в гидролизате повышается устойчивость наноразмерных частиц дисперсной фазы с радиусом около 50 нм [217].

Согласно литературным данным [140,217,221,222], в коллоидной системе водного извлечения чаги белок присутствует как в дисперсной фазе, так и в дисперсионной среде. Уменьшение размеров частиц дисперсной фазы в гидролизате по сравнению с их размерами в водном извлечении чаги свидетельствует о том, что белок, встроенный в структуру меланина, также подвергается гидролизу. Меньшие размеры частиц меланина в гидролизате по сравнению с их размерами в водном извлечении чаги могут свидетельствовать о том, что смоделированный процесс, происходящий в желудочно-кишечном тракте человека с водным извлечением чаги, повышает биодоступность сложного ассоциата меланина, обеспечивая его усвоение и терапевтическую активность.

С точки зрения физиологии пищеварения, пища, в зависимости от её состава, находится в желудке в среднем 1,5 – 8 часов и проходит по тонкому кишечнику примерно за 3–5 часов [233]. Концентрация протеаз в соответствующих отделах желудочно-кишечного тракта находится на уровне примененной в разработанной методике проведения протеолиза водного извлечения чаги. Поэтому оптимальные условия смоделированного протеолиза водных извлечений чаги укладываются в физиологические нормы.