Текст книги "Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги"

Рисунок 16 Антиоксидантная активность меланинов, выделенных из коллоидных систем, полученных при обработке водного извлечения чаги органическими растворителями.

1 – водное извлечение чаги; 2 – коллоидные системы (2); 3 – коллоидные системы (3); 4 – коллоидные системы (1).

На рисунке 17 приведены спектры ЭПР для образца меланин0, полученные при температуре 293К и 143К. В спектрах наблюдаются два сигнала с g=2.00 и g=2.10. Регистрируемый узкий сигнал ЭПР в спектрах с g=2.00, полностью подтверждает полученные ранее данные [258] (ΔH=5.8 Э; концентрация ПМЦ ~6.8·10¹⁸спин/г). Данный сигнал не изменяется с понижением температуры, концентрация ПМЦ и ширина линии его меняются незначительно (ΔH=6 Э; концентрация ПМЦ ~5·10¹⁸спин/г). Сигнал с g=2.10 в ЭПР спектрах меланинов из природной чаги и культивированной чаги отсутствует. Это связано с примененным способом экстракции чаги и свидетельствует о больших парамагнитных свойствах меланина, полученного РЕМ [257].

Рисунок 17 Вид ЭПР спектров меланин 0, меланин 1, меланин 2 снятых при различных температурах

Второй сигнал в ЭПР спектрах меланинов с g=2.10, шириной линии ΔH=520 Э, имеет небольшую температурную зависимость ширины и интенсивности линии. При снижении температуры от 293К до 143К интенсивность сигнала возрастает, а ширина линии увеличивается на 30 Э. Это связано с влиянием температуры на обменные процессы парамагнитной релаксации, происходящие в меланине при увеличении температуры.

В ЭПР спектре образца меланин2, приведённом на рисунке 17Б, также обнаруживаются два сигнала с g=2.00 и g=2.10, как и в образце меланин0. Сигнал для свободного электрона у образца меланин2 идентичен этому сигналу в ЭПР спектре для образца – меланин0 (спектр не приведен). Интенсивность этого сигнала для меланин2 выше, чем для образца – меланин0. В спектрах образцов – меланина0 и меланин2 сигналы с g=2.10 имеют симметричную форму и близкие значения ΔH. Причем при понижении температуры интенсивность этих сигналов увеличивается. Сигнал с g=2.10 в спектре меланин2 имеет ΔH = 480 – 500 Э чуть меньше, чем в исходном образце – меланине0, что указывает на большую подвижность структуры меланина2. Кроме описанных сигналов в ЭПР спектре меланин2 в области g-фактора около 4, как у гуминовых кислот с g=3.85, наблюдается слабое проявление сигнала в спектре при понижении температуры от 293 К к 143 К [257].

В спектре меланин1, представленном на рисунке 34В, наблюдаются три линии поглощения, одна из которых, узкая компонента с g=2.00, относится к g фактору свободного электрона. Кроме этого, в спектре меланин1 также наблюдается ассиметричный сигнал с g=2.10. Ширина этого сигнала возрастает до 750Э по сравнению с ΔH у образцов – меланин0 и меланин2. В отличие от ранее рассмотренных спектров, в спектре меланин1 наблюдается явно выраженный сигнал с g=3.90 и ΔH около 170-200 Э при температуре 293 К. Необходимо отметить симметричность сигналов с g=2.00 и g=2.10 для меланин1 и меланин2, в отличие от аналогичных сигналов у природной чаги, меланин0 и гуминовых кислот, что связано, вероятно, с более равномерным, возможно, радиальным распределением ПМЦ по образцам меланин1 и меланин2.

Идентичным для всех спектров исследованных образцов является наличие фрагмента с g=2.00. Количественная характеристика этого сигнала в исследуемых объектах значительно отличается в сторону увеличения (почти в 1.4 раза) для меланин2. Во всех анализируемых объектах наряду с присутствием в ЭПР спектрах сигнала g=2.00, отвечающего за органическую компоненту этих объектов, присутствует сигнал с g=2.10, который, по аналогии со спектрами гуминовых кислот [193], вероятно, характеризует парамагнитные свойства как органической, так и неорганической компоненты этих объектов. Большой интерес с точки зрения образующихся структур меланинов имеет появление в ЭПР спектрах меланин2 (143К) и меланин1 (290К) сигналов с g факторами, равными 3.90 и 3.85 соответственно. Опираясь на характеристику спектров ГК [193] и литературные данные [259], можно отнести появление этих сигналов в комплексах, формируемых в коллоидных системах (2) и (1), на счёт участия ионов железа. Согласно литературным данным, в водных извлечениях чаги содержатся катионы, обладающие парамагнитными свойствами (по убыванию содержания): Mg> Mn> >Al> Zn>Fe>>Cu [56]. Для подтверждения наличия в исследуемых образцах меланинов ионов железа проведен их анализ после озоления с применением бумажной хроматографии. Во всех исследуемых образцах показано присутствие ионов Fe³⁺. Различие g факторов и форма линий данных сигналов в спектрах меланин2 и меланин1 свидетельствует о том, что ионы Fe³⁺ в них отличаются окруженим, а меланины структурной организацией. В случае меланин1, координационное число иона Fe³⁺ должно быть большим, чем для меланин2.

Анализ полученных нами данных позволяет расположить исследуемые объекты по возрастанию парамагнитных свойств органической компоненты объектов исследования: меланин0 → меланин1→ меланин2, на основании относительного возрастания сигнала с g=2.00 ЭПР спектров, соотнесенных как 1→1.1→1.4 соответственно. Казалось бы, в этой последовательности должна возрастать и антиоксидантная активность, однако самой высокой антиоксидантной активностью обладает меланин1 (46 кКл/100гмеланина). Более того, антиоксидантные свойства меланин2 (18,2 кКл/100гмеланина) в 1,5 раза ниже, чем у образца – меланин0 (27,5 кКл/100гмеланина). По-видимому, больший вклад в проявлении высоких антиоксидантных свойств меланин1 вносит появление только у этих частиц в ЭПР спектре сигнала с g=3.9 (при температуре 290 К), отнесённого к неорганической компоненте. Кроме того, координационное число иона Fe³⁺ в меланин1 больше, чем у Fe³⁺ в меланин2, что способствует повышению его АОА свойств [257].

Отличие структурной организации этих меланинов подтверждаются данными РСА. Анализ экспериментальных данных свидетельствует об аморфном состоянии всех исследуемых образцов (рисунок 18). В двух из них – меланин0 и меланин1 – обнаружен хлорид калия, находящийся в частицах в кристаллическом виде. Полученные дифрактограммы сравнивались с соответствующими кривыми из базы данных по порошковой дифрактометрии PDF-2, из неё была выбрана демонстрационная рентгеновская дифрактограмма стандарта № 00-041-1476. Дифракционные пики этого стандарта соответствовали имеющимся на дифрактограммах образцов меланин0 и меланин1.

Необходимо отметить, что меланин2 имеет самую высокую зольность – 0,0116 мг/0,1 г меланина, меланин0 – 0,0047 мг/0,1 г меланина, меланин1 – 0,0069 мг/0,1 г меланина. Формирование меланин2 происходит в коллоидной системе (2) при обработке водного извлечения чаги этилацетатом в дисперсионной среде вода-этилацетат.

Рисунок 18 РСА образцов меланинов (с верху в низ – меланин0, меланин2, меланин1, меланин3)

В этой среде формируется новая дисперсная фаза из веществ, находившихся в свободном и слабосвязанном с дисперсной фазой водного извлечения состоянии. Как показано, что часть липидов, в том числе и полярных, участвует в образовании меланин2. В его состав входит фенольная компонента, обеспечивающая его парамагнитные свойства. По-видимому, для стабилизации дисперсной фазы коллоидной системы (2) (меланин2), требуется большее количество зольных элементов участвующих в соле– и комплексообразовании. Это подтверждает ИК спектр меланин2. Выделение меланин2 проведено этанолом. Это тоже могло отразиться на формировании его структуры и парамагнитных центров и, как следствие, в проявлении меланином парамагнитных свойств. Согласно данным ЭПР спектроскопии, наблюдается более равномерное, возможно, радиальное распределение ПМЦ по образцам меланин1 и меланин2 (на основании симметричности сигналов с g=2.00 и g=2.10). Исследуемые ассоциаты различаются по подвижности, входящих в них компонентов. В ряду, составленном по возрастанию подвижности структурных элементов, входящих в состав хромогенов: меланин1→меланин0→меланин2 (на основании изменения ширины линии сигнала с g=2.10 ЭПР спектров), убывают их антиоксидантные свойства. Возможно, проявлению высоких антиоксидантных свойств меланин1 способствует также его меньший размер (R_эфф = 80 нм) по сравнению с меланин0 (R_эфф = 148 нм) [227,254,255,257].

Применённый подход позволил определить липиды и фенольные соединения, находящиеся в связанном состоянии с дисперсной фазой коллоидной системы водного извлечения чаги. Многие из них относятся к биологически активным, что позволяет объяснить терапевтическую эффективность водных извлечений. Кроме того, получено несколько коллоидных систем на основе водного извлечения чаги, различающихся составом и антиоксидантной активностью, что перспективно для разработки на их основе БАД и лекарственных препаратов. Использование органических растворителей может сказаться на токсичности получаемых образцов. Проведено испытание на острую токсичность коллоидных систем (1) и (3), полученных после обработки водного извлечения этилацетатом (ФунгиБ1 и ФунгиБ2), и коллоидной системы (1) при использовании петролейного эфира (ФунгиБ3). Все три образца имеют величину LD₅₀ более 5000 мг/кг (пероральное введение), что соответствует IV классу опасности по [260] или практически нетоксичным веществам по классификации [261], а также не превышает токсичности других препаратов, созданных на основе чаги [262]. Следовательно, коллоидные системы, получаемые при экстракции водного извлечения чаги органическими растворителями, могут быть в дальнейшем использованы для разработки на их основе БАД и лечебно-профилактических средств различной направленности действия [256]. Разделение коллоидной системы водного извлечения при последовательном применении различных осаждающих агентов.

Поскольку водные извлечения чаги представляют собой полидисперсную коллоидную гидрофильную систему, то выделение максимально возможного количества её дисперсной фазы всегда представляло интерес у исследователей. Еще перспективней получить фракцию дисперсной фазы, обладающую уникальными физико-химическими свойствами и биологической активностью, для разработки эффективных лекарственных средств.

Было установлено, что коллоидная система водного извлечения чаги достаточно устойчива при добавлении к ней нейтральных солей одновалентных катионов, таких, например, как хлористый натрий. Эффективно осаждают меланин и другие электролиты при использовании их в низкой концентрации, например, хлористый кальций в концентрации 16 %, алюминиевые квасцы в концентрации 8 % и уксуснокислые соли свинца, меди и цинка в концентрации 2 % [64]. Минеральные кислоты, хлористоводородная, серная и фосфорная осаждают меланин при значениях рН =2-2,5 [64]. Практическое применение имеет осаждение меланина хлористоводородной кислотой, которое используют для оценки содержания меланина в получаемых водных извлечениях как в исследовательских целях, так и для подтверждения качества фармацевтических препаратов, например бефунгина. Именно с его количественным содержанием в водном извлечении чаги связывают терапевтическую эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе водных извлечений [53]. Хлористоводородной кислотой осаждается 9-15 % меланина от взятого на экстракцию сырья или 50-70 % от сухого остатка водного извлечения чаги [55,168]. Выделенный осаждением хлористоводородной кислотой меланин не растворим в воде, но растворяется в щелочных растворах [55].

В ряде работ [173,249,255,256,263] проведены исследования по последовательному выделению дисперсной фазы водного извлечения чаги при смене рН среды. Седиментация дисперсной фазы водного извлечения чаги, полученного из сырья чаги XII при добавлении хлористоводородной кислоты, позволяет получить 13,58 % меланина от сухого веса взятой на экстракцию чаги. Эффективный радиус частиц остающейся коллоидной системы фильтрата составляет 94 нм [255]. Добавление к нему в отдельности, хлористоводородной кислоты, этанола или водного раствора гидроокиси калия не приводит к дополнительному осаждению меланина. Применение спиртового раствора щёлочи позволяет осадить дополнительно 4,79 % меланина. Обозначим первый меланин, осаждённый кислотой, как М_К1, а второй, осаждённый щелочью, М_щ2. Соответственно, фильтрат, полученный после первого осаждения – фильтрат К1, а после второго осаждения – фильтрат Щ2 [249,256].

Сначала проведено осаждение водного извлечения спиртовым раствором щёлочи. Получен М_щ1 в количестве 17,24 % от сухого веса взятой на экстракцию чаги. Осаждение фильтрата (фильтрат Щ1) проведено хлористоводородной кислотой, и получен М_к2, в количестве 2,01 %, а также фильтрат К2. Суммарно, при последовательном осаждении водного извлечения чаги сначала кислотой, а затем щелочью и наоборот – получено почти равное количество меланина. Причём осаждение водного извлечения чаги спиртовым раствором щелочи позволяет получить на 26,95 % меланина больше, чем осаждением хлористоводородной кислотой [256].

Для определения включения фенолов, углеводов, белка в состав меланина при применении осаждающих агентов было определено их количество в фильтратах [173,263]. Полученные результаты приведены в таблице 23. При осаждении водного извлечения кислотой в состав М_к1 переходит 79,14 % фенольных соединений, 58,52 % углеводов и 89,40 % белка, находившихся в водном извлечении в свободном состоянии.

Таблица 23 Содержание фенолов, углеводов и белка в водном извлечении чаги и фильтратах, полученных при применении различных осаждающих агентов

Примечание: * – от сухих веществ объекта исследования

Осаждение водного извлечения спиртовым раствором щёлочи приводит к более полному переходу свободных фенольных соединений (93,48 %) и углеводов (83,41 %) в состав меланина. При этом количество белка в фильтрате остается на уровне его содержания в свободном состоянии в водном извлечении чаги или незначительно превышает это значение. То есть, в этом случае белок стабилизируется в фильтрате и не ассимилируется с осаждаемым М_щ1. Зольность М_щ1 (0,0325 г/0,1гМ_щ1) возрастает по сравнению с зольностью М_к1 (0,0047 г/0,1 г М_к1) в семь раз [173,263].

После осаждения водного извлечения хлористоводородной кислотой получается фильтрат с низким значением рН (2-2,5). Добавление спиртового раствора щёлочи создает такие условия дисперсионной среды, что происходит высаливание белка. Массовая доля сырого протеина в водном извлечении чаги составляет 2,77 % от сухого остатка водного извлечения чаги. Содержание белка в фильтрате Щ2 в пересчёте на сухой остаток водного извлечения чаги составляет 2,78 %. Практически весь белок, содержащийся в водном извлечении чаги, полностью остаётся в фильтрате, не входя в состав выпадающего в осадок М_щ2. В его состав переходит 89,58 % оставшихся фенольных соединений и 89,18 % углеводов [173,263].

После осаждения водного извлечения спиртовым раствором щёлочи фильтрат имеет щелочную реакцию среды (рН≈8-9). Добавление кислоты к этому фильтрату приводит в полному включению оставшегося белка в состав М_к2. В его состав также переходит 58,11 % оставшихся углеводов. Фенольные соединения при осаждении частиц дисперсной фазы этой коллоидной системы, наоборот, переходят из М_к2 в фильтрат К2, и количество этих соединений возрастает в нём почти в два раза по сравнению с их количеством в фильтрате Щ1, из которого осаждают М_к2 [173,263].

Показано, что анализируемые меланины различаются и по другим физико-химическим характеристикам. Электронные спектры М_к1 и М_щ1 практически идентичны. Резко отличаются от них спектры меланинов, которые были выделены из фильтратов, полученных после их осаждения из водного извлечения чаги. Спектр М_щ2, в состав которого, в отличие от остальных меланинов, не входит белок, имеет самые низкие значения оптической плотности из всех объектов исследования. Спектр М_к2, в отличие от других меланинов, имеет максимум поглощения при 270-280 нм. Это подтверждает то, что при осаждении в его состав переходит весь белок, содержавшийся в фильтрате. Кроме того, отнесение этого поглощения к белку в спектре М_к2 может подтвердить потеря им при его осаждении части фенольных соединений, имеющих поглощение в этой же области спектра.

Обсуждаемые различия в структуре меланинов отражены в ИК-спектрах. Основным отличием меланинов является то, что М_щ1 содержит в семь раз больше зольных элементов по сравнению с М_к1. Действительно, в спектрах наблюдаются 4 сильных полосы поглощения с ν_(С-О) = 1240 см ^– 1 и ν_(С=О) = 1720 см ^– 1, отнесенные к колебаниям карбоксильной группы, а также ν_S = 1400 см^– 1 и = 1620 см ^– 1 , отнесенные к карбоксилат иону [8]. В спектре М_щ1 относительные интенсивности полос при 1400 см ^– 1 и 1620 см ^– 1 увеличиваются по сравнению с интенсивностью полос 1240 см ^– 1 и 1720 см ^– 1 в спектре М_к1. Это свидетельствует о наличии в М_щ1 большего количества карбоксилат ионов по сравнению с присутствием в М_к1 большего количества свободных карбоксильных групп.

Определена антиоксидантная активность полученных меланинов. Осаждение водного извлечения чаги хлористоводородной кислотой позволяет получить М_к1 с антиоксидантной активностью (27,5 кКл/100 г) в 1,6 раз выше, чем М_щ1 (17,0 кКл/100 г) при использовании для осаждения спиртового раствора щёлочи. Антиоксидантная активность М_щ2 составляет 108,0 кКл/100 г, что в четыре раза выше, чем у М_к1. Антиоксидантная активность М_к2 составляет всего 6,8 кКл/100 г. Возможно, столь большое различие этих значений у М_щ2 и М_к2 объясняется тем, что исключение белка при формировании М_щ2 делает более доступными участки меланина, отвечающие за его антиоксидантные свойства. Большую роль может играть потеря части фенольных соединений М_к2, которые переходят в фильтрат при его осаждении. Кроме того, необходимо отметить, что после осаждения М_к1 в фильтрате формируется новая коллоидная система, дисперсная фаза которой обладает высокой антиоксидантной активностью [256].

Физико-химические характеристики и, в том числе, антиоксидантная активность полученных меланинов свидетельствуют о их различной структурной организации. Это хорошо коррелирует с включением в состав меланинов фенольных соединений, углеводов и белка при различных способах их выделения.

Для отделения биологически активных соединений различных классов, находящихся в фильтрате в связанном с его дисперсной фазой состоянии, проведена последовательная исчерпывающая экстракция фильтрата с различными вариантами применения органических растворителей [249]. Эксперимент проведен по двум схемам: по схеме 1 последовательную обработку фильтрата осуществляли петролейным эфиром, смесью хлороформ-этанол (2:1), диэтиловым эфиром, этилацетатом и бутанолом, а по схеме 2 – после петролейного эфира применяли диэтиловый эфир, затем смесь хлороформ-этанол (2:1) и затем, как в схеме 1 [264]. Далее экстракты, полученные с применением петролейного эфира и диэтилового эфира, обозначаются ПЭ экстракт и ДЭ экстракт соответственно. Суммарно по обеим схемам удаётся отделить около 56-58 % веществ от сухого остатка фильтрата. Однако применение первой схемы позволяет получить больше экстрактивных веществ, переходящих в хлороформэтанольный экстракт (полярные липиды и сопутствующие им соединения) и ДЭ экстракт (ароматические кислоты, катехины и агликоны флавонолов). Применение второй схемы позволяет получить больше экстрактивных веществ, переходящих в этилацетатный экстракт (эфиры ароматических кислот, а также моногликозиды и частично дигликозиды флавонов, флаванонов и флаванолов) и бутанольный экстракт (полигликозидные формы фенольных соединений) [249].

Таблица 24 Содержание экстрактивных веществ в объектах исследования

Примечание: * – от сухих веществ фильтрата

Как видно из данных таблицы 24, максимальное количество экстрактивных содержится в бутанольном экстракте. Следовательно, в связанном состоянии в фильтрате находится много веществ, относящихся к полигликозидным формам фенольных соединений, и они становятся более доступными для их извлечения из дисперсной фазы фильтрата. Анализ ПЭ экстракта с помощью тонкослойной хроматографии позволил выявить присутствие в дисперсной фазе фильтрата моно– и триглицеридов, стеринов и эфиров стеринов или восков. Содержание стеринов и их эфиров составляет 0,29 % от сухих веществ фильтрата. С помощью газожидкостной хроматографии определён состав высших жирных кислот петролейного экстракта. Были идентифицированы семь высших жирных кислот: тридекановая (С_13:0), миристиновая (С_14:0), миристолеиновая (С_14:1), пентадекановая (С_15:0), пальмитиновая (С_16:0), гептадекановая (С_17:0), олеиновая (С_18:1), две из которых являются мононенасыщенными кислотами [249]. С помощью ТСХ идентифицированы моно– или дигалактозилдиглицерид, лизофасфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и два неидентифицированных соединения, которые, согласно применённым проявителям, можно отнести к гликолипидам или фосфолипидам. Количество гликолипидов, полученных по первой схеме экстракции, составляет 0,1 % от сухих веществ фильтрата, по второй – 0,03 %. Количество содержащих аминогруппу липидов, полученных по первой схеме экстракции, составляет 0,19 % от сухих веществ фильтрата, а по второй схеме – 0,13 %. Максимально в связанном состоянии в фильтрате содержится 0,1 % гликолипидов и 0,19 % липидов, содержащих аминогруппу, то есть 0,09 % из них приходится на фосфолипиды [249].

ДЭ экстракт фракционирован путем последовательной обработки растворами NaHCO₃ и NaOH по методике [5]. Получены фракции, содержащие фенолкарбоновые кислоты (ФК1 и ФК2) и фенолы (Ф1 и Ф2). С помощью ТСХ в экстракте определены вератровая, ванилиновая, сиреневая, п-оксибензойная, п-кумаровая, ß-резарциловая, м-оксибензойная, протокатеховая, галловая кислоты и пять неидентифицированных соединений. Согласно максимумам поглощения (1 – λ max, нм = 236, 279; 2 – λ max, нм = 249, 279) в электронных спектрах фракций Ф1 и Ф2 содержатся простые фенолы, часть из которых могут иметь в ядре кислородные заместители (такие, как OH, OCH₃) [249]. Количество фенолкарбоновых кислот во фракциях составляет: в ФК1 – 32,50 %, в ФК2 – 24,28 % от сухих веществ ДЭ экстракта. Количество простых фенолов во фракциях составляет: в Ф1 -17, 50 %, в Ф2 – 10,00 %. Таким образом, суммарное содержание фенолкарбоновых кислот и простых фенолов составляет 50 % от сухих веществ ДЭ экстракта [249].

Электронные спектры этилацетатного экстракта имеют соответствующие максимумы поглощения и могут свидетельствовать о содержании в нем: 250-270, 310-350 нм – флавонов, 255-265 нм – изофлавонов и 275-290, 290-330 нм флаванонов [242]. Для разделения этих соединений была применена бумажная хроматография. Использованы две системы растворителей: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5) и 15 % уксусная кислота. В качестве проявителей использованы пары аммиака для обнаружения фенольных веществ и специфический проявитель – 1 % спиртовой раствор AlCl₃ для обнаружения флавоноидов [264,265]. Проведённое разделение этой фракции позволило выявить кроме апигенина, ранее найденного в фильтрате, ещё восемь соединений: нарингенин, кемпферол, 3метокси-4,5-диоксифлавон-7-О-неогесперидозид, гиперин, мирицетин, госсипетин, робинетин, 3',4',5'-триоксифлавон-7-О-рутинозид и два соединения, которые были неопределены.

Бутанольный экстракт проанализирован аналогично этилацетатному экстракту. В его электронном спектре наблюдаются максимумы поглощения: 234, 261 нм, которые, согласно литературным данным [242], могут свидетельствовать о содержании гликозидированных флаванонов, например, гесперидин-3-Оглюкозида (234, 280, 311 нм). Проведённая бумажная хроматография позволила обнаружить в этом экстракте нарингенин-7-Онеогесперидозид (наренгин) [266] и два неидентифицированных соединения.

В водных остатках, полученных после проведения последовательной экстракции фильтрата органическими растворителями по первой и второй схемам (О1 и О2 соответственно), определено содержание углеводов, фенольных соединений и белка (таблица 25). Применение второй схемы экстракции фильтрата органическими растворителями позволяет получить в водном остатке большее количество углеводов.

Таблица 25 Содержание углеводов, фенольных соединений и белка в объектах исследования

Примечание: * – от сухих веществ фильтрата

Данные, полученные по обеим схемам экстракции, показывают, что большая часть фенольных соединений, находящихся в свободном или слабосвязанном состоянии в фильтрате, определены в полученных ранее экстрактах. Белка в свободном или слабо связанном состоянии в фильтрате не обнаружено, вероятно, он ассоциирован с дисперсной фазой фильтрата [249].

Применённый способ разделения веществ, находящихся в фильтрате после осаждения меланина из водного извлечения чаги хлористоводородной кислотой, позволил определить, что в свободном или слабосвязанном состоянии с дисперсной фазой фильтрата находится 61, 38 % от его сухих веществ. В их состав входят биологически активные соединения различных классов: мононенасыщенные высшие жирные кислоты, стерины и их эфиры, фосфолипиды и гликолипиды, фенолкарбоновые кислоты, фенолы и вещества, относящиеся к различным классам флавоноидов. Полученные данные показывают, что перспективно использовать фильтрат в качестве самостоятельного объекта для разработки БАД и лекарственных препаратов на его основе, а также при получении БАД и лекарственных препаратов на основе выделенного до этого меланина.

Разделение коллоидной системы водного извлечения чаги с помощью электрофореза.

Горизонтальный электрофорез успешно используют для фракционирования гумусовых веществ почвы [267]. Гумусовые вещества на электрофоретограммах передвигаются со старта по направлению к аноду и разделяются при этом на фракции, образуя зоны, количество которых зависит от природы вещества и условий проведения электрофореза. Так, при кратковременном электрофорезе с применением буфера слабощелочной реакции (рН 8,6) и при напряжении 110 – 300В природные и искусственно приготовленные гуминовые кислоты разделяются на три-четыре фракции. Меланины так же, как и гумусовые кислоты, можно отнести к полианионам. Об этом свидетельствуют физико-химические характеристики этих объектов, такие, как ИК, ЭПР спектры и ряд других свойств [10,11,186,194,268].

Для электрофоретического разделения фенолов на бумаге применяют различные буферные системы. Водный раствор муравьиной кислоты (рН 2,4) используют, например, для разделения антоцианов и бетацианов [269].

Водные извлечения чаги содержат фенольные соединения как связанные в составе меланина, так и свободные. Водное извлечение чаги – это сложная по химическому составу коллоидная полидисперсная система. Исследование водных извлечений чаги с помощью электрофореза позволит разделить золь на фракции, подвижные в электрическом поле. Это более мягкое воздействие на природный золь водного извлечения чаги и его дисперсную фазу по сравнению с гидролизом. Привлечение этого метода к исследованию водных извлечений чаги может помочь ответить на вопросы о закономерностях формирования золя и структуре меланина.

Электрофорез водного извлечения чаги на бумажном носителе 1 Электрофорез водного извлечения чаги при использовании муравьиного буфера. В водном извлечении чаги при рН 2– 2,5 происходит седиментация золя с выпадением дисперсной фазы. При этом в условиях проведения электрфореза образующиеся под действием электрического поля частицы могут захватывать соединения, находившиеся в золе в свободном состоянии в составе дисперсионной среды, такие, например, как полисахариды, белки, фенольные соединения [270]. Агрегация частиц меланина на стартовой линии при седиментации должна привести к меньшей подвижности хромогенов меланина в электрическом поле и способствовать подвижности свободных или слабо связанных с ним ассоциатов или соединений. При этом продвижение не связанных фенольных соединений к катоду должно облегчить наличие в водном извлечении высокого содержания зольных элементов -25-50 % [56].

Действительно, использование буфера с рН среды, близкой к седиментации меланина, приводит к низкой подвижности хромогенов на электрофоретограмме [271]. В этой буферной среде на них наблюдается слабо окрашенный фронт, продвигающийся по направлению к аноду. Кроме этого, отмечается меньший по интенсивности окраски и длине продвижения фронт, двигающийся к катоду. Как в первом, так и во втором случаях не происходит отделения подвижного окрашенного фронта от интенсивно окрашенной коричневой зоны на стартовой линии. На стартовой линии остаётся основное количество хромогенов, судя по тёмно-коричневой окраске этой зоны. Можно предположить, что под действием электрического поля в муравьином буфере наблюдается движение свободных либо слабо связанных с меланинам фракций водного извлечения чаги. В УФ-свете отделившиеся подвижные хромогены флуоресцируют, приобретая зеленоватую окраску. Обработка электрофоретограмм парами аммиака усиливает цвет фронта. Оба факта указывают на то, что продвигающиеся по электрофоретограмме соединения относятся к классу фенолов. Можно предположить, что наблюдаемые подвижные соединения могут быть сложно организованы. На всех электрофоретограммах яркость фронта продвигающегося к аноду не превышает шести, а к катоду – двух единиц яркости.

Исследована подвижность фракций дисперсной фазы фильтрата, остающегося после удаления меланина из водного извлечения чаги осаждением его хлористоводородной кислотой [271-274]. Определен оптимальный режим проведения электрофореза фильтрата при силе тока в 20мА, который обеспечивает движение частиц золя фильтрата в большей степени к аноду и в меньшей – к катоду. Проведено проявление электрофоретограмм парами аммиака, нингидрином и раствором азотнокислого серебра. С помощью качественных реакций, кроме хромогенов, во фракциях, отделившихся от стартовой линии, подтверждено присутствие аминокислот и соединений с восстанавливающими свойствами, обладающими подвижностью в электрическом поле [271].

Использование электрофореза водного извлечения чаги в среде муравьиного буфера эффективно для изучения веществ, находящихся в свободном и слабосвязанном состоянии с его дисперсной фазой. При низких показателях силы тока и напряжения облегчается фракционирование меланина в зоне стартовой линии, движение частиц, находящихся в золе в свободном состоянии, затруднено. Высокие значения силы тока и напряжения усиливают седиментацию меланина на стартовой линии, при этом облегчается движение веществ, имеющих заряд, находящихся в золе в свободном состоянии, и, возможно, ассоциатов и очень мелких частиц.