Текст книги "Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги"

В природном образце, в отличие от синтетического, не сформировались структуры нано агрегатов, а наблюдаются длинные непрерывные слои. Расстояние их укладки у бычьего эумеланина также определено равным 3.8˚A. Частицы с диаметром 5.8 нм в этом образце уже не наблюдаются, и интересно то, что предложенные размеры протомолекул частицы эумеланина в этом случае также не очевидны. Возможно, что на изображении длинные непрерывные слои состоят из протомолекул меланина, соединенных в поперечном направлении.

Рисунок 35 Изображение TEM эумеланина бычьего эпителия демонстрирует укладку в нем слоев. Латеральный размер слоев намного больше, чем у синтетического меланина, что, вероятно, связано с различными условиями его растворения во время формирования

Это очень похоже на нити, наблюдаемые с помощью AFM (рисунки 22 и 24). Отличия в изображениях, возможно, связаны с подготовкой образца и примененной техникой проведения иссдедования.

Хотя общеизвестно, что эумеланин нерастворим в воде и органических растворителях, разработан способ получения растворимого синтетического эумеланина в диметилформамиде (DMF) и диметилсульфоксиде (DMSO) [343]. Растворение эумеланина в этих растворителях не нарушает их спектральных свойств. Изображения TEM получены для растворимых синтетического и природного эумеланинов. Типичная картина, наблюдаемая в изученных образцах, приведена на рисунке 36.

Укладка слоев в образце больше не видна, это, вероятно, связано с тем, что растворение эумеланина в DMF привело к её нарушению. Следовательно, при растворении меланина, возможно, разрушаются водородные связи (или иные взаимодействия) между протомолекулами меланина, с помощью которых они были соединены в поперечном направлении и формировали длинные непрерывные слои.

Рисунок 36 Изображение TEM растворимого синтетического эумеланина. Укладка в слои больше не наблюдается, предполагается, что именно это влияет на его растворимость

Согласно ранним представлениям пигмент или хромоген природного меланина является полимером, который образован из мономеров фенольной природы. Однако доказательства отсутствия полимерной структуры, как в синтетических, так и в природных меланинах, достаточно весомы и основаны на современных методах исследования.

Большинство экспериментальных данных, особенно полученных с помощью SAXS и WAXS, свидетельствует о том, что структура меланинов неоднородна и разупорядочена.

По данным масс-спектрометрии в меланинах определены различные структуры с низкой молекулярной массой. Объекты с большой молекулярной массой, которые бы соответствовали полимерным структурам не обнаружены и не подтверждены с помощью других методов исследования.

Размеры протомолекулы эумеланина в латеральном размере около 20Ǻ и с высотой ~ 10Ǻ, полученные с помощью сканирующей тоннельной микроскопии STM, слишком малы, чтобы в них разместился полимер.

На основании того, что мы имеем дело с очень неоднородной системой, ни одна однозначно определенная структура меланина не отражает существующую реально так, как это наблюдается у структур белков и молекул ДНК.

На определяемую структуру большое влияние будет оказывать выделение природного эумеланина, так как извлечение в жестких условиях приводят к его повреждению [299]. Структура эумеланина также, вероятно, будет сильно зависеть от источника получения. Учитывая различия между образующими мономерами, у эумеланина почти наверняка структура будет отличаться от феомеланина. Отношение DHI к DHICA в эумеланине также, как известно, значительно различается в образцах, и это, несомненно, окажет сильное влияние на его первичную и вторичную структуры. Так, например, эумеланин, полученный ферментативным способом, содержал ~ 10 %-й DHICA, тогда как природные эумеланины могут содержать его до 75 % [344,345]. Хотя все перечисленные факторы будут влиять на структурную организацию меланина, однако, как показано ранее, в их структуре есть много общего.

Рассматрим структуру алломеланина чаги с позиций его первичной и вторичной структурной организации.

До сих пор нет однозначной информации о том, что является структурной единицей меланина чаги. Его мономерным звеном считают фрагменты разрушаемого грибом лигнина, либо пирокатехин или 1,8-дигидронафталин. В ряде работ показано, что из меланина чаги выделен пирокатехин [8,9,241 и др.] и нет данных по выделению из него 1,8-дигидронафталина. Однако в более современных исследованиях [151-153] показано, что из меланина выделены более сложно организованные фенольные соединения, такие, например, как феллигридины А, D, E и G, иноскавины А и В, инобилины А, В и С, эпигаллокатехин. Они с большей вероятностью могут выполнять функции олигомеров или участвовать в их биосинтезе, а в частице меланина обеспечивать тот широкий спектр гетерогенных физических и химических свойств, который был описан ранее.

Что касается вторичной структуры меланина, отнесенного к алломеланинам, то существуют два взгляда на его организацию [10,11,54,160,161,181,346]. Ряд авторов считает, что его структура сформирована на основе полимера, который образуется из фрагментов разрушаемого грибом лигнина другие, полагают, что физико-химические свойства меланина могут быть обеспечены протомолекулами, образованными олигомерами, в которых мономерами являются простые фенольные соединения.

Чаще в литературе меланин называют полимером. Известно, что пропилфенольные единицы под воздействием фенолоксидаз грибов могут образовывать поликонденсаты, которые могут быть организованы как сложный трехмерный полимер нерегулярного строения, структурными единицами которого являются эфиры синапового и кониферилового альдегидов, ванилин, сиреневый альдегид, сиреневая, ванилиновая, п-оксибензойная, галловая и протокатеховая кислоты и их производные [148,159,160, 184,185]. В качестве «захваченных» молекул и макромолекул можно рассматривать фенолы, карбоновые кислоты, флавоноиды, высокомолекулярные компоненты – полисахариды, белки, а также зольные элементы. Эти представления хорошо согласуются с данными о том, что гуминоподобные вещества обладают неустойчивой молекулярной структурой, могут иметь различную степень полимеризации и под воздействием различных факторов легко уплотняются, окисляются и конденсируются. Следствием конденсации и уплотнения молекулы гуминовой кислоты, а также полифенолоксикарбонового комплекса является повышение количества углерода и уменьшение кислых функциональных группировок [62,159,182, 184]. Однако приведенные ранее в этой работе исследования меланинов природного происхождения не согласуются с присутствием в его структуре полимера и, следовательно, представления о его структурной организации должны формироваться на современных экспериментальных данных.

Рассмотрим, какие вещества входят в состав частицы меланина, и может ли их состав влиять на её размеры и другие физико-химические свойства. К гидрофильной компоненте частицы можно отнести белки, полисахариды, часть фенольных соединений и ряд других. Частицы меланина могут содержать до 21,3 % гидрофобных веществ, представленных триацилглицеридами, высшими жирными кислотами (до 0,15 % от сухого остатка водного извлечения чаги), стеринами (до 0,14 % от сухого остатка водного извлечения чаги), терпенами, углеводородами [226,228,229], олигомерами, синтезированными на основе фенольных соединений (например, пирокатехина). Следовательно, гидрофобные соединения должны быть соответствующим способом упакованы в частице и могут входить в состав субагрегата. Он в свою очередь является составной частью агрегата, в который должна входить протомолекула меланина.

Рисунок 37 Модель «жемчужного ожерелья», описывающая ассоциацию ПАВ с полимером [347]

Один из вариантов возможной организации гидрофобной фазы в частице меланина можно представить, воспользовавшись моделью «жемчужного ожерелья» [347], представленной на рисунке 37. Эту модель используют для описания взаимодействия гомополимеров и ионных ПАВ. Согласно этой модели, молекулы ПАВ образуют вдоль полимерной цепи мицеллоподобные кластеры. В качестве полимеров, участвующих в организации меланина, можно рассматривать молекулы белков, входящих в его состав. Мицеллоподобные кластеры в меланине должны быть сложно организованы. Они могут быть представлены не только мицеллами, но с большей вероятностью, ламеллами. В их состав в качестве ПАВ могут входить полярные липиды. Действительно, было показано, что в составе коллоидной системы водного извлечения чаги имеется достаточно ПАВ, таких как фосфо– и гликолипиды, белок [173, 226,228,229,235]. Они могут участвовать в удержании гидрофобных веществ, таких как нейтральные липиды различных классов [8,12-15,228,229], в составе частицы меланина. В этом случаегидрофобные вещества, входящие в состав меланина, могут также непосредственно ассоциироваться с гидрофобными участками полипептидной цепи белковой молекулы.

Другим вариантом биологических объектов имеющих в своем составе гдрофильные и гидрофобные соединения близкие по размеру и веществам, защищаемым от гидрофильной среды меланинам чаги являются хиломикроны, липопротеины высокой (ЛПВП), низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Это эффективная транспортная форма, используемая для переноса экзогенных жиров в организме человека (рисунок 38) [348]. Самые крупные из них (хиломикроны) имеют размер более 120нм и служат для транспорта липидов из клеток кишечника. Они самые емкие по содержанию в них триацилглицеридов (85 %), содержат мало белка (2 %), фосфолипидов (3 %), стеринов и их эфиров (2 и 3 % соответственно). Самые мелкие из них (7-15нм) – липопротеины высокой плотности. Они служат для транспорта холестерина из тканей в печень. В них содержится мало триацилглицеридов (3 %), но много белка (50 %), фосфолипидов (27 %) и, в особенности, эфиров стеринов (16 %) [348]. По количественному содержанию перечисленных соединений и по размеру к меланину чаги больше подходят хиломикроны. Хочется отметить, что выглядеть меланин при этом будет так, как показано на рисунках 23, 26, либо принимать более сложные формы, например в виде ламелл. Взаимодействия между его компонентами, при этом, могут быть аналогичными как в хиломикронах.

Рисунок 38 Структура и размеры липопротеинов плазмы крови

В образовании самоорганизованных наноструктур важную роль играет стерический фактор – соотношение размеров гидрофобной и гидрофильной частей молекулы ПАВ [294]. Это соотношение количественно характеризует критический параметр упаковки (α): α=V/(lΩ), где V – объём, занимаемый неполярной группой (углеводородным радикалом); l – длина развёрнутой углеводородной цепи; Ω – площадь поперечного сечения молекулы ПАВ.

Во многих случаях площадь поперечного сечения молекулы ПАВ определяется площадью полярной группы (Ω_p). Отношение V/l определяет площадь сечения неполярной части (Ω_n) молекулы. Следовательно, критический параметр упаковки – отношение площадей поперечных сечений углеводородной цепи и полярной группы. Физико-химическое значение критического параметра упаковки заключается в следующем. На образование структур из молекул ПАВ сильное влияние оказывают два фактора: взаимное отталкивание головных полярных групп соседних молекул и притяжение между гидрофобными цепями. Взаимодействие головных групп характеризует их эффективная площадь. Для ионогенных ПАВ это взаимодействие сильно зависит от концентрации электролита. Следовательно, кроме химической структуры ПАВ на образование субагрегатов влияет среда, в которой они образуются.

Важнейшей количественной характеристикой мицелл является агрегатное число (m) – число молекул (ионов) ПАВ в одной мицелле. В прямых мицеллах агрегатное число составляет несколько десятков (как правило, не менее 20). Агрегатное число зависит от строения и размеров молекул ПАВ, а также от размеров мицеллы:

m=V_m/V_n ,

где V_m – объём углеводородного ядра прямой мицеллы; V_n – объём неполярной части молекулы ПАВ. Объём сферической мицеллы равен:

V_m = 4πl³/3,

где l – длина развёрнутой углеводородной цепи.

Из двух последних уравнений можно вывести следующее:

m=4πl³/(3 V_n)

Безразмерное соотношение V_n/( Ω_pl)= α – это критический параметр упаковки. Следовательно, на размер мицелл влияет: строение и размер молекул (например, длина цепи углеводородного радикала), участвующих в её формировании, и среда, в которой они образуются [294,349].

Эти теоретические воззрения можно использовать как для описания нативной структуры частицы меланина, так и для изменения её структуры при различных воздействиях на коллоидную систему водного извлечения чаги. Опираясь на них, можно продолжить сравнение структуры меланина со сложно организованными молекулами, такими, как белки и ДНК, и описать третичную и четвертичную структуры меланина чаги, а также объяснить его некоторые физико-химические свойства.

Под третичной структурой меланина можно понимать укладку гидрофобной компоненты в составе частицы, по принципу модели «жемчужного ожерелья». При этом вероятно образование ламелярных структур, включающих протомолекулы меланина. Это хорошо согласуется с данныим TEM по бычьему эумеланину [343] и AFM по меланину Сепии [290]. Вероятно, что слои или нити на этих изображениях как раз и состоят из протомолекул меланина, соединенных в поперечном направлении с участием гидрофобных взаимодействий, организуемых при формировании частицы.

Четвертичная структура меланина в таком случае должна трактоваться как укладка гидрофобной и гидрофильной компонент частицы в пространстве, что легко представить по аналогии с другими биологическими молекулами, белками, ДНК и РНК, а также с более сложно организованными объектами, например, мембранами.

Размер частицы меланина чаги легко изменяется при различных воздействиях (химических, физических и биотехнологических) на коллоидную систему водного извлечения чаги, даже на её разбавление [162,169,178,198,207,214,217,254,257,271,275,276]. Одним из подтверждений лёгкой перестройки структуры частицы меланина и изменение её организации являются результаты исследований водных извлечений, полученных различными способами экстракции, подтверждённые с помощью метода ЯМР релаксации [257]. Другими подтверждениями этого факта могут служить исследования размеров дисперсных фаз коллоидных систем, полученных после обработки водного извлечения чаги органическими растворителями, [193, 212] а также при применении в экстракции чаги ферментов класса гидролаз [178,214,217].

Обработка водного извлечения чаги, проведённая этилацетатом или гиперразветвленным полимером Boltorn Н40, не только позволила изменить четвертичную структуру исходного меланина, но и привела к более глубокой модификации его структуры, вполне возможно, затронув его третичную или даже вторичную структуру, что подтверждают данные ЭПР, РСА и AFM [226-228,257, 303,346].

Все перечисленные наблюдения легко могут быть обяснены тем, что меланин состоит из множества ультрадисперсных частиц – агрегатов, субагрегатами которых является протомолекула меланина. Гидрофобная компонента может быть ассоциирована как с протомолекулой, так и с белками, ассоциированными в частице меланина. Именно в этом случае такие частицы легко дезагрегируют и снова агрегируют под действием электростатических сил и слабых межмолекулярных взамодействий. В этом случае легко трактуются существенные различия в ЭПР спектрах меланинов, выделенных до и после обработки этилацетатом или гиперразветвленным полимером Boltorn Н40, коллоидных систем водных извлечений чаги [227,254,257,303]. Перекомпановка мелких субагрегатов в составе частицы при таких воздействиях могла привести к конформационным изменениям. Можно предположить, что одним из парамагнитных центров является протомолекула меланина. Это должно было отразиться на его расположении в частице, и, соответственно, изменении активности. Кроме того, эти конформационные изменения в частице меланина приводили к появлению новых ПМЦ [257,303].

Только при участии ультрадисперсных субагрегатов могут образоваться частицы, имеющие идентичные физико-химические свойства. Это подтверждается в целом близкими характеристиками ИК и электронных спектров всех меланинов, как исходных, выделенных из водных извлечений чаги, так и полученных из коллоидных систем после проведения физических, химических или биотехнологических воздействий на водные извлечения чаги.

Таким образом, используя принцип универсальности построения биологических объектов, последние достижения в исследовании структуры меланинов, а также высокодисперсных коллоидных систем и меланинов чаги, расширены теоретические представления об их структурной организации.

Заключение

Еще много тайн существует в мире живой природы, к которой относится и гриб чага. Исследование высокодисперсных коллоидных систем водных извлечений чаги и меланина этого гриба, его физики, химии, биологической и терапевтической активности, хотя и начато около века назад, как показано в этой работе, хранит еще много загадок и перспектив для исследователей.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Булатов, П.К. Чага, её свойства и применение при раке IV стадии/ П.К. Булатов, М.П.Березина, П.А. Якимов // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 7-23.

2. Ludwiczak, R.S. Badania skladnikow chemicznych Inonotus obliquus. Lanosterol/ R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono// Roczn. Chem. – 1960. – 34. – 1. – P.77-84.

3. Кеmpska, K. Badania skladnikow chemicnych Inonotus obliguus. VI. Kwas 3β-hydrooksylanostadieno-8,24-karboksylowy-21/ K. Кеmpska, R.S. Ludwiczak, U. Wrzeciono// Roczn. Chem. – 1962. – 36. – P.14531457.

4. Krauss-Zaki, J. Aqueous extracts of Inonotus obliquus in the diagnosis of leukemias/ J. Krauss-Zaki //Postery hig. med. Dosw. – 1962. – 16. – P. 855-859.

5. Пясковский, С. Результаты опыта получения физиологически активного препарата из древесины берёзы бородавчатой (BETULA VERRUCOSA EHRH.), проросшей мицелием чаги [INONOTUS OBLIQUUS (FR.) PIL.] /С. Пясковский // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М. – Л.: Наука, 1966. – С. 121-126.

6. Taylor, A. Anticancer activity of plant extracts /A.Taylor // Texas Reports on Biologe a. Medicine. – 1956. – 14, – 4. – P.543.

7. Патент 1805968. способ получения средства, обладающего противоязвенной и адаптогенной активностью/ Г.Л. Рыжова, С.С.Кравцова, И.В.Богданова [и др.].

8. Рыжова, Г.Л. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги/ Г.Л. Рыжова, С.С.Кравцова, С.А.Матасова [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. 1997. № 10. С.44-47.

9. Калашникова, Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин»: автореф.дис. канд.фарм.наук/ Е.А.Калашникова. – Пятигорск, 2003. – 23с.

10. Бабицкая, В.Г. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliquus / В.Г. Бабицкая, В.В. Щерба, Н.В. Иконникова// Прикладная биохимия и микробиология. – 2000. – Т. 36. – № 4. – С. 439-444.

11. Кукулянская, Т.А. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании/ Т.А. Кукулянская, Н.В. Курченко, В.П. Курченко //Прикладная биохимия и микробиология. – 2002. – Т. 38, № 1. – С. 6872.

12. Каhlos, K. Studies on triterpenes in Inonotus obliquus/ K.Каhlos//Dissertation Abstracts International. – 1989. – Vol.49. – № 1. – Р. 109.

13. Каhlos, K. 3beta-hydroxy-lanosta-8,24-dien-21-al, a new triterpene from Inonotus obliquus/ K. Каhlos, R. Hiltunen, V. Schantz// Planta Med. – 1984. – Vol.50. – № 2. – Р. 197-198.

14. Каhlos, K. Antitumor activity of triterpenes in Inonotus obliquus/ K.Каhlos, R. Hiltunen, L. Kangas//Planta Med. – 1986. – Vol. 52. – № 6. – Р. 554-556.

15. Mazurkiewicz, W. Analisis of aqueous extract of Inooyus obliquus/ W.Mazurkiewicz//Acta Pol Pharm. – 2006. – 63. – 6. – P. 497501.

16. Rzymowska, J. Antimitotic activity of aqueous extracts of Inonotus obliquus / J. Rzymowska// Boll. Chim. Farm. – 1996. – Vol.135. – 5. – P. 306-309.

17. Rzymowska, J. The effect of aqueous extracts from Inonotus obliquus on the mitotic index and enzyme activities / J. Rzymowska// Boll. Chim. Farm. – 1998. – Vol.137. – 1. – P. 13-15.

18. Birošova, L. Antimutagenic effect of phenolic acids/ L. Birošova, M. Mikulašova, Š. Vaverkova// Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. – 2005. – 149. – 2. – Р.489-491.

19. Цзян, Ц.Х. Противоопухолевая активность и ингибирование множественной лекарственной устойчивости раковых клеток с помощью веществ, выделенных из Inonotus obliquus/ Ц.Х.Цзян, Я. Доу, Ю.Ц. Фен и [и др.]// Микология и фитопатология. – 2007. – Т. 41. – № 5. – С. 455-460.

20. Nakajima, Y. Antioxidant small phenolic ingredients in Inonotus obliquus (persoon) Pilat (Chaga) / Y.Nakajima, Y.Sato, T. Konishi// Chem Pharm Bull (Tokyo). – 2007. – 55. – 2. – P. 1222-1226.

21. Lee, I.K. New antioxidant polephenols from the medicinal mushroom Inonotus obliquus / I.K. Lee, Y.S. Kim, Y.W. Jang//Bioorg. Med. Chem.Lett. – 2007. – Vol.17. – № 24. – Р. 6678-6681.

22. Shin, Y. Chemical constituents of Inonotus obliquus IV. – Triterpene and steroids from cultured mycelia / Y.Shin, Y. Tamai, M. Terazawa//Eurasian J. For. Res. – 2001. – 2. – Р. 27 -30.

23. Hyun, K.W. Isolation and characterization of a novel platelet aggregation inhibitory peptide from the medicinal mushroom, Inonotus obliquus / K.W. Hyun, S.C. Jeong, D.H. Lee// Peptides. – 2006. – Vol.27. – 6. – Р. 1173-1178.

24. Cui, Y. Antioxidant effect of Inonotus obliquus/ Y. Cui, D. S. Kim, K.C. Park // J. Ethnopharm. – 2005. – Vol. 96. – P. 79-85.

25. Park, Y.M. In vivo and in vitro anti-inflammatory and antinociceptive effects of the methanol extract of Inonotus obliquus / Y.M. Park, J.H. Won, Y.H. Kim// J. Ethnopharmacol. – 2005. – 1. – P.120-128.

26. Kim, H.G. Ethanol extract of Inonotus obliquus inhibits lipopolysaccaride-induced inflammatiry in RAW 264.7 macrophage cells / H.G. Kim, D.H. Yoon, C.H. Kim // J. Med.Food. – 2007. – Vol.10. – 1. – P. 80-89.

27. Park, Y.K. Chaga mushroom extract inhibits oxidative DNA damage in human lymphocytes as assessed by comet assay /Y.K. Park, H.B. Lee, E.J. Jeon // Biofactors. – 2004. – Vol. 21. – 1. – P. 109-112.

28. Youn, M.J. Chaga mushroom (Inonotus obliquus) induces G0/G1 arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2 cells/ M.J.Youn, J.K. Kim, S.Y. Park // World Jgastroenterol. – 2008. – Vol. 14. – 4. – P.511-517.

29. Park, J.R. Reversal of the TPA-induced inhibition of gap junctional intercellular communication by Chaga mushroom (Inonotus obliquus) extract: effects on MAP kinases /J.R. Park, J.S. Park, J.W. Hwang // Biofactors. – 2006. – Vol. 27. – 1. – P. 147-155.

30. Черепанова, Н.П. Систематика грибов / Н.П. Черепанова. – СПб.: Изд-во Санкт-Петербургского университета, 2005. – 344 с.

31. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлева. – М.:Медицина, 2002. – 656 с.

32. Бондарцев, А.С. Чага и некоторые наиболее распространенные трутовики на березе / А.С. Бондарцев // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.:Медгиз, 1959. – С. 2331.

33. Chen, Caifa Aqueous Extract of Inonotus obliquus (Fr.) Pilat (Hymenochaetaceae) Significantly Inhibits the Growth of Sarcoma 180 by Inducing Apoptosis/ Caifa Chen, Weifa Zheng, Xiaowen Gao, Xiaoyan Xiang, Dongxu Sun, Jiangchun Wei, Chengcai Chu// American Journal of Pharmacology and Toxicology. – 2007. – 2(1). – P. 10-17.

34. Кьосев, П.А. Полный справочник лекарственных растений / П.А. Кьосев. – М.:ЭКСПО-ПРЕСС, 2000. – 992с.

35. Гарибова, Л.В. Грибы: Энциклопедия природы России/ Л.В. Гарибова, И.И. Сидорова. – М.: ABF, 1997. – 350 с.

36. Синяков, А.Ф. Фитотерапия против рака. – М.: Советский спорт. 1997. – 448с.

37. Арчер, В. Малая грибная энциклопедия / В. Арчер. – М.: Изд-во Центрополиграф, 2000. – 256 с.

38. Кузнецова, М.А. Фармакогнозия /М.А. Кузнецова, И.З. Рыбачук. – М.: Медицина. 1993. – 448 с.

39. Низковская, О.П. К биологии возбудителя чаги на березе / О.П. Низковская // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 32-35.

40. Слепян, Э.И. Особенности патологических изменений в строении ствола Betula verrucosa ehrh. При развитии на нем гриба Inonotus Obliquus (pers.) pil. / Э.И. Слепян // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука, 1961. – С. 18-32.

41. Шиврина, А.Н. Физиологически активные вещества высших грибов (Кл. Basidiomycetes, пор. Hymenomycetailes). автореферат дисс. на соиск. уч. ст. д.б.н. / А.Н.Шиврина. – Л., 1966. – 39 с.

42. Шиврина, А.Н. К вопросу о природе и происхождении водорастворимого пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом чага/А.Н.Шиврина, Е.В.Ловягина, Е.Г. Платонова // Биохимия. – 1959. – т.24. – вып.1. – С.67-72.

43. Шиврина, А.Н. Биологически активные вещества высших грибов/ А.Н.Шиврина. – М. – Л.: Наука, 1965. – 199с.

44. Якимов, П.А. Общая биологическая и химическая характеристика чаги как исходного сырья для получения лечебных препаратов/ П.А.Якимов// Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – 334с.

45. Никитин, Н.И. Химия древесины и целлюлозы/ Н.И. Никитин. – М. – Л.: Изд-во АН СССР, 1962. – 711с.

46. Грушников, О.П. Микробиологическая деградация лигнина/ О.П.Грушников, О.Н. Антропова // Успехи химии. – 1975. – т.44. – № 5. – С.935-967.

47. Бондарцев, А.С. О природе «березового гриба» / А.С. Бондарцев // Природа. – № 12. – С. 127-128.

48. Campbell, W. A poria as the fruiting stage of the fungus causing the sterile conks on birch / W. Campbell, R. Davidson // Mycologia. – 1938. – 30. – 5. – Р. 553-560.

49. Ванин, С.И. Древесиноведение/С.И.Ванин. – М.: Наука, 1952. – 432с.

50. Ванин С.И. Лесная фитопатология/С.И.Ванин. – М.: Наука, 1955. – 386с.

51. Низковская, О.П. К вопросу биологии и биохимии культуры чаги / О.П. Низковская, Н.М. Милова, А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова // Труды института микробиологии АН СССР. – 1959. – № 6. – С.277-285.

52. Попов, А.И. Фармация на современном этапе. Проблемы и достижения. Научные труды, 39 (2)/ А.И. Попов, Д.Н. Шпанько. – М., 2000. – С. 251-253.

53. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. 11-е изд., доп. – М.: Медицина, 1990 – 400с.

54. Андреева, С.М. Об изыскании оптимальных условий выделения пигментного комплекса чаги из водных диффузий/С.М.Андреева, П.А.Якимов, Е.В. Алексеева // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука. – 1961. – С.120-128.

55. Шиврина, А.Н. О химическом составе чаги / А.Н. Шиврина, Е.В. Ловягина, Е.Г. Платонова // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 55-61.

56. Якимов, П.А Зольные элементы чаги и препарата из неё / П.А. Якимов, М.Ф. Ступак // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 50-54.

57. Якимов, П.А. Методы переработки чаги в лекарственные формы/ П.А. Якимов, С.М. Андреева, Е.В. Алексеева// // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука, 1961. – С. 129-138.

58. Якимов, П.А. Препарат БИН-чага/ П.А. Якимов, П.К. Булатов, М.П. Березина// Вестник АН СССР. – № 4. – С. 88-91.

59. Пат. 2259841 (RU), МПК A61K35/78. экстракт чаги сухой «Фито-продукт»/ Г.А. Цой, Г.А. Кобиашвили, А.А. Метленкин; патентообладатель ЗАО НПП "Фито-продукт" – 2004107950/15; заявл. 19.03.2004; опубл. 10.09.2005.

60. Чхве, Тхэсоп Лекарственные растения/ Тхэсоп Чхве. Пер. с корейск. – М.: Медицина. – 1987. – 608с.

61. Соколов, С. Я. Справочник по лекарственным растениям (фитотерапия)/ С. Я. Соколов, Замотаев И. П. – М.: Недра. – 1989. – 512с.

62. Андреева, С.М. К характеристике доброкачественности препарата из чаги/ С.М. Андреева// Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М.Л.: Наука, 1961. – С. 144-150.

63. Андреева, С.М. К вопросу обеззоливания диффузионных соков из чаги/С.М. Андреева, П.А.Якимов, Е.В.Алексеева// Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука. – 1961. – С.139-143.

64. Якимов, П.А. О причинах изменения устойчивости пигментного комплекса в водных экстрактах из чаги/ П.А. Якимов, С.М.Андреева // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука, 1961. – С. 113-119.

65. Технические условия ТУ 9359-002-58100551-03.

66. Регистрационное удостоверение РУ 005871.Р.643.07.2003.

67. Настойка чаги ВФС 43– 659 – 94.

68. Каукин, А.В. Древо-целительство/А.В.Каукин. – М.: Сов. Спорт, 2002, С. 175-180.

69. Артёмова, А. Берёза исцеляющая и омолаживающая/А.Артемьева. – М.,СПб.:Диля , 2001, С. 29-32.

70. Балицкий, К.П. Лекарственные растения в терапии злокачественных опухолей / К.П. Балицкий, А.Л. Воронцова. – Ростов: ,1980, С. 143-151.

71. Лазовская, А.В. О токсичности чаги / А.В. Лазовская // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 96-102.

72. Лазовская, А.В. Об отсутствии у чаги пирогенных свойств / А.В. Лазовская // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 103-104.

73. Березина, М.П. К вопросу об экспериментальном изучении действия чаги на животных / М.П. Березина, П.К. Булатов // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука, 1961. – С. 161-165.

74. Еременко, М.В. Внутривенное введение чаги/ М.В. Еременко, С.М. Андреева, П.А. Якимов// Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. – М. – Л.: Наука, 1966. – С. 71-77.

75. Березина, М.П. Влияние чаги на сердце лягушки / М.П. Березина, В. К. Васильева, Е.И. Грязнова // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии. – Л.: Медгиз, 1959. – С. 105-113.

76. Березина, М.П. О механизме физиологического действия осажденного пигментного комплекса чаги на организм / М.П. Березина, М.В. Еременко, Е.Я. Мартынова// Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. – М. – Л.: Наука, 1961. – С. 190-205.

77. Березина, М.П. Влияние чаги на электроэнцефалограмму коры больших полушарий кролика/ М.П.Березина, П.К. Булатов, М.В. Еременко // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. – М. – Л.: Наука, 1966. – С. 66-69.

78. Головко, В.А. Эффект биоглюканов выделенных из березового гриба Inonotus obliquus на электрическую активность клеток венозного синуса в сердце лягушки / В.А. Головко// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1999. – Т.128. – № 3. – С. 264-266.