Текст книги "Высокодисперсные коллоидные системы и меланины чаги"

Электрофорез водного извлечения чаги на бумажном носителе 2 Электрофорез водного извлечения чаги при использовании ацетатного буфера. При использовании ацетатного буфера (рН 5,6) сохраняется нативный рН среды водного извлечения. Поэтому применение ацетатного буфера должно облегчить распределение фракций хромогенов золя, подвижных в электрическом поле, по электрофоретограмме. Высокое содержание зольных элементов от 25 до 50 % должно способствовать комплексообразованию хромогенов водного извлечения чаги и продвижению фракций к катоду. Электрофорез водного извлечения чаги в ацетатном буфере может быть реализован при небольших напряжениях только при малой силе тока в 5мА. При силе тока в 10, 15 и 20 мА электрофоретическое разделение золя водного извлечения чаги происходит только при напряжении в 400В [275]. При всех применённых режимах электрофоретического разделения хромогенов водного извлечения чаги на стартовой линии остаётся больше хромогенов, судя по тёмно-коричневой окраске этой зоны. Это свидетельствует о малой подвижности хромогенов в этой буферной системе. Возможно, это связано с тем, что под действием электрического поля на стартовой линии частицы, образующиеся из меланина, стабилизируются за счёт перераспределения зарядов на их поверхности и отделение фракций меланина затруднено. Электрофоретограммы водных извлечений чаги, полученные при 5мА и напряжении 100В, имеют слабо окрашенный фронт (яркость около шести единиц), двигающийся как по направлению к аноду, так и к катоду, до R_f 0,6 в оба направления от стартовой линии. При силе тока, начиная с 150В и до 400В, не наблюдается движения интенсивно окрашенных фракций золя водного извлечения чаги по направлению к аноду, а к катоду происходит смещение фракций хромогенов от стартовой линии. Оптимальным режимом, который позволяет выделить две зоны на электрофоретограмме частиц хромогенов водного извлечения чаги, двигающихся к катоду, можно считать ток в 5мА и напряжение 350В [272-275]. При таком режиме электрофореза наблюдается максимальное движение фракций, несущих положительный заряд за счёт комплексообразования с ионами металлов к катоду. Например, в меланине, согласно данным ИК-спектроскопии, преобладают карбоксильные группы, участвующие в соле– и комплексообразовании с металлами [162,198]. По-видимому, именно эта сила тока и диапазон напряжений способствуют стабилизации образующихся в условиях электрического поля частиц меланина, несущих положительный заряд, и обеспечивают их подвижность в электрическом поле.

Электрофорез водного извлечения чаги при 15мА и напряжении 400В приводит к коренному изменению распределения хромогенов по электрофоретограмме. Наблюдается фракция хромогенов, двигающихся в сторону анода в диапазоне R_f от 0,1 до 0,4. Интенсивность её цвета достаточно высока: 20-16 единиц.

Движение хромогенов водного извлечения чаги в сторону катода менее выражено, хотя область R_f от 0,1 до 0,3 также имеет интенсивную окраску с яркостью от 20 до 6 единиц, но занимает достаточно узкий диапазон, недалеко отходящий от стартовой линии. Частица меланина имеет достаточно большое количество метоксильных и карбонильных групп [186], вероятно, при проведении электрофореза в условиях ацетатного буфера при высоких силе тока и напряжениях на стартовой линии формируются и приобретают подвижность полианионные фракции частиц. Увеличение силы тока до 20мА снижает подвижность хромогенов водного извлечения чаги [275].

При проведении электрофореза водного извлечения чаги в ацетатном буфере на денситограммах наблюдаются зоны высокой яркости. Можно предположить, что на стартовой линии в условиях электрического поля частицы меланина перестраиваются, что позволяет им приобрести отрицательный, либо положительный заряд. Участие в формировании этих фракций частиц могут принимать как полифенолы, так и белки, полисахариды, зольные элементы, свободные и связанные. Оптимальными режимами для изучения положительно заряженных фракций водного извлечения чаги являются сила тока в 5мА и напряжениях 150, 200, 250, 300, 350 и 400В, а отрицательно заряженных фракций – сила тока в 15мА и напряжение в 400В [275].

Электрофорез водного извлечения чаги на бумажном носителе 3 Электрофорез водного извлечения чаги при использовании боратного буфера. В щелочной среде боратного буфера водное извлечение чаги должно изменить структуру золя. Известно, что меланин чаги после выделения и высушивания в слабощелочной среде растворяется лучше, чем в воде [186]. Кроме этого, вероятно, частицы меланина в щелочной среде имеют другую гидратную оболочку, что будет также способствовать высвобождению из частицы слабо ассоциированных фрагментов. Электрофорез может способствовать этому процессу при условии наличия заряда на отделяющихся частицах или ассоциатов.

Электрофорез водного извлечения чаги в боратном буфере даёт яркие зоны на электрофоретограммах [276]. На них преобладают хромогены, движущиеся в сторону анода. Это свидетельствует о том, что в щелочной среде более подвижны индивидуальные соединения и частицы, несущие отрицательный заряд, типа полианионов, как и у гуминовых и фульвовых кислот. При различной силе тока определено напряжение, при котором получается наилучшее разделение фракций частиц. Наиболее интересные результаты получены при проведении электрофореза водного извлечения чаги при силе тока 20мА и напряжении в 150 и 200В. Если при 150В на электрофоретограмме намечается разделение зоны, двигающейся по направлению к аноду на две и со старта уходит не так много хромогенов, то при 200В этот процесс оптимально разрешается. Кроме высокой подвижности двух фракций с R_f 0,3 и 0,6 (яркость около 20 единиц) по направлению к аноду, заметна ярко окрашенная зона с R_f 0,07 (14,5 единиц), смещённая в сторону катода.

Проведение электрофореза водного извлечения чаги в слабощелочных условиях боратного буфера позволило выявить условия, позволяющие разделить хромогены золя на подвижные в электрическом поле фракции. Оптимальным режимом при проведении электрофореза водного извлечения чаги можно считать режим с силой тока в 20мА и напряжением в 200В. Он позволяет разделить хромогены на две фракции, подвижные в сторону анода, и одну – в сторону катода. В отличие от гуминовых кислот, полифенольные соединения золя водного извлечения чаги подвижны как в сторону анода, так и в сторону катода [276].

Электрофорез водного извлечения чаги в тонком слое сорбента.

При проведении электрофореза в боратном буфере при различных режимах (сила тока 5, 10, 15 и 20мА и напряжении 250 В) на пластинах силикагеля (Silufol) хромогены водного извлечения чаги перемещаются к катоду (рисунок 19), разделяясь на пять зон [277].

Образованию положительно заряженных частиц способствует большая сорбционная ёмкость силикагеля. При этом количество наблюдаемых на электрофоретограмме зон больше, у них более чёткие очертания и они имеют иную окраску по сравнению с проведением электрофореза на бумажном носителе.

Рисунок 19 Зоны электрофоретограммы, полученной при проведении электрофореза в режиме 10мА, 250В, в течение 60 минут

Установлено, что на разделение водного извлечения чаги на фракции с помощью электрофореза большее влияние оказывает не сила тока, а время проведения электрофореза. Увеличение времени разделения свыше 60 минут приводит к размыванию границ продвигающихся по подложке зон за счёт быстрой миграции хромогенов под действием электрического поля. Большая сорбционная ёмкость силикагеля позволяет проанализировать вещества, подвижные в электрическом поле [277].

Электронные спектры щелочных эльюатов всех пяти зон с электрофоретограммы имеют тот же вид ниспадающей кривой, что и спектр меланина водного извлечения чаги. Следовательно, во всех зонах присутствуют частицы, образующиеся на стартовой линии из частиц меланина водного извлечения чаги.

Проведён анализ полярных липидов и фенолкарбоновых кислот, находящихся в разделяемых зонах электрофоретограммы в свободном состоянии. После удаления из силикагеля каждой зоны с электрофоретограммы водорастворимых веществ он был проэльюирован хлороформом. Эльюаты хроматографировали в системе растворителей хлороформ: ацетон: метанол: уксусная кислота: вода (6:8:2:2:1), с проявлением сульфатом аммония (20 % раствор). Во всех зонах, кроме первой (стартовая линия), обнаружены пятна с R_f =0,94, различающиеся по интенсивности окраски. Наиболее интенсивная окраска наблюдалась у пятна, принадлежащего к пятой зоне. В эльюате второй зоны на хроматограмме также обнаружены пятна с R_f =0,01 и 0,04, а в эльюате четвёртой зоны – пятно с R_f =0,81. Пятна, имеющие высокие время удерживания, согласно литературным данным, можно отнести к гликолипидам R_f =0,94 – цереброзиды, и R_f =0,81 – кардиолипины [232], последние раннее не были обнаружены в водных извлечениях чаги.

Силикагель из каждой зоны электрофоретограммы проэльюировали спиртом (95 % этанол). Эльюаты хроматографировали в системе растворителей бензол: метанол: уксусная кислота (90:16:8), с проявлением 5 % спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты. Со второй по пятую зону включительно обнаружены п-оксибензойная и сиреневая (R_f =0,65), ванилиновая (R_f =0,65), вератровая (R_f =0,72) кислоты, пятно с R_f =0,89 не идентифицировано [277].

Проведение электрофореза в тонком слое сорбента более эффективно по сравнению с проведением этого процесса на бумажном носителе, поскольку позволяет исследовать разделенные с помощью электрофореза компоненты водного извлечения чаги.

В аналитических целях электрофорез эффективно применять для разделения коллоидной системы водного извлечения чаги.

Структура меланина чаги

Меланины, выделенные из различных природных субстанций, являются чрезвычайно перспективными объектами для исследования и применения в различных отраслях народного хозяйства, что связано с уникальностью их физико-химических и биологических свойств. Они состоят из аморфных микрочастиц, которые организованы из агрегатов и субагрегатов различной формы и размеров [278,279]. Это физическое состояние способствует биохимическому и биологическому поведению меланинов. В подходящих условиях меланин способен поглощать и рассеивать свет и звук, связывать металлы и органические соединения, хранить жидкости и газы, проводить электрический ток и преобразовывать свет в электрическую энергию. Этот широкий спектр гетерогенных физических и химических свойств непосредственно связан с биологическими функциями. Существует много научных доказательств того, что меланины приводят в действие фундаментальные биологические функции через механизмы, которые до сих пор недостаточно понятны. Это поясняется с помощью аксиомы: «Меланины: биологический бриллиант, биохимическая головоломка» [278-282]. Меланиновые пигменты способны эффективно влиять на ключевые процессы клеточного метаболизма в организме человека. Они являются регуляторами процессов окисления-восстановления, гормонального обмена, универсальными протекторами клетки при воздействии на неё физико-химических факторов мутагенной и канцерогенной природы. Поэтому использование этих пигментов, выделенных из природных объектов, очень перспективно [283].

Структурная организация меланина в большой степени должна зависеть от клеточных структур, в которых протекает меланогенез в живом организме. Меланогенез в организме человека происходит в меланоцитах (рисунок 20), специализированных клетках, имеющих хорошо развитые органеллы белкового синтеза, необходимые для биосинтеза гранул меланина [283, 284].

Рисунок 20 А) – клетки меланоцитов, Б) – синтез и передача меланина в кератиноцит [284]

С участием рибосом и комплекса Гольджи осуществляется синтез белка, фосфолипидов и фермента тирозиназы. Внутри вакуолей аппарата Гольджи создаются мембранные структуры меланосомы и начинается биосинтез меланина на внутренней мембране.

Нативные меланосомы содержат от 17,9 % до 73,2 % меланина и от 5,4 % до 61.4 % белка, в зависимости от источника [286]. Структурная упаковка (компановка) меланина и белка в меланосоме недостаточно изучена. В чистом виде меланин можно представить только теоретически. Он очень быстро вступает в комплекс с аминокислотами и белками меланосомального матрикса, образуя меланопротеины. В связи с этим под названием «меланин» обычно понимают его белково связанную форму, и выделить чистый пигмент из тканевых структур практически невозможно.

Использование современной техники позволило определить размеры частиц у меланинов различного биологического происхождения.

Рисунок 21 Меланиновые гранулы трёхнедельной культуры C. neoformans штамм 24067 – а) снимок сделан с помощью атомно силовой сканирующей электронной микроскопии [287]; Светопольная микрофотография мицелия Cladosporium hyphae б) не обработанный в) и г) протравленный специальным составом, позволяющим рассмотреть меланин. Масштаб = 5 µm. [288].

Меланины дрожжеподобных грибов Cryptococcus neoformans исследованы [287] с помощью атомно-силовой сканирующей электронной и трансмиссионной электронной микроскопии, имеющих более высокое разрешение. Показано, что меланиновые частицы имеют размер приблизительно 40-130 нм в диаметре и что меланин располагается в клетке в виде двух-пяти концентрических слоёв (рисунок 21 а).

Средний размер гранул меланина около рубца почки был равен 136±8нм для клеток, выращенных в течение трёх недель. Ядерно-магнитная резонансная криопорометрия показала, что меланиновые гранулы, образующие слои, содержат поры с диаметром между 1 и 4 нм. Кроме пор малого размера много пор с диаметром около 30 нм.

Ссылаясь на другие исследования меланинов Cryptococcus neoformans, авторы [287] предполагают, что меланин этих грибов содержит в своём составе поперечно сшитый полимер, имеющий в качестве структурных единиц остатки фенола и индола.

Меланин, выделенный из Verticillium dahliae (почвенный микромицет), имеет частицы с диаметром 100 нм (исследовано с помощью ScEM и ТЕМ) [289]. Мономерами в его олигомерных единицах являются производные скатола. Иногда для визуализации меланинов применяют специальную обработку природного объекта, как продемонстрировано на рисунке 21 б-г.

Меланин, который продуцируется в чернильных мешочках каракатицы Sepia afficinalis (рисунок 22), состоит из частиц с диаметром 150нм, определённым с помощью атомно-силовой сканирующей электронной микроскопии (AFM) [290].

Другие исследования с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM) высокого разрешения и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) показали, что меланины из S. afficinalis и бычьего глаза содержат агрегаты из более мелких частиц с диаметром приблизительно в 20 нм [291,292].

Рисунок 22 AFM изображения агрегатов эумеланина Сепии, напыленных на слюде из раствора (слева: контактный режим, справа: деривационный режим). Масштаб составляет 970 нм. Агрегаты размером с микрон окружены меньшими частицами эумеланина и нитями, которые хорошо видны на большой части поверхности в изображении, полученном в деривационном режиме [290]

С помощью электронной микроскопии установлено (рисунок 23), что меланины чаги и трутовиков плоского, ложного и окаймленного различаются размером частиц, состоят из окрашенного (хромоген) и неокрашенного (белково-полисахаридный матрикс) компонентов [293].

Рисунок 23 Электронная микроскопия – снимки меланинов трутовых грибов [293]

Следует отметиь, что размеры частиц трутовых грибов, определенные в твердом состоянии с помощью электронной микроскопии, совпадают с данными, полученными при использовании фотонной корреляционной спектроскопии в водной дисперсионной среде. В твердом виде размер частиц меланина у трутовиков плоского – 100 нм, окаймлённого – 200 нм и ложного – 170 нм, у чаги – 320-350 нм, а в дисперсионной среде 130, 220, 154 и 120-320 нм соответственно (приведен диаметр).

Сравним полученные данные о структуре меланина чаги с биологическими объектами, близкими им по размерам. Размеры частиц меланина в водном извлечении чаги, составляют 120-320 нм. Указанным размерам соответствуют большенство частиц (60-100 %). При разбавлении водного извлечения чаги в определенном диапазоне концентраций наблюдаются также частички в 78нм, 60нм, 32нм, 26нм, 8нм и более мелкие [178,179,180,254,255]. Размер частиц меланина чаги, также как и у других меланинов, лежит в наноразмерном диапазоне. Коллоидные системы водных извлечений чаги можно отнести, согласно общепринятой классификации [294,295], к высокодисперсным системам.

Для установления размера частиц меланинов применена различная техника исследований. В некоторых из них определены не только размер частиц, но и их форма. Так, Нофсингер и др. [296] приводит изображения SEM, на которых наблюдаются асимметричные частицы с размерами, различающимися по длине от ~ 3 мкм до 286 мкм. Они имеют форму пирожка. Авторы пришли к выводу, что частицы состоят из меньших, плотно упакованных структур, которые составляют ~ 15 нм в диаметре. Они полагают, что это агрегаты олигомеров, которые сформировались после высыхания образца при пробоподготовке, так как они намного больше, чем размеры частиц, определенные с помощью масс-спектрометрии.

Данные, полученные Виткин и др. с помощью просвечивающего электронного микроскопа, хорошо согласуются с ранее приведенными размерами. Отмечено, что в распределении частиц по размерам преобладают частицы с диаметром 90 нм [297], как и в результатах Зеисе и др. [298,299]. Использование AFM также подтверждает ранее определенный размер частиц, составляющий 15-25 нм в диаметре [300]. Клэнси и Саймон в 2001 опубликовали более подробное AFM исследование эумеланина Сепии, напыленного на поверхность слюды [301], включенное в обзор по применению технологий формирования изображений эумеланина [302]. Они показали, что самой распространенной структурой в эумеланине Сепии является агрегат, состоящий из частиц с диаметрами 100-200 нм, как показано в рисунке 22.

Рисунок 24 AFM изображения (в режиме нарезки) нитей эумеланина, высушенных на слюде (левый: высота, справа: фаза). Бар масштаба составляет 125 нм. Более низкий граф показывает поперечное сечение нитей в плоскости, взятой вдоль черной линии, изображенной на рисунке (а). Эти данные показывают, что нити имеют размер по высоте ~ 3−6 nm и в диаметре ~ 15 − 50 нм [290]

На относительно большой части его поверхности наблюдались также нитевидные структуры. Более отчетливо их укладка и размер видны на рисунке 24. Определено, что эти нити имеют среднюю высоту ~ 5 нм и ширину в десятки нанометров. Клэнси и Саймон использовали наконечник кантиливера AFM, чтобы физически разрушить агрегат меланина, рассекая его через центр, как показано на рисунке 25.

Рисунок 25 (A) AFM изображения в режиме нарезки агрегатов эумеланина Сепии до (слева) и после (справа) того, как наконечник кантиливера AFM пересек агрегат вдоль направления, обозначенного белой стрелой. Бар масштаба составляет 210 нм. (B) [301]

Частицы размером в 100 нм легко разрушались. После прохода наконечника кантиливера AFM образовалась бороздка глубиной и шириной приблизительно 30 нм на 30 нм, при этом сформировалось возвышение с высотой около 20 нм вдоль сторон прохождения наконечника. Эти данные свидетельствуют о том, что наконечник перемещает элементы, которые являются более мелкими по сравнению с его размером [302], и/или разрушает частицы или их агрегаты при разрезании. Это означает, что частица с размером 100 нм – не самая маленькая субъединица в рассматриваемом объекте.

AFM использовали для исследования меланинов чаги [303].

Рисунок 26 Частицы меланина, выделенного из: а –водного извлечения чаги (диаметр частиц 400 нм); б – водного извлечения чаги, после введения в него Boltorn Н40 (диаметр частиц 120 нм, встречаются 500 нм) [303]

На рисунке 26 приведен нативный меланин чаги (а), выделенный с помощью хлористоводородной кислоты, который, как и меланин Сепии, имеет форму пирожка. Модификация дисперсионной среды водного извлечения чаги введением в него Boltorn Н40 в концентрации 0,2*10¹ мкмоль/л приводит к изменению не только размеров, но и формы частиц меланина. Размеры частиц объектов исследования в коллоидных системах с водной дисперсионной средой определены с помощью фотонной корреляционной спектроскопии. Полученные результаты хорошо согласуются с данными, полученными с помощью AFM [303].

Таким образом, меланины биологических объектов различного биологического происхождения представляют собой близкие к наноразмерным частицы. Биосинтез исходных соединений, которые затем ферментативным путем превращаются в меланин у эумеланина, феумеланина и алломеланина, происходит по разным метаболитическим путям, что показано на схемах, приведенных на рисунках 27 и 28.

Полагают [307], что структурной единицей эумеланинов является индолил-5,6-хинон и его восстановленные производные. Кроме того, в полимере может присутствовать небольшое число пиррольных мономеров, которые, вероятно, образуются из индольных предшественников. Исследования с помощью ЭПР указывают на присутствие небольшого количества свободных радикалов, возможно, полухиноновых структур. In vivo с эумеланином могут быть связаны тяжелые металлы, в особенности, медь, цинк или железо.

Характерной особенностью алломеланинов является то, что они содержат мало или вообще не содержат азота. Алломеланины растительного происхождения отличаются от грибных (Aspergillus niger, Daldinia concentrica) структурными единицами. В первом случае мономерной единицей считается пирокатехин, во втором случае предполагают, что ею могут быть периленовые мономеры, представляющие собой производные 1,8-дигидроксинафталина (DHN).

Рисунок 27 Биосинтез меланина [304]. Основа этой схемы была разработана Папером в его пионерской работе по биосинтезу эумеланина в 1927 [305,306].

Синтез меланинов грибов в последнем случае происходит по поликетидному пути, указанному на рисунке 28, с образованием DHN-меланина.

Рисунок 28 Синтез DHN меланина [308]

Следующий этап в биосинтезе меланина заключается в образовании связей между мономерами. Структура меланина на этом молекулярном уровне вызывает особый интерес в сообществе ученых, занимающихся исследованием меланина [309,310], и этой теме посвящено множество публикаций.

Рейсз заимствовал терминологию, применяемую у белков и нуклеиновых кислот, такую, например, как понятия о первичной и вторичной структуре, и использовал её для описания организации меланина.

По отношению к меланинам под первичной структурой понимают способ ковалентного связывания мономерных единиц DHI и DHICA в эумеланинах. Структуры олигомеров изображены на рисунках 29, 30 и 31.

Рисунок 29 Структуры олигомеров, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, в синтетическом эумеланине DHICA [312]

Образованию связи между мономерами при образовании олигомеров посвящено достаточно много работ. Например, при окислительной полимеризации мономеров эумеланина DHI и DHICA в биомиметических условиях выделены промежуточные олигомеры [311]. С помощью ВЭЖХ определено, что образовавшиеся DHI димеры имеют связи в 2, 4 и 7 положених. В случае использования в качестве мономера DHICA предпочтительное связывание их в димеры происходит по 4, 7 и 3 положению (связывание по 2 положению, вероятно, затруднено, поскольку это место занимает карбоксильная группа). Кроме того, были выделены хиральные линейные тримеры и тетрамеры DHICA, имеющие связь в 4 и 7 положении (рисунок 29) [315,316].

Рисунок 3 °Cтруктуры олигомеров, исследованные Ченгом и др. [313]

Предпочтительное связывание DHI в 2 положении впоследствии было подтверждено с помощью ЯМР ¹³C у синтетического эумеланина [317]. Это исследование также обнаружило связывание в DHI в положении 3 (хотя и в меньшей степени, чем в положении 2).

С помощью масс спектрометрии (MALDI) синтетических DHICA и DHI эумеланинов установлено, что оба они содержат широкое разнообразие олигомерных компонентов с низкой молекулярной массой от 500 до 1500 Da [312, 318]. Не обнаружено компонентов больших, чем гексамеры, в основном это были тримеры и тетрамеры.

Авторы предположили, что размер олигомеров может быть продиктован их растворимостью в реакционной среде в процессе удлинения цепи и поэтому способен изменяться в зависимости от условий проведения синтеза.

Рисунок 31 Гипотетический тетрамер эумеланина, предложенный Kaxiras и др. Золото = C, красный = O, синий = N, белый = H [314]

Структуры некоторых олигомеров, определенных в DHICA меланине, показаны на рисунке 29. Структура I показывает образование связи по 4 и 7 положениям, что согласуется с исследованиями, обсужденными выше. Структура II содержит некоторые единицы, которые были получены при окислительном разложении DHICA (главным образом под действием перекиси водорода), с образованием пиррольных хромофоров. Показано, что эта деградация была значительной в синтетических DHI и DHICA меланинах даже при проведении синтеза в мягких и контролируемых условиях. С этим может быть связано образование намного более разнообразных вариантов возможных олигомеров, чем просто при сополимеризации DHI и DHICA мономеров в синтетическом эумеланине.

Структуры, подобные приведенным на рисунке 29, были получены для природного эумеланина Сепии [319]. Они так же, как и олигомеры синтететических меланинов, имеют низкие молекулярные массы от 450 до 1200 Да. С другой стороны, масс спектрометрия, как метод исследования, не позволяет определить компоненты меланина с большой молекулярной массой.

Наиболее важное из того, что было определено с помощью этого метода и описано в литературе, это то, что первичная структура эумеланина состоит из олигомеров с молекулярной массой от 600 до 1200 Да, с количеством единиц мономеров от 4 до 8 [318–323]. Большие полимерные структуры не выявлены ни для одного из изученных образцов.

Вторичная структура в этом случае это порядок, в котором эти ковалентно связанные единицы ассоциируются с помощью нековалентных взаимодействий, таких, как Ван-дер-Ваальсовы силы или водородные связи с образованием более крупных структур. В меланине это π укладка пластин олигомеров, как показано на рисунках 32 и 33, что соответствует пониманию его вторичной структуры.

Рисунок 32 Молекулярная модель олигомеров эумеланина, предложенная Зайак и др., состоящая из сложенных в стопку трех листов олигомеров. Габаритные размеры около 20 °A в латеральном измерении и приблизительно 7.6 °A по высоте [324]

Ранние исследования эумеланина с применением широкого углового рентгена, рассеивающего (WAXS), показали, что он имеет высокую степень разупорядоченности и что его мономерные единицы организованы в ламелярные (планарные) структуры, которые сложены стопками с интервалом между слоями приблизительно 3.4˚A [325, 326, 327–330].

В фундаментальном исследовании эумеланина, выполненном Чио в 1977 году, было предположено присутствие в структуре паракристаллических блоков, соединенных друг с другом с образованием редких агрегатов [331]. Измерения Чио подтвердили ламелярные структуры, сложенные из трех или четыре слоев олигомеров, в состав которых входят от четырех до восьми единиц мономера. Эта структура аналогична разупорядоченной структуре графита. Присутствие паракристалличных блоков в выделенных природных меланинах было подтверждено Бриделли и др. [332], а также Рейли [333].

Рисунок 33 Схематическая диаграмма сборки эумеланина. Основная молекулярная единица эумеланина – это небольшой планарный олигомер, который построен приблизительно из 5 единиц DHI/DHICA. Этот планарный олигомер собирается укладкой стопками при взаимодействии по профилю. Формирование нитей продемонстрировано по [301]

Ключевыми работами в изучении меланинов с помощью WAXS считают труды Ченга и др. [313,334, 335]. В качестве объектов исследования он использовал природный эумеланин Сепии, синтетические эумеланины на основе тирозина и L-ДОФА и показал, что все три имеют очень схожие характеристики. Это указывает на то, что синтетические эумеланины можно считать моделями для природного эумеланина, что касается организации их первичной и вторичной структур. У всех образцов между плоскостями в слоях наблюдался характерный интервал равный 3.45˚A, как и в структуре разупорядоченного графита [336]. На основании экспериментальных данных Ченг и др. предложили различные молекулярные структуры для эумеланина, приведенные на рисунке 30. Все предложенные структуры планарные, что позволяет олигомерам складываться в стопки, содержащие от 5 до 8 единиц мономера. Именно при таком размере олигомеров образуются частицы с предпочтительным размером наблюдаемых в экспериментах агрегатов. Симметричные структуры, например, плоскость I (рисунок 30) были отклонены, так как они дают начало острым пикам, которые не наблюдаются в экспериментальнх данных. Все структуры с относительно случайным расположением мономеров, например, плоскости II, III (a) и III (b) (рисунок 30) подтверждаются экспериментальными данными. Авторы приходят к заключению, что эумеланин, вероятно, состоит из статистического среднего числа многих молекулярных структур и каждая из них сложена из четырех слоев олигомеров с высоким гауссовским распределением интервала между слоями, имеющим среднее значение около 3.45˚A, как проиллюстрировано на рисунке 32. Такую молекулярную структуру, по Зайаку и др [324], назвают протомолекулой эумеланина. Её габаритные размеры определены с помощью сканирующей тоннельной микроскопии STM и AFM [324,337,338] и составляют в латеральном измерении около 20 °A и по высоте ~ 7.6 °A. Авторы предполагают, что в изображениях, получнных с помощью AFM, протомолекулы соединяются в латеральном направлении (по ширине) с помощью водородных связей или далее стыкуются, формируя нити, показанные на рисунках 22 и 24.

Изображение TEM с высоким разрешением синтетического эумеланина, полученного из ДОФА, подтверждает существование π укладки пластин олигомеров (π-stacking) в протомолекуле эумеланина.

На изображении показаны сферические частицы с диаметром приблизительно 5.8 нм, которые сформированы из слоев в нано агрегате, подобно слоям в луке, как показано на рисунке 34. Интервал между слоями около 3.8˚A, что соответствует ранее проведенным измерениям WAXS эумеланина [334]. Аналогичные результаты получены для синтетических эумеланинов на основе индола и порфирина [339–342] и для природного эумеланина, извлеченного из бычьей кожи (рисунок 35).

Рисунок 34 Изображение TEM синтетического эумеланина, полученного из ДОФА, с высоким разрешением демонстрирует укладку слоев, похожих на слои в луке. Это изображение было получено на специальном материале, чтобы удалить аморфный углеродный фон и увеличить контраст в образце [343]