Текст книги "Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных"

8 Бактериофаги

Бактериофаги – вирусы, размножающиеся в бактериальных клетках. В современной классификации вирусы бактерий распределены на 13 семейств и один неклассифицированный род.

У бактериофагов обнаружены четыре вида геномов. Отсутствуют ретроидные вирусы и (-)РНК-геномные вирусы. Сегментированный РНК-геном содержат цистовирусы (Cystoviridae), (+)РНК-геном – левивирусы (Leviviridae). Основная масса бактериофагов – это ДНК-содержащие вирусы. Геномная ДНК бактериофагов может быть однонитевой и двухнитевой, линейной, кольцевой или суперскрученной. Линейные молекулы ДНК могут иметь липкие концы, содержать прямые или инвертированные концевые повторы или геномные белки.

Отличительной особенностью ДНК целого ряда фагов является наличие метилированных оснований (5’-метилцитозина, или 5-МЦ; 6’– метиламинопурина, или 6-МАП), которые могут входить в состав ДНК в качестве минорных или мажорных оснований. Так, ДНК фагов fd и φX174 (колифаги) содержит 1-2 метилированных основания, а в ДНК фага XI2, лизирующего морскую бактерию Xantomonas oryza, вообще нет обычного цитозина, который полностью замещен 5-МЦ. Источником происхождения таких оснований является энзиматическое метилирование уже синтезированной цепи ДНК. Этот процесс осуществляют специфические метилазы, которые используют в качестве донора метильных групп S-аденозилметионин.

8.1 История бактериофагов

1896: Эрнест Ханкин сообщил, что воды рек Ганга и Джамна в Индии обладают значительной антибактериальной активностью, которая сохранялась после прохождения через фарфоровый фильтр с порами очень малого размера, но устранялась при кипячении. Наиболее подробно изучал он действие неизвестной субстанции на Vibrio cholerae и предположил, что она ответственна за предупреждение распространения эпидемий холеры, вызванных употреблением воды из этих рек. Однако, в последующем, он не объяснил этот феномен.

1898: Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал русский микробиолог Н.Ф. Гамалея.

1915: Английский учёный Ф. Туорт описал это же явление у гнойного стафилококка и открыл первый «вирус, пожирающий бактерии» , когда он наблюдал любопытное дегенеративное изменение – лизис в культурах стафилококков из лимфы теленка. С его именем связано название «феномен Туорта».

1917: Феликс д’Эрель делает аналогичное открытие, Именно Феликс д’Эрель канадский сотрудник Института Пастера в Париже, дал им название «бактериофаги» – используя суффикс «фаг» не в его прямом смысле «есть», а в смысле развития за счет чего-то (д’Эрель, 1922), они стали главной частью работы всей его жизни.

8.2 Морфология бактериофагов

Применение современных электронных микроскопов, а также усовершенствование методов приготовления препаратов для электронной микроскопии позволили более детально изучить тонкую структуру фагов. Оказалось, что она весьма разнообразна и у многих фагов более сложна, чем структура вирусов растений и ряда вирусов человека и животных.

Разные фаги отличаются друг от друга не только по форме, величине и сложности своей организации, но и по химическому составу. Оказалось, что фаги, лизирующие микроорганизмы различных групп, могут быть вполне идентичными по своей морфологии. В то же время фаги, активные против одной и той же культуры, могут резко различаться по своей структуре. Так, например, среди фагов, способных лизировать разные штаммы кишечной палочки, выявлены все известные морфологические типы фагов.

Частицы (или вирионы) большинства известных фагов имеют форму сперматозоида. Они состоят из головки (или капсида) и отростка. Наряду с этим есть фаги, которые состоят из одной головки, без отростка, и фаги, имеющие форму палочки (палочковидные или нитевидные фаги).

По форме частиц фаги делятся на шесть основных морфологических типов (групп) (рисунок 31): палочковидные или нитевидные фаги; фаги, состоящие из одной головки, без отростка; фаги, состоящие из головки, на которой имеется несколько небольших выступов; фаги, состоящие из головки и весьма короткого отростка; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого не может сокращаться; фаги, имеющие головку и длинный отросток, чехол которого может сокращаться.

Размеры фагов принято обозначать в милли-микрометрах (1 миллимикрометр – миллионная часть миллиметра) или в ангстремах (10 Å = 1 миллимикрометр).

Рисунок 31 – Морфологические типы фагов

Фаги первого морфологического типа – палочковидные или нитевидные – выявлены у кишечной, синегнойной, чудесной палочек и других бактерий. Средние размеры их: длина – от 7000 до 8500 Å, ширина – от 50 до 80 Å (рисунок 32). Эти фаги отличаются от всех остальных не только большой специфичностью, но и рядом других важных свойств.

Рисунок 32 – Палочковидные, или нитевидные, фаги (увел. × 400 000)

Фаги второго морфологического типа. Частица их состоит из одной головки гексагональной (шестигранной) формы на плоскости (рисунок 33). Частицы очень мелкие, средний размер их от 230 – 300 Å в диаметре.

Рисунок 33 – Фаги 2 морфологического типа, частица состоит из одной головки (увел. × 600 000)

У фагов третьего морфологического типа форма и размеры головки такие же, как у фагов второго типа, но у их головок имеются обычно несколько очень коротких выступов (рисунок 34). Возможно, эти выступы являются аналогами отростков.

Рисунок 34 – Фаги третьего морфологического типа от головки отходят небольшие выступы (увел. × 500 000)

Фаги 2-го и 3-го морфологических типов отличаются постоянством формы и размеров, независимо от того, против каких микроорганизмов они активны. Эти фаги относятся к мелким формам.

Фаги 4-го морфологического типа. Частица состоит из головки, размеры которой варьирую от 400 до 640 Å в диаметре, и очень короткого отростка (рис. 35).

Длина и ширина отростка от 70 до 200 Å.

Рисунок 35 – Фаг 4 морфологического типа. Частица состоит из головки и короткого отростка (увел. × 500 000)

Фаги пятого морфологического типа наиболее широко распространены. Головка у частиц гексагональной, формы различных размеров – от 500 до 4250 Å в диаметре. Размеры отростка: длина – от 1700 до 5000 Å, ширина – от 70 до 120 Å (рисунок 36). Чехол отростка не способен сокращаться.

Рисунок 36 – Разные фаги пятого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка, чехол которого не способен сокращаться (1, 2 – увел. × 225 000, 3 – увел. × 250 000)

Фаги шестого морфологического типа также широко распространены. Головка частицы различной формы и размеров – от 600 до 1500 Å в диаметре, гексагональная. Размеры отростка: длина – от 800 до 2890 Å, ширина – от 140 до 370 Å. Важной особенностью фагов этой группы является то, что чехол, окружающий отросток, способен сокращаться, в результате чего становится видимым внутренний стержень отростка (рисунок 36).

Рисунок 36 – Фаг шестого морфологического типа, частица состоит из головки и длинного отростка, чехол которого способен к сокращению (увел, около 400 000)

Наиболее сложноустроенными являются бактериофаги T-четной серии. Рассмотрим их организацию на примере бактериофага T4, образованного 30-ю белками (рисунок 37).

Головка фага T4 состоит из двух неравноценных частей – белкового изометрического капсида с заключенной в нем ДНК, и миниатюрного комплекса, который находится в основании одного из углов капсида. Этот комплекс состоит из муфты и шейки. Шейка, в свою очередь, организована цилиндром и воротничком с 6-ю короткими воротничковыми нитями.

Рисунок 37 – Строение бактериофага Т4

Хвостовой отросток состоит из стержня, окруженного белковым чехлом, и базальной пластинки, ассоциированной с 6-ю длинными и 6-ю короткими фибриллами. Чехол хвостового отростка образован 144 белковыми субъединицами и может находиться в растянутом или сокращенном состоянии. Растянутый чехол – это структура, состоящая из стопки дисков (24 диска, каждый образован 6-ю субъединицами), в то время как сокращенный чехол – это спирально закрученный тяж из 144 белковых субъединиц.

8.3 Химический состав фагов

В настоящее время изучен химический состав фагов, принадлежащих к разным морфологическим типам и поражающих микроорганизмы почти всех систематических групп.

Основными компонентами фагов являются белки и нуклеиновые кислоты. Важно отметить, что фаги, как и другие вирусы, содержат только один тип нуклеиновой кислоты – дезоксирибонуклеиновую (ДНК) или рибонуклеиновую (РНК). Этим свойством вирусы отличаются от микроорганизмов, содержащих в клетках оба типа нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота находится в головке. Внутри головки фагов обнаружено также небольшое количество белка (около 3 %).

Таким образом, по химическому составу фаги являются нуклеопротеидами. В зависимости от типа своей нуклеиновой кислоты фаги делятся на ДНК-содержащие и РНК-содержащие. Количество белка и нуклеиновой кислоты у разных фагов разное. У некоторых фагов содержание их почти одинаковое и каждый из этих компонентов составляет около 50 %. У других фагов соотношение между этими основными компонентами может быть различно.

Кроме указанных основных компонентов, фаги содержат в небольших количествах углеводы и некоторые преимущественно нейтральные жиры.

Все известные фаги второго морфологического типа РНК-содержащие. Среди фагов третьего морфологического типа встречаются как РНК-содержащие, так и ДНК-содержащие формы. Фаги остальных морфологических типов – ДНК-содержащие.

8.4 Антигенные свойства фагов

Известно, что при введении в организм животного подкожно или внутривенно белка, бактериальных клеток, некоторых продуктов жизнедеятельности микроорганизмов и других веществ в крови животного вырабатываются вещества, названные антителами. Вещества, способные вызывать образование антител, называются антигенами.

Антитела очень специфичны и способны вступать в реакции только с теми антигенами, которые вызвали их образование. Они или связывают соответствующие антигены, или нейтрализуют их, или осаждают, или растворяют.

Оказалось, что все фаги обладают антигенными свойствами. При введении фага в организм животного в сыворотке крови образуются специфические антитела, способные действовать только против данного фага. Такие сыворотки называются антифаговыми. Когда фаг смешивается со специфической антифаговой сывороткой, происходит инактивация фага – фаг теряет способность вызывать лизис чувствительных к нему микробов.

Так как каждая антифаговая сыворотка специфична, ее можно успешно применять для идентификации и классификации фагов и очистки микробной культуры от фага. При помощи сыворотки удалось доказать, что белок оболочки фага отличается от белка оболочки отростка и от белка базальной пластинки и ее нитевидных образований, что говорит о сложности структуры фаговой частицы. По антигенным свойствам фаг резко отличается от чувствительных к нему микробов.

8.5 Размножение фагов

Взаимоотношения между фагом и чувствительной к нему клеткой очень сложны и не всегда завершаются лизисом клетки и размножением в ней фага. Одни бактериофаги весьма специфичны и способны лизировать клетки только одного какого-либо вида микроорганизмов (монофаги), другие – клетки разных видов (полифаги). Рассмотрим такую инфекцию клетки, которая заканчивается гибелью клетки и размножением в ней фага. Такая инфекция называется продуктивной.

Важнейшей особенностью размножения фага является то, что оно может происходить только в живых клетках, находящихся в стадии роста.

В мертвых клетках, а также продуктах клеточного обмена размножение фага не происходит. По характеру взаимодействия с микробной клеткой различают вирулентные и умеренные бактериофаги. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофагов с клеткой весьма сложный и состоит из следующих последовательно протекающих этапов (рисунок 38):

1) адсорбция фаговой частицы на поверхности микробной клетки;

2) проникновение содержимого головки фаговой частицы (нуклеиновой кислоты) в микробную клетку;

3) внутриклеточное развитие фага, заканчивающееся образованием новых фаговых частиц;

4) лизис клетки и выход из нее новых фагов.

Рисунок 38 – Схема размножения фага

Время с момента инфицирования клетки фагом до лизиса клетки называется латентным или скрытым периодом. Продолжительность этого периода различна для разных типов фага, зависит от окружающей температуры, состава среды и других факторов. Латентный период фагов, специфичных для одних бактерий, от 15 до 40 мин, для других – 5 ч и более. У фагов актиномицетов латентный период может быть еще продолжительнее. При низкой температуре латентный период значительно увеличивается.

Из всех этапов размножения фага наиболее изучен первый – адсорбция.

Адсорбция фага на клетке – реакция весьма специфичная. В клеточной стенке бактерий имеются особые структуры (рецепторы), к которым могут прикрепиться фаги. Адсорбируются на рецепторах только те фаги, к которым чувствительна клетка.

Фаги, имеющие отростки, прикрепляются к микробной стенке свободным концом отростка. Нитевидные фаги, а также фаги, не имеющие отростков, адсорбируются не на микробной стенке, а на нитевидных структурах, окружающих стенку, – фимбриях. Описаны фаги, которые прикрепляются отростком к бактериальным жгутикам (рисунок 39). У некоторых фагов процесс адсорбции может осуществляться лишь в том случае, когда в среде имеются определенные вещества – кофакторы: аминокислоты (триптофан, тирозин и др.) или соли (кальциевые, магниевые).

Рисунок 39 – Адсорбция фага на клетке

На конце фагового отростка имеется особый фермент типа лизоцима. После адсорбции фага под влиянием этого фермента происходит растворение стенки микробной клетки и содержимое головки фага – нуклеиновая кислота – перекачивается в микробную клетку. Этим завершается второй этап процесса размножения фага.

Остальные структуры фаговой частицы – оболочка головки, отросток и его субструктуры – внутрь инфицированной фагом клетки не попадают. Их роль заключается в обеспечении сохранности фаговой частицы, находящейся вне клетки, и содействии проникновению фаговой нуклеиновой кислоты в клетку при инфекции.

У нитевидных фагов, в отличие от других видов фагов, внутрь клетки проникает весь белок или его часть. После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается сложный процесс внутриклеточного размножения фага. Под влиянием нуклеиновой кислоты фага резко изменяется весь обмен микробной клетки. Основные процессы, протекающие в инфицированной клетке, направлены на образование новых фаговых частиц. Инъецированная ДНК подавляет синтезирующие механизмы клетки, заставляя ее синтезировать ДНК и белки бактериофага. Из образовавшихся в разных частях клетки в разное время фаговой нуклеиновой кислоты и белка формируются новые фаговые частицы (сборка Б.). Вначале формируются отдельно головки и отростки, которые затем объединяются в зрелые фаговые частицы. К этому времени внутри клетки образуется особый литический фермент, который вызывает лизис клетки изнутри. Клетка распадается, и новые зрелые частицы фага выходят наружу.

Количество новых фаговых частиц, образуемых одной клеткой при фаговой инфекции, называют выходом фага или его урожайностью. Выход фага зависит от свойств данного фага и не зависит от клетки-хозяина и ее размеров. Одни фаги отличаются очень низким выходом (5–50 частиц на клетку), у других выход значительно выше (от 1000 до 2500). Особенно высоким выходом отличаются мелкие РНК-овые фаги (свыше 20 000 частиц на клетку). Если большое количество бактериальных клеток смешать с небольшим количеством фаговых частиц, то процесс размножения фагов проходит несколько циклов. В начале инфицируется часть клеток. Первое потомство фага инфицирует оставшиеся клетки – происходит второй цикл, за ним может следовать третий и т.д., пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу клетки. Среди фагов встречаются такие, размножение которых возможно лишь при наличии в среде определенных кофакторов. Одни из этих веществ, как уже указывалось, необходимы для адсорбции фага; другие – для внутриклеточного размножения фага.

Если произвести рассев по поверхности агаризованной питательной среды в чашках Петри смеси фага и чувствительных к нему микробов и чашки выдержать в термостате, то происходит лизис клеток в результате размножения фага. Если взять большое количество частиц фага, то лизируется большая часть или весь выросший газон культуры. Если количество фаговых частиц таково, что они распределяются только на отдельных участках газона, лизируя в этих местах культуру, то возникает колония фага.

Эти колонии фага получили название бляшек, стерильных пятен. Правильнее их называть негативными колониями. Каждая негативная колония состоит из десятков и сотен миллионов фаговых частиц. Размер негативных колоний и их форма зависят в первую очередь от свойств фага, а также от состава среды и культуры микробов. У одних фагов негативные колонии очень мелкие и еле видимы невооруженным глазом, другие достигают 10 мм в диаметре и более. Колонии бывают светлые и четкие, когда лизировалась вся культура, или мутноватые, когда лизировались не все клетки. Вокруг негативных колоний некоторых фагов могут возникнуть различной формы и величины ореолы (рисунок 40).

Рисунок 40 – Крупные негативные колонии актинофага (увел. 1:1)

Морфология негативных колоний служит одним из признаков, которым пользуются при дифференциации фагов.

8.6 Видовая и штаммовая специфичность бактериофагов

Видовая специфичность бактериофагов, как и в случае других вирусов, определяется наличием на клеточной поверхности специфических рецепторов и реализуется на стадии адсорбции. Адсорбция является физико-химическим процессом взаимодействия структур фаговой частицы, отвечающих за адсорбцию, и особых компонентов клеточной стенки, получивших название фаговые рецепторы. Чаще всего рецепторами являются липополисахариды и белки клеточной стенки. Описаны фаги E. Coli f1 и f2 (Inovirus), адсорбирующиеся на половых пилях, в связи с чем, они размножаются только на мужских штаммах (F⁺). Взаимодействие фага и рецептора высоко специфично. Именно стадия адсорбции определяет круг бактерий – хозяев фага. Как правило, определенный тип бактериофага паразитирует на бактериях одного вида, реже – на нескольких близкородственных видах (например, на кишечных палочках и шигеллах). Потеря фаговых рецепторов или их изменение является основной причиной устойчивости бактерий к фагу.

Круг хозяев бактериофагов, кроме наличия у них специфических фаговых рецепторов, определяется и другими специфическими особенностями клеток бактерий. Способность того или иного фага заражать разные виды и штаммы бактерий в определенной степени зависит от систем рестрикции-модификации клеток последнего хозяина, где этот фаг реплицировался. В общем виде сущность феномена модификации хозяином состоит в том, что клетки, где может происходить репликация вируса, имеют специфические эндонуклеазы рестрикции, вызывающие деградацию чужеродных ДНК (система рестрикции или r-система), и одновременно имеют ферменты (метилазы, гликозилазы), защищающие свою ДНК путем придания ей дополнительной, «уточняющей» специфичности в виде минорных метилированных оснований (система модификации или m-система). Клетка защищает свою ДНК от своей r-системы метилированием оснований в строго специфичных местах (сайтах) рестрикции. Поскольку такие сайты (короткие последовательности нуклеотидов) имеются и в ДНК вируса, они также метилируются, то есть клетка как бы метит «свои» вирусы. В разных видах бактерий присутствуют разные эндонуклеазы рестрикции и соответствующие им m-системы. В итоге возникает видовая и даже штаммовая специфичность систем r-m. В связи с этим, пометив и защитив ДНК вируса, бактериальная клетка разрешает размножаться только «своим» вирусам и запрещает реплицироваться «чужим», которые перед этим размножались в других штаммах или видах бактерий.

Целый ряд вирусов бактерий научился сам преодолевать г-систему клетки хозяина за счет приобретения фаговой ДНК хозяйских генов, кодирующих специфические метилазы, и таким образом гарантировать себе получение полноценного потомства. Примером такой приспособляемости бактериофагов является фаг T2 (Myoviridae). Паразитизм и высокая приспособляемость бактериофагов могут идти еще дальше. Некоторые фаги (λ, P1 – Syphoviridae) приобрели себе не только т-систему, но и собственные системы рестрикции. При попадании таких фагов в клетку фагоспецифические рестриктазы могут воздействовать на клеточную ДНК, обеспечивая первый этап вирусной инфекции – подавление функции генома клетки хозяина.