Текст книги "Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных"

Cis-аcting сигналы и специфичность репликации. Репликация и упаковка вирусных РНК являются удивительно специфичными процессами. Оба этих процесса безошибочно выбирают правильные вирусные молекулы из числа тысяч рибонуклеиновых кислот, содержащихся в клетке. Это в основном связано с присутствием сis-аcting сигналов, которые селективно определяют репликацию вирусных РНК и сборку вирионов, но в большинстве РНК-геномов вируса эти сигналы до конца ясно не идентифицированы.

Сигналы, которые были охарактеризованы, включают не линейные нуклеотидные последовательности, а вторичные структуры в виде петель, тРНК-подобных структур и псевдоузлов, которые создают специфические трехмерные молекулярные формы, способные взаимодействовать только с вирусными ферментами и структурными белками вируса. Однако понимание молекулярных основ специфичности репликации РНК и сборки вирионов ограничено недостатком знаний трехмерных структур вирусной РНК и ее действующих сis-аcting сигналов.

Сателлитные РНК и дефектные РНК геномы. Иногда в инфицированных клетках обнаруживаются молекулы РНК, которые не являются ни независимо инфекционными, ни существенными для инвазионной способности вируса, но однако содержат действующие сis-аcting сигналы, активирующие их собственную репликацию и/или упаковку в белки, кодируемые другим вирусом. Такие спутниковые (сателлитные) РНК, паразитирующие на материнском вирусе, могут модулировать его репликацию и вирулентность. Среди РНК-содержащих вирусов животных основным примером вируса сателлита является вирус гепатита дельта, который упаковывает свой геном в белки, кодируемые вирусом гепатита B, и может существенно усиливать его патогенность. Паразитирование РНК-сателлита на ДНК-содержащем вирусном родителе необычно; как правило, спутниковые РНК копируются и инкапсидируются в белки РНК-содержащего вируса-родителя, с которым они имеют, по крайней мере, некоторую, гомологию последовательностей. В ряде случаев, сателлитные РНК кодируют собственные белки капсида, или белки, требуемые для репликации РНК (как в случае вируса гепатита дельта), но чаще они с точки зрения трансляции не активны. Сателлитные РНК чаще встречаются среди вирусов растений, чем среди вирусов животных, возможно, потому что трансмиссия животных вирусов между хозяевами происходит путями, которые не оптимальны для сателлитов.

В отличие от передачи вирусной инфекции между хозяевами, распространение инфекции в пределах одного организма животного обычно вовлекает последовательные эпизоды ограниченной вирусной репликации. Эти состояния формируют поколение и увеличивают число дефектных вирусных РНК, которые являются результатом, как простых делеций, так и более сложных перестроек генома, происходящих в процессе репликации РНК. Подобно сателлитным РНК, дефектные РНК паразитируют на материнском вирусе и мешают его репликации. Однако дефектные вирусы в своем выживании полностью зависят от материнского вируса. Большинство семейств рибовирусов животных с готовностью производят дефектные интерферирующие РНК в культуре клеток, но их влияние на развитие вирусной болезни до конца не изучено.

Структурные и неструктурные белки вирусов. По определению, вирусоспецифические структурные белки включены в вирусные частицы, а неструктурные белки найдены только в инфицированных клетках. Однако вирусы с негативным, амбиполярным и двунитевыми РНК-геномами включают в потомство вирионов RdRp и ассоциированные ферменты и поэтому кодируют преимущественно или исключительно структурные белки. В дополнение к полимеразе, кодируемые вирусом ферменты часто включают одну или несколько протеаз, РНК-хеликазу, гуанилил– и метилтрансферазы, поли-А-полимеразу, иногда нуклеазу, а в случае ретровирусов – ДНК-интегразу. В тоже время, для нескольких РНК-вирусов установлено участие в репликативном цикле ферментов клетки-хозяина.

Протеазы расщепляют продукт первичной трансляции, частью которого они являются, в высоко определенных последовательностях (сайтах). В некоторых клетках, инфицированных пикорнавирусами, они также выборочно запрещают синтез белка клетки-хозяина путем протеолиза клеточного кэп-связывающего белка. Хеликазы необходимы большим РНК-содержащим вирусам для разрушения внутримолекулярного спаривания оснований в течение синтеза РНК, хотя некоторые RdRp способны расплетать дуплексы РНК без ее помощи. Гуанилил– и метилтрасферазы строят 5’-кэп на мРНК почти у всех РНК-вирусов эукариот, кроме пикорнавирусов, РНК которых не кэпирована, и ортомиксо– и буньявирусов, которые крадут кэп у клеточных мРНК посредством кэп-специфической эндонуклеазы. На 3’-конце мРНК большинства вирусов животных находится поли-А трек, а у РНК-вирусов растений, как правило, тРНК-подобная структура. Полиаденилирование обычно происходит в результате побочной реакции (пробуксовывания) вирусной RdRp, а не в результате работы поли-А-полимеразы, как у поксвирусов.

Белки клетки-хозяина. Существенную роль в репликации РНК-содержащих вирусов могут играть белки клетки-хозяина. Следует отметить, что в различных вирусных системах в этот процесс вовлечены различные клеточные белки. Самым ярким примером является РНК-репликаза бактериофагов Qb и MS2, у которых, в дополнение к единственному фагоспецифическому полипептиду для обеспечения полимеразной активности необходимо четыре клеточных субъединицы: рибосомальный белок S1 E.coli, два фактора элонгации трансляции и РНК-связывающий белок. У некоторых вирусов эукариот в репликацию РНК также могут быть вовлечены факторы трансляции хозяина. Например, у бромовирусов (вирусы растений) субъединица инициирующего фактора eIF-3 связывается с RdRp и увеличивает ее активность. В инфицированных клетках несколько других белков хозяина взаимодействуют с концевыми нуклеотидными последовательностями вирусных РНК. Среди них – поли-A– и полипиримидин-связывающие белки, карлетикулин и белки Ro и L, взаимодействующие с малыми ядерными РНК. Хотя следует отметить, что отличить случайные взаимодействия от тех, которые играют функциональные роли, часто затруднительно.

Мембраны клетки-хозяина. В отличие от фаговых репликаз, RdRp вирусов эукариот неизменно связана с надмолекулярными структурами: мембранами клеткихозяина у (+)РНК-вирусов, нуклеокапсидом у (-)РНК-вирусов и субвирусными частицами у днРНК-вирусов. Внутриклеточные мембраны клеток, инфицированных вирусами с (+)РНК-геномом, подвергаются быстрому перераспределению, формируя места заякоривания вирусных репликативных комплексов. Когда эти комплексы отсоединяются от мембран, они теряют способность катализировать истинную репликацию РНК, хотя часто сохраняют ограниченную способность копировать РНК-матрицу. При изучении нодавирусной инфекции истинная РНК-репликазная активность частично очищенной RdRp была восстановлена путем добавления к бесклеточному экстракту глицеролфосфолипидов. Эти результаты подтвердили идею, что мембранная организация играет центральную роль в репликации (+)РНК. То же самое заключение получено при ингибировании репликации РНК полиовируса брефелдином А, который блокирует внутриклеточные мембранные взаимодействия. Хотя определенная роль мембран неясна, вероятно, они могут ускорять сборку репликативных комплексов, сокращая время процесса и отделяя дочерние молекулы от матриц.

Механизмы репликации РНК-геномов. Как уже отмечалось, репликация РНК-геномов осуществляется вирусоспецифической RdRp, которая может входить в состав вириона или детерминироваться геномом. В отличие от ферментов, которые копируют ДНК с использованием затравки, большинство RdRp могут начать синтез РНК de novo. Исключением является RdRp пикорнавирусов, которая для инициирования синтеза использует маленький вирусный белок (VPg), ковалентно связанный с урацилом. VPg удаляется при трансляции генома, но сохраняется при его инкапсидации.

Интересно, что у тогавирусов (вирус Синдбис), репликация (+)РНК на стадии синтеза минус-нити (образование РФ) осуществляется только переходной версией RdRp, которая впоследствии протеолитически процессируется, что переключает матричную специфику RdRp на синтез положительных нитей.

Репликациция (+)РНК полиовирусов .

Полиовирусы – мелкие (27 нм) безоболочечные икосаэдрические вирусы, поражающие позвоночных. Геном – линейная однонитевая РНК позитивной полярности. На 5'-конце РНК ковалентно связана с терминальным геномным белком через остаток тирозина, 3'-конец полиаденилирован (рисунок 8).

Репликацию/транскрипцию генома осуществляет РНК-полимераза, детерминированная 3'-концом генома, который транслируется сразу после попадания вируса в клетку. На первой стадии репликации происходит образование двухнитевой РФ за счет синтеза минус-нити, инициированного присоединением молекулы урацила к 3'-поли-А концу.

Рисунок 8 – Схема репликации РНК полиовирусов

Кроме РНК-полимеразы в клетке синтезируется вирус-специфический терминальный низкомолекулярный белок (VPg), который через тирозин связывается с молекулой урацила. Данная структура используется РНК-полимеразой в качестве затравки – то есть происходит терминальная инициация с использованием нуклеотидбелковой затравки. Синтез идет с вытеснением цепи. Образующиеся молекулы (+)РНК до накопления достаточного количества вирусоспецифических белков используются как мРНК, после чего они начинают инкапсидироваться в вирусную частицу.

Следует отметить, что представленная схема репликации геномной (+)РНК полиовирусов не является универсальной. Вирусные (+)РНК-геномы различаются организацией 5'– и 3'-концевых структур, что определяет особенности их репликации, связанные с инициацией синтеза.

Репликациция (-)РНК-геномов .

Вирусные (-)РНК-геномы могут быть непрерывными или сегментированными. Во всех случаях РНК находится в составе рибонуклеопротеина, что и определяет особенности ее репликации, поскольку депротеинизированная РНК не может служить матрицей для полимеразы. Все вирусы с (-)РНК-геномом имеют собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу, входящую в состав РНП. Для получения полноразмерного генома должна быть синтезирована репликативная полноразмерная плюс-нить. Однако на первом этапе репродуктивного цикла геномная (-)РНК служит матрицей для транскрипции, которая протекает с последующим процессингом мРНК, и не может служить матрицей для синтеза полноразмерной копии. Синтез репликативной полноразмерной (+)РНК начинается только после накопления соответствующих вирусных белков, подавляющих преждевременную терминацию РНК на внутренних участках матрицы. Каким образом это происходит, остается пока неизвестным. Синтез антигеномной и геномной РНК происходит в составе РНП.

Репликациция днРНК реовирусов .

Реовирусы – двукапсидные (60-75 нм) частицы с икосаэдрическим типом симметрии, инфицируют позвоночных, беспозвоночных, растения. Геном состоит из 10-12 фрагментов днРНК.

Репликация днРНК неразрывно связана с транскрипцией, которая является ее первой стадией.

1 Синтез (+)РНК на двухнитевой матрице протекает по консервативному типу без вытеснения цепи и происходит в составе однокапсидной вирусной частицы при участии белков кора – вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP2) и гуанидилтрансферазы (VP3). мРНК покидают частицу через поры внутреннего капсида.

2 Плюс-нити РНК объединяются с вновь синтезированными белками кора и неструктурными (NS) белками. При созревании вириона РНК-полимераза осуществляет синтез минус-нитей на матрице (+)РНК по репарационному механизму, затягивая ее внутрь формирующегося капсида. Сформированная однокапсидная частица может снова начать синтез плюс-нитей РНК.

Как и в случае полиовирусов, представленный способ репликации генома реовирусов не является универсальным для вирусов с днРНК геномом. Например, у фага φб синтез плюс-нитей на родительском дуплексе происходит по полуконсервативной модели и всегда сопряжен с вытеснением предшествующей нити (+)РНК.

В процессе репликации ДНК-содержащие вирусы осуществляют некоторые шаги, которые отсутствуют у РНК-геномных вирусов. Для большинства ДНК-содержащих вирусов генетические стратегии включают: транспорт ДНК вириона в ядро клетки, инициирование транскрипции с этой ДНК, индукцию транскрипции дополнительных вирусных генов, подготовку клетки для репликации ДНК вируса, дублирование ДНК-генома, упаковку ДНК в вирионы и выход вирусных частиц из ядра. Кроме этого, многие ДНК-вирусы развили уникальные механизмы уклонения от иммунной защиты организма и способность вызывать опухоли у животных. В процессе близких отношений со своими хозяевами, вирусы эксплуатируют ключевые клеточные регуляторные системы и узурпируют важные клеточные процессы. В связи с этим, изучение различных аспектов репликации ДНК-вирусов обеспечивает новые фундаментальные знания о молекулярных процессах, происходящих в клетке, включая выражение генов, репликацию ДНК и контроль за циклом клеточного деления.

Подготовка клеток для репликации вирусной ДНК. В ходе продуктивной вирусной инфекции многие ДНК-вирусы из единственной молекулы генома могут получить 100000 или больше копий генома в течение нескольких дней. Для этого требуется работа множества белков, включая ДНК-связывающие белки и полимеразы, а также обильная поставка нуклеотидов. Репликация некоторых ДНК-вирусов происходит только в клетках, которые естественно реплицируют свою собственную ДНК, обеспечивая тем самым необходимую клеточную среду для репликации вирусной ДНК. Другие ДНК-вирусы также в значительной степени полагаются на клеточные системы репликации ДНК, но эти вирусы кодируют белки, стимулирующие клеточный цикл деления. Наконец, некоторые из самых больших ДНК-содержащих вирусов ограничено используют клеточный репликативный аппарат, т.к. сами кодируют вирусные версии многих из необходимых белков.

К первой группе вирусов относятся самые простые ДНК-содержащие вирусы семейства Parvoviridae, которые имеют линейный однонитевой геном. Парвовирусы могут реплицировать свою ДНК и осуществлять полный инфекционный цикл только в клетках, находящихся в стадии репликации ДНК – то есть в S-фазе клеточного цикла.

Фактически, экспрессия вирусных генов не активизируется до тех пор, пока клетка не войдет в S-фазу и ДНК-геном вируса не будет преобразован в двунитевую РФ, которая является матрицей для транскрипции. Однако, в отличие от других вирусов, которые требуют, чтобы клетки активно копировали свою ДНК, парвовирусы неспособны стимулировать переход клетки в S-фазу. В связи с этим, они могут выполнять успешную репродукцию только в том случае, если попадают в клетку, уже осуществляющую синтез ДНК. Некоторые парвовирусы, особенно аденассоциированный вирус (AAV), имеют даже более строгие требования и могут копироваться только в присутствии помощника – аденовируса или вируса герпеса, генные продукты которых активируют экспрессию геновпарвовируса и репликацию его ДНК.

Другие ДНК-вирусы для того, чтобы создать условия для репликации своей ДНК, стимулируют клетки к делению. Для этих вирусов репликация вирусной ДНК является результатом взаимодействия между клеточными репликативными белками и вирусными белками, которые прямым образом участвуют в репликации, а также белками– инициаторами, которые локализуются в точке начала репликации вирусного репликативного аппарата. Эти ДНК-вирусы перестраивают репликативный аппарат клетки на вирусную репликацию, участвуя в белок-белковых взаимодействиях с ключевыми клеточными регуляторными молекулами, некоторые из которых выполняют роль шаперонов, что позволяет им стабилизировать белковые комплексы. Часто, эти взаимодействия приводят к нейтрализации клеточных белков-репрессоров опухоли типа транскрипционного фактора p53 и членов семейства ретинобластомых белков (Rb) и, как следствие, к активации клеточного роста.

Вирусные белки, которые стимулируют репликативное состояние клетки, обычно инактивируют членов семейства Rb – P105Rb, p107, и p130. Инактивация Rb предотвращает репрессию клеточного деления и разрешает E2F-опосредованную транскрипцию, что стимулирует выражение многочисленных клеточных белков, требуемых для S-фазы, включая ДНК-полимеразу α, тимидинкиназу, рибонуклеотидредуктазу и тимидилатсинтазу. Некоторые вирусные белки, например, Е1А аденовирусов и Е7 папиломавирусов человека, непосредственно связывают Rb белки и ингибируют их функцию, и таким образом активируют E2F. Другие вирусные белки регулируют активность циклин-зависимых киназ (Cdks), которые катализируют фосфорилирование Rb, приводя к активации E2F и транскрипции E2F-регулируемых генов. Ряд вирусных белков могут косвенно влиять на регуляцию клеточного цикла деления. Например, E1B-55КБ и E4orf6 белки аденовирусов и E6 папиломавирусов запрещают действие транскрипционного фактора p53 через взаимодействие с CBP/p300, который является коактиватором гена p53. Отмена функции p53 приводит к уменьшенной экспрессии ингибитора клеточного деления p21 (репрессор комплекса Cdk–циклин), таким образом активируя Сdk и соответственно переход клеток в S–фазу. Точно так же, аденовирусный E1A связывает p27, который является ингибитором Сdk, нейтрализуя его эффекты. Большой T антиген обезъяньего вируса SV40 не только связывает и инактивирует Rb и p53, но и выполняет несколько функций, непосредственно требуемых для репликации ДНК вируса. Другой механизм используют средний T-антиген полиомавирусов и белок E5 папиломавирусов быка. Эти белки активируют сигнальный каскад, опосредованный рецептором фактора роста, и возможно стимулируют экспрессию регуляторной субъединицы Сdk – циклина D, таким образом стимулируя активность Сdk и фосфорилирование белков семейства Rb. Некоторые белки вирусов герпеса и гепаднавирусов по всей вероятности также стимулируют каскады сигнальных путей, активизируя внутриклеточные белки передачи сигнала NFKB, P21ras и pp60c-src.

Индукция набора клеточных репликативных белков имеет глубокие последствия на клетку-хозяина, которая насильно побуждается к репликации ДНК. Когда пролиферативный сигнал устойчиво поддерживается, например, в непермиссивных клетках, которые не способны поддерживать репликацию вирусной ДНК, клетки могут подвергнуться устойчивой трансформации. Таким образом, мало того, что многие ДНК– вирусы стимулируют статические клетки к повторным циклам деления, они также трансформируют клетки в культуре и вызывают опухоли у животных. Рассмотренная способность многих опухолеродных ДНК-вирусов стимулировать неограниченный рост клеток не является особенностью нормальной репликации вирусов, а скорее представляет собой аберрантный ответ клеток на вирусную инфекцию. В соответствии с этим, парвовирусы, неспособные стимулировать репликацию клеточной ДНК, являются одними из немногих ДНК-содержащих вирусов, которые не трансформируют клетки. Однако способность вирусов стимулировать синтез клеточной ДНК не всегда коррелирует с их способностью трансформировать клетки. Например, одни вирусы герпеса стимулируют синтез ДНК, другие нет, и, тем не менее, они фактически запрещают быстрое клеточное деление. Такие большие вирусы с их большой кодирующей емкостью способны создать надлежащую среду для репликации вирусной ДНК без активации клеточного репликативного аппарата.

Необходимость нуклеотидов для репликации ДНК. Как описано выше, для репликации парвовирусов необходимо, чтобы клетки находились в S-фазе, а папиломавирусы, полиомавирусы и аденовирусы стимулируют клетки, чтобы ввести Sфазу, требующую для синтеза ДНК большой концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Через воздействие на членов белковых семейств Rb и E2F, папиломавирусы и аденовирусы стимулируют синтез фермента рибонуклеотидредуктазы, который требуется для поддержания достаточного для вирусной репликации уровня дНТФ. Напротив, вирусы герпеса и поксвирусы способны реплицироваться в покоящихся клетках. Одной из причин того, что эти вирусы могут обходить требование к S-фазе является их способность кодировать ферменты для синтеза дНТФ – рибонуклеотидредуктазу и тимидинкиназу. В случаях вируса герпеса и вируса опоясывающего лишая/ветряной оспы вирусная тимидинкиназа является ключевой точкой для противовирусной химиотерапии, потому что этот вирусный фермент фосфорилирует аналоги нуклеозида, такие, как ацикловир, более эффективно, чем это делают клеточные ферменты. Преобразованные в фосфорнокислую форму эти аналоги дНТФ выборочно вредят репликации ДНК герпесвирусов.

Независимо от вида ДНК-генома единицей его репликации является так называемый репликон – единица генома, способная к автономной репликации. Репликон представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную между точкой начала репликации (origin или ori) и точкой окончания репликации (terminus). Процесс репликации ДНК разделен на три стадии: инициация цепи, элонгация (удлинение) цепи и терминация синтеза. Вирусы с различными видами ДНК-генома реализуют оригинальные стратегии репликации. При этом главные особенности наблюдаются при инициации синтеза.

Основные принципы репликации ДНК-геномов вирусов.

Инициация синтеза ДНК. Большинство ДНК вирусов эукариот (кроме поксвирусов) копирует свои геномы в ядре. Репликация ДНК-геномов вирусов инициируется в специфических точках ori.

В отличие от клеточных ориджинов, которые активируются один раз в течение клеточного цикла, вирусные точки ori могут срабатывать много раз в течение отдельного цикла репликации. Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК (смотри пункт 3.7.1.1, с. 63).

Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке-хозяину, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза α. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3’– концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5’– к 3’-концу, считывание – от 3’– к 5’-концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК-матрице синтез идет через образование репликативной вилки (рисунок 9) или с вытеснением цепи, на онДНК матрице – по репарационному механизму.

В репликативных вилках одна нить (ведущая) копируется непрерывно в направлении от 5’– к 3’-концу. Поскольку другая нить (отстающая) должна также синтезироваться от 5’– к 3’-концу, она копируется с перерывами, многократно инициируя синтез и соединяя короткие фрагменты Оказаки. Синтез ДНК в репликативной вилке обеспечивается целым набором белков-ферментов, которые могут иметь разное происхождение. Мелкие ДНК-содержащие вирусы используют клеточные репликативные белки. Лучше всех изучена репликация полиомавируса SV40, где вовлеченные репликативные белки были идентифицированы в бесклеточной системе in vitro.

Рисунок 9 – Схема репликации ДНК с использованием репликативной вилки

Установлено, что в репликации ДНК SV40 принимают участие 10 белков. Девять из них имеют клеточное происхождение: ДНК-полимераза α (ответственна за инициацию синтеза ДНК в точке ori и синтез отстающей нити); праймаза (связана с ДНК-полимеразой и праймирует синтез фрагментов Оказаки); ДНК-полимераза d (ответственна за синтез лидирующей нити и завершение синтеза фрагментов Оказаки); пролиферативный клеточный ядерный антиген (PCNA), который связывается с ДНК-полимеразой d и формирует кольцо вокруг ДНК, увеличивая процессивность полимеразы; гетеропентамерный репликативный фактор C – RF-C (присоединяет кольцо PCNA на ДНК и стимулирует полимеразу d); RPA – онДНК-связывающий белок; РНаза H (удаляет все кроме одного рибонуклеотиды РНК-праймера); экзонуклеаза FEN-1, также известная как MF-1 (удаляет оставшейся рибонуклеотид); ДНК-лигаза I (лигирует фрагменты Оказаки); топоизомераза I и/или топоизомераза II (снимает сверхспирализацию в течение синтеза). Единственный вирусный белок, который требуется для репликации ДНК SV40 – это большой T-антиген, который обладает свойствами хеликазы и обеспечивает расплетение двунитевой структуры в репликативной вилке.

Другие вирусы сами обеспечивают почти все белки репликативной вилки. Например, фаза элонгации при репликации ДНК аденовируса в условиях in vitro обеспечивается одной аденовирусной субъединицей ДНК-полимеразы, аденовирусным однонитевым ДНК-связывающим белком, который может увеличивать процессивность полимеразы, и клеточной топоизомеразой I или II. Это простота частично связана с необычным характером репликации ДНК аденовируса, в которой отсутствует синтез отстающей цепи.

Крупные ДНК-вирусы еще в большей степени обеспечивают себя ферментами репликации. Например, вирусы герпеса кодируют ДНК-полимеразу, фактор элонгации, праймазо-хеликазный комплекс, однонитевой ДНК-связывающий белок и, вероятно, еще ряд вирусных белков, которые не идентифицированы.

Терминация синтеза. В случае кольцевых геномов окончание синтеза и расхождение геномов упрощены, поскольку синтез дочерней цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3’– и 5’-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3’-концом и пробелом на 5’-конце. Предложено два способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи: с использованием конкатамеров или через образование шпильки.

Основные схемы репликации ДНК-геномных вирусов.

1 Терминальная инициация с помощью самозатравочного механизма.

2 Терминальная инициация с помощью белок-нуклеотидной (Б-Н) затравки.

3 Механизм катящегося кольца.

4 Схема Кернса.

5 Репликация через интеграцию.

1 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи самозатравочного механизма (рисунок 10). Такой тип репликации геномной ДНК имеют парвовирусы, у которых геном представлен линейной онДНК, имеющей на обоих конца самокомплементарные последовательности, формирующие шпилечные структуры. 3’-конец ДНК имеет уникальную последовательность размером 125 нуклеотидов, образующую двунитевую Т-образную шпилечную структуру, которая играет роль затравки для ДНК-полимеразы.

ДНК-полимераза в результате репарационного синтеза комплементарной цепи воссоздает дуплекс, обе цепи которого на одном конце ковалентно соединены. При этом 3’-концевой сегмент родительского генома в качестве матрицы не используется. Следовательно, полного воспроизведения вирусного генома пока не произошло. На следующем этапе вирусоспецифический фермент вносит разрыв в родительскую цепь на границе между реплицированным и нереплицированным участками последовательности (между 125 и 126 нуклеотидами).

Рисунок 10 – Схема первых этапов репликации однонитевой ДНК парвовирусов

Концевые 125 нуклеотидов родительского генома становятся условной частью вновь синтезированной цепи и возникший таким образом 3’-конец родительской цепи используется для ее регенерации. В результате этих реакций возникает дисперсная двунитевая репликативная форма вирусной ДНК (рисунок 10). Далее следует цепь реакций, включающих образование на одном из концов ДНК-затравки в виде «заячьих ушек», синтез новой цепи с вытеснением родительской, образование еще одной репликативной формы. Вторая репликативная форма ДНК используется в качестве матрицы для дальнейшего синтеза вирусной ДНК, а вытесненная из дуплекса однонитевая молекула или вступает в репликативный цикл или входит в состав дочерней вирусной частицы.

2 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи белокнуклеотидной затравки (рисунок 11). Такой тип репликации геномной ДНК имеют аденовирусы, геном которых представлен линейной днДНК, имеющей на 5’-концах инвертированные повторы и ковалентно присоединенные геномные белки с м.м. 55 кДа.

В инфицированной аденовирусом клетке синтезируется вирусоспецифический белок массой 80 кДа, который связывается через серин с дезоксицитидином. Образовавшаяся структура Б-Ser – dCTP является затравкой, которая через цитозин комплементарно связывается с 3’-концевым гуанозином генома и инициирует синтез цепи ДНК.

Инициация может наблюдаться на любом конце родительской ДНК и может происходить или одновременно или последовательно. При последовательной инициации синтез дочерней цепи сопровождается вытеснением одной из родительских, а синтез комплементарной цепи идет на однонитевой матрице по репарационному механизму. В тоже время обсуждается и другой механизм синтеза второй нити. Замещенная родительская однонитевая ДНК имеет на концах самокомплементарные инвертированные повторы, которые отжигаются, восстанавливая двунитевую точку ori, узнаваемую инициирующими белками, обеспечивающими синтез родительскодочернего дуплекса. Таким образом, каждый родительский дуплекс копируется полуконсервативно.

Рисунок 11 – Схема репликации генома аденовируса

Однако процесс протекает без синтеза отстающей цепи, т.е. без образования множественных сайтов инициации и синтеза фрагментов Оказаки.

3 Репликация кольцевых геномов по механизму катящегося кольца (рисунок 12). Катящееся кольцо – способ репликации, при котором репликационная вилка совершает множество оборотов на кольцевой матрице. Синтезирующаяся в каждом цикле нить вытесняет прежнюю (гомологичную) цепь двуцепочечной молекулы, синтезированную в предыдущем цикле, образуя хвост, состоящий из набора последовательностей, комплементарных одноцепочечному матричному кольцу. В общих чертах репликация по механизму катящегося кольца имеет следующие стадии:

Рисунок 12 – Схема репликации ДНК-геномов по механизму катящегося кольца

1 Вирусоспецифический фермент вносит однонитевой разрыв в уникальном сайте родительской цепи репликативной формы.

2 Фермент остается связанным с 5’-концом, освободившийся 3’-концевой нуклеотид служит затравкой для ДНК-полимеразы.

3 ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды комплементарно замкнутой цепи, то есть синтезируется только лидирующая цепь. 5’-конец родительской цепи вытесняется. Наблюдается образование сигма-молекул (δ).

4 После того, как репликационная вилка завершит чуть больше полного оборота, вытесненная цепь замыкается в кольцо, а фермент перемещается на вновь синтезированную нить и цикл повторяется. Таким образом, вновь синтезированная нить, имеющая последовательность геномной, становится компонентом РФ, а предшествующая (родительская) оказывается в свободном виде.