Текст книги "Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных"

Механизм катящегося кольца при репликации ДНК используют многие бактериофаги.

Однако этот механизм не игнорируют и вирусы эукариот. Например, линейная вирионная ДНК вируса герпеса при попадании в клетку переходит в кольцевую форму и, пройдя первую стадию тета-репликации (см. ниже), реализует механизм катящегося кольца.

Однако, вместо производства кольцевых дочерних молекул, репликация генерирует конкатамерные молекулы. Чтобы восстановить линейные дочерние молекулы ДНК вирусоспецифические белки расщепляют конкатамеры в определенных сайтах последовательности в процессе упаковки ДНК в капсиды.

4 Репликация ДНК по схеме Кернса (тета-репликация) включает несколько этапов (рисунок 13):

Рисунок 13 – Репликация ДНК по схеме Кернса

1) вирусоспецифический неструктурный белок, обладающий хеликазной активностью, связывается с ДНК-последовательностью в точке ori и расплетает двунитевую структуру;

2) праймаза синтезирует две РНК-затравки. Образуются две репликативные вилки (2 лидирующие и 2 отстающие цепи), которые в процессе комплементарного синтеза удаляются друг от друга, двигаясь в разных направлениях. Наблюдается образование тета-молекул (θ);

3) сбрасывание внутримолекулярного напряжения обеспечивает топоизомераза I путем внесения точечных однонитевых разрывов, которые тут же лигируются. Образуются два двунитевых кольца, где родительские цепи соединены друг с другом. Разъединение осуществляет топоизомераза II, которая вносит разрывы в двунитевые кольца. Затем разрывы лигируются. Такой тип репликации используют в качестве промежуточной стадии многие крупные ДНК-содержащие вирусы, в том числе: бактриофаги, вирусы герпеса, а также, вирусы с кольцевым днДНК геномом, поражающие человека и животных. Это вирусы, относящиеся к семействам Polyomaviridae (см. вирион SV40) и Papilomaviridae, ранее входившие в одно семейство Papovaviridae. Полиома– и папиломавирусы – это б/о, относительно мелкие (4555 нм) икосаэдрические вирусы. Капсид, образованный тремя белками, имеет четко выраженную капсомерную структуру (72 капсомера).

Реплицируются в ядре. Геном – двунитевая кольцевая сверхспирализованная ДНК размером 5-8 т.п.н., ассоциированная с 4-мя клеточными гистонами. Кодирует два неструктурных белка – большой и малый Т-АГ. Это трансформирующие антигены. Геном может интегрировать с геномом клетки хозяина. Большой Т-АГ обладает свойством хеликазы и принимает участие в репликации ДНК – связывается с ДНК в точке ori. Гены Т-АГ транскрибируются сразу после попадания ДНК в ядро. Т.о. транскрипция ДНК у этих вирусов опережает репликацию.

5 Репликация ДНК с использованием промежуточных конкатамерных форм. Простейшая схема такой репликации наблюдается у бактериофагов T-нечетной серии, например T7. ДНК фага T7 – линейная двухнитевая молекула с прямыми концевыми повторами. Инициация репликации начинается на внутреннем участке, где расположен промотор для фаговой ДНК-зависимой РНК-полимеразы, которая синтезирует транскрипт, использующийся в качестве затравки для синтеза ДНК. Внутренняя инициация проходит без разрыва родительской цепи. Возникшие две репликативные вилки движутся в разных направлениях, осуществляя полуконсервативную репликацию вирусного генома. Первая стадия этого процесса заканчивается образованием двух дочерних дуплексов, где вновь синтезированные нити не достроены, так как не произошло копирования 3'-концов родительских цепей, что неизбежно возникает при внутренней инициации на линейной матрице. Таким образом, один из 3'-концов образовавшихся дуплексов находится в однонитевой форме. Поскольку молекула ДНК фага Т7 имеет прямой концевой повтор, однонитевые 3'концы сестринских молекул взаимно комплементарны и способны к ассоциации. Ассоциация комплементарных последовательностей приводит к образованию димерных молекул – конкатемеров. Далее созревание молекул идет аналогично рассмотренному нами выше способу терминации. Фагоспецифический фермент вносит в димер ступенчатый разрыв таким образом, что выступающими становятся 5'концы, которые репарируются ДНК-полимеразой (рисунок 14).

Рисунок 14 – Схема репликации фага Т7

6 Репликация вирусных ДНК через обратную транскрипцию и интеграцию. Интеграция – внедрение вирусной (или другой) последовательности ДНК в геном клетки хозяина, приводящее к ковалентному соединению с хозяйской последовательностью. В таком случае репликация вирусного генома и его транскрипция осуществляются по общим клеточным механизмам.

Интеграция вирусного генома в геном хозяина может происходить несколькими путями:

a) интеграция с использованием сайт-специфической рекомбинации. В общем смысле рекомбинация – это взаимодействие между специфическими участками ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация – взаимодействие между специфическими парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последовательности. Это консервативная рекомбинация. Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов – attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обозначается как POP', клеточная – ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-РОВ'. Для осуществления интеграции необходима интеграза (топоизомераза I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный вирусный геном существует в виде профага и может выщепляться с участием вирусоспецифического белка;

б) интеграция и репликация в процессе репликативной транспозиции. Транспозон – последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.

Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага – линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах клеточные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму, близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит однонитевые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клетки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Выступающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с 3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе репликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.

Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации, на которой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклеотидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матричном синтезе.

Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрипции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в редких случаях – РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уникальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.

Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрипции клеточную РНК-полимеразу II. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую, тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней – собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.

В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе вириона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто– и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.

Общие принципы транскрипции геномов вирусов сходны с таковыми для клеток про– и эукариот. Индивидуальные особенности проявляются на стадиях посттранскрипционного процессинга (созревания) мРНК и регуляции транскрипции. Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом промотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции – транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна цепь, которую называют значащей или матричной. У эукариот в состав транскриптона входит один ген. Транскриптон прокариот содержит несколько генов, его чаще называют оперон. Транскрипционный цикл включает несколько стадий: связывание транскриптазы с матричной цепью, инициацию цепи РНК, элонгацию, терминацию и посттранскрипционный процессинг. Процессинг может включать кэпирование 5'конца, метилирование гуанидина, полиаденилирование 3'-конца, сплайсинг. При рассмотрении принципов транскрипции следует различать первичную транскрипцию (синтез на геномной матрице) и вторичную транскрипцию (синтез на вновь синтезированной матрице).

Многообразие видов вирусных геномов определяет существование различных подходов к синтезу вирусных мРНК в клетке хозяина. Однако все эти подходы могут быть суммированы в единой схеме стратегии синтеза мРНК (рисунок 15).

Рисунок 15 – Стратегия транскрипции геномов вирусов

Независимо от структуры и стратегии репликации геномов, все вирусы должны экспрессировать гены на ранних этапах инфекции в виде функциональных мРНК, чтобы использовать трансляционный аппарат клетки для синтеза вирусных белков. Исходя из этого различные генетические стратегии, используемые РНК-вирусами, сосредоточены вокруг вирусных мРНК, которые определены, как ключевая структура в этих процессах. Транскрипция РНК-геномов вирусов осуществляется тем же ферментом, что и репликация – вирусоспецифической RdRp, которая также является транскриптазой. У РНК-содержащих вирусов репликация и транскрипция процессы взаимосвязанные и часто их трудно разделить.

1 (+)РНК-геномы. Геномная (+)РНК – это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (фаг Qβ, некоторые вирусы растений).

Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:

а) с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);

б) без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.

Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.

В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3'-концы, идентичные 3'-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5'-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3'-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.

Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3'-, но и по 5'-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.

2 (-)РНК-геномы. Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.

Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного ()РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3'– к 5'-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5'концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.

Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5'-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5'-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3'-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.

3 Диплоидный (+)РНК-геном ретровирусов. Прежде чем произойдет транскрипция ретровирусного генома, он претерпевает целый ряд молекулярных превращений, включающих обратную транскрипцию, интеграцию ДНК в геном хозяина и только после этого – синтез мРНК с использованием клеточного транскрипционного комплекса. Геном ретровирусов монолитен, кодирует полипротеин, то есть транскрибируется без образования субгеномных РНК. Первичные транскрипты подвергаются сплайсингу.

4 днРНК-геном реовирусов. Транскрипцию осуществляет вирионная транскриптаза – РНК-зависимая РНК-полимераза, находящаяся в составе однокапсидной вирусной частицы.

У сложно устроенных РНК-содержащих вирусов транскрипция происходит не на голой матрице, а в составе транскрипционных комплексов. Капсидные белки обеспечивают правильную конформацию РНК, защиту от клеточных нуклеаз, связь фрагментов генома друг с другом, а также регуляцию транскрипции.

5 Амбисенс (обоюдозначащая, амбиполярная) РНК. Амбиполярная РНК имеет 5'-конец позитивной полярности, а 3'-конец негативной полярности. При попадании в клетку с геномной РНК считываются два класса комплементарных РНК: с 3'-конца считывается субгеномная мРНК и полноразмерный антигеном. Антигеном, в свою очередь, опять служит матрицей для двух классов РНК. С антигенома считывается вторая субгеномная мРНК и полноразмерная обоюдозначащая геномная, которая идет на построение вирусных частиц.

Каждая клетка млекопитающих содержит приблизительно 6×10⁹ пар азотистых оснований ДНК и > 10⁴ активных промотора. Это создает определенные трудности для вирусной ДНК, т.к. вирусные промоторы должны эффективно конкурировать за использование клеточного транскрипционного аппарата, а завербованный аппарат клетки должен эффективно генерировать вирусные транскрипты. Для этого ДНК-вирусы осуществляют стратегию эффективного инициирования транскрипции на вирусной ДНК в одном или более специфическом промоторе вскоре после того, как ДНК введена в ядро.

Эти промоторы непосредственно управляют транскрипцией так называемых ранних генов.

Энхансеры (гены – усилители). Для того чтобы элементы клеточного транскрипционного аппарата могли взаимодействовать с ранними вирусными промоторами и активизировать транскрипцию, многие ДНК-вирусы содержат геныусилители или энхансеры – cis-acting регуляторные последовательности, выполняющие роль минимальных промоторов.

В отличие от промоторов, они могут активизировать транскрипцию, находясь выше или ниже сайта связывания, запускающего транскрипцию, со скоростью от тысячи пар азотистых оснований (биты) в секунду. Эта особенность определенных энхансеров подчеркивает конкурентоспособное преимущество к связыванию с вирусными промоторами. Действительно, высокая активность энхансера/промотора ранних генов цитомегаловируса определяет его частое использование в векторах экспрессии. Хотя клеточные гены часто содержат энхансеры, первый ген-усилитель был обнаружен у полиомавируса SV40. Энхансер SV40 состоит из двух тандемных дупликаций 72 п.н., которые содержат сайты связывания, по крайней мере, для шести различных факторов транскрипции, включая множественные сайты связывания для некоторых факторов. Необходимым условием для оптимальной функции энхансера является его специфическое местоположение и кратность факторов, участвующих в транскрипции.

Многие энхансеры также содержат специфические сайты для "архитектурных" белков, которые не имеют функции активации транскрипции, а образуют с энхансером собственный, скорее стереоспецифический, трехмерный комплекс белка и гена, который назван энхансеосомой. Эти комплексы нуклеопротеида могут активировать транскрипцию со значительной мощностью и специфичностью за счет взаимодействия с РНК-полимеразой II.

Факторы транскрипции вириона. В дополнение к энхансерам некоторые ДНК-вирусы кодируют белки, которые упакованы в вирион, вводятся в клетку с вирусной ДНК и, затем, облегчают транскрипцию ранних генов. Классическим примером этого являются поксвирусы, которые реплицируются в цитоплазме, что делает бесполезным клеточный аппарат транскрипции. Поксвирусы кодируют и упаковывают в вирионы собственную РНК-полимеразу, ферменты кэппирования и полиаденилирования и факторы транскрипции. После проникновения в клетку и раздевания, вирусный транскрипционный аппарат активируется и синтезирует вирусные ранние транскрипты. Другой примером является трансактиватор VP16 вируса простого герпеса (HSV). HSV VP16 синтезируется на поздней стадии инфекции и упаковывается в часть вириона, известную как тегумент, который находится между капсидом и оболочкой. После проникновения HSV в клетку, VP16 транспортируется в ядро, где формирует комплекс, по крайней мере, с двумя клеточными белками – Oct-1, который является активатором транскрипции, узнающим 8 п.н. последовательность ДНК, и HCF-1. Этот трехмерный комплекс связывается со специфической ДНКпоследовательностью HSV в области TAATGARAT (R = пурин), расположенной выше ранних генов. Специфичность и аффинное сродство обеспечивает Oct-1. Комплекс служит мощным активатором транскрипции. Эта функция связана с С– терминальным активационным доменом VP16, который может связываться фактически с любой последовательностью ДНК, расположенной выше TATA-бокса промотора, в связи с чем, он может активизировать транскрипцию в любой клетке эукариот. Действительно, VP16 является универсальным активатором транскрипции, т.к. активационный домен VP16 может взаимодействовать со многими различными белками клеточного аппарата транскрипции, однако не ясно, какой именно белок наиболее важен для его действия.

Стимуляция генной экспрессии вирусными ранними белками. В процессе внутриклеточного жизненного цикла ДНК-содержащие вирусы экспрессируют свои гены в высоко упорядоченной последовательности. Хотя экспрессия геномов вирусов может регулироваться посттранскрипционно, главный контроль осуществляется на уровне транскрипции. Вирусные ранние гены кодируют белки, которые, будучи транслированы, стимулируют экспрессию так называемых поздних вирусных генов. Это происходит благодаря наличию ранних и поздних промоторов, которые обычно испытывают недостаток энхансеров или специфических сайтов для комплексов транскрипции, подобных тем, что формируются белками вириона или, например, VP16, для того, чтобы эффективно конкурировать с клеточными промоторами транскрипции. Выражение некоторых вирусных генов (например, поздних генов папиломавирусов) ограничено специфическим состоянием клеточной дифференцировки. В основе этого ограничения может лежать ткане-специфическая экспрессия клеточных факторов транскрипции.

Должно также быть отмечено, что несколько вирусов кодируют белки, которые дополнительно стимулируют экспрессию некоторых вирусных генов в специфическое время жизненного цикла вируса. Кроме того, многие вирусы влияют на экспрессию клеточных генов, что может повлечь за собой индукцию или репрессию специфических генов, а также неспецифическое выключение экспрессии генов. Имеется много механизмов, которые связаны с функцией ранних вирусных белков. Например, белок BZLF1 (также известный, как Zta) вируса Эпштейна-Барр (сем. Herpesviridae), может вести себя подобно клеточным факторам транскрипции, которые связываются со специфической последовательностью выше генов и активизируют их транскрипцию.

Другие ранние белки увеличивают активность клеточных факторов транскрипции. Например, белок аденовируса E1A замещает членов транскрипции, разрушает комплекс белков семейства E2F и белков-репрессоров семейства Rb. Это увеличивает транскрипцию ранних генов аденовируса, которые содержат E2Fсвязывающие сайты, что имеет важные последствия для клеточной транскрипции и, косвенно, для репликации вирусной и клеточной ДНК. Другие ранние белки, подобные ICP4 вируса простого герпеса, могут стимулировать транскрипцию путем прямого взаимодействия с транскрипционным аппаратом без связывания со специфическими последовательностями ДНК целевого промотора, или стимулировать экспрессию вирусных генов с использованием механизмов посттранскрипционного процессинга. В любом случае результатом действий этих вирусных белков является то, что клеточный транскрипционный аппарат используется для реализации информационных программ вируса, а не клетки.

Принципы транскрипции ДНК-геномов. По механизму транскрипции ДНК-геномы вирусов можно разделить на 4 группы:

1 днДНК, транскрипцию которой осуществляют клеточные ферменты (ядерные полиома-, адено-, герпесвирусы, ряд бактериофагов, например λ, Т4). Как правило, транскрипцию осуществляет РНК-полимераза II, реже – РНК-полимераза III (ряд транскриптов аденовируса). Возможны ситуации, когда транскрипцию ранних генов осуществляет клеточная РНК-полимераза, а поздних – вирусоспецифическая или модифицированная клеточная РНК-полимераза, содержащая вирусоспецифическую субъединицу (фаги Т7 и Т4, соответственно).

2 днДНК, раннюю транскрипцию которой осуществляют вирусные полимеразы, входящие в состав вириона. Поздние гены транскрибируются вновь синтезированными вирусными полимеразами, детерминированными геномом вируса (поксвирусы, фаг N4).

3 онДНК, которая прежде чем транскрибироваться должна перейти в двухнитевую форму (парвовирусы, включая дефектные вирусы, требующие для размножения наличия вируса-помощника).

4 Кольцевая частично двухнитевая днДНК (вирус гепатита B, вирус мозаики цветной капусты). Прежде чем транскрибироваться, ДНК проходит стадию репарации.