Текст книги "Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных"

8.7 Введение фаговой нуклеиновой кислоты в бактериальную клетку

Особенности строения бактериальных клеток, имеющих устойчивую к воздействию факторов внешней среды и относительно жесткую клеточную стенку, определяют существование ряда отличительных механизмов введения нуклеиновой кислоты бактериофага в клетку хозяина. Остановимся на двух примерах.

1 Введение ДНК в клетку хозяина фагами с сократительным хвостовым отростком происходит с использованием «шприцевого» механизма. Адсорбция фага на клеточной поверхности и введение нуклеиновой кислоты в клетку представляют собой многоступенчатый энергозависимый процесс, в котором участвуют три структурно и функционально разделенные системы: сенсорная (включает длинные и короткие хвостовые фибриллы), сократительная (хвостовой чехол) и проводящая (хвостовой стержень).

Введение ДНК в клетку хозяина включает несколько этапов:

• обратимое связывание длинных фибрилл бактериофага с липополисахаридами клеточной стенки бактерии, сопровождающееся их сгибанием и реорганизацией базальной пластинки, что приводит к контакту коротких фибрилл с клеточной поверхностью;

• необратимое связывание коротких фибрилл бактериофага с липополисахарид-белковым комплексом бактериальной стенки;

• перестройка базальной пластинки, приводящая к энергозависимому сокращению хвостового чехла (каждая молекула белка хвостового чехла содержит 1 молекулу ГТФ, гидролиз которой обеспечивает энергией процесс сокращения);

• сокращение хвостового чехла приводит к экспонированию хвостового стержня, который своим дистальным концом остается связанным с базальной пластинкой, обусловливающей точечный лизис клеточной стенки;

• хвостовой стержень проходит через клеточную стенку, проникает в периплазму и достигает цитоплазматической мембраны, ДНК фага из головки по полому стержню поступает в периплазму и через цитоплазматическую мембрану транспортируется в клетку. Строгая специфичность взаимодействия сенсорных систем вируса с клеткой и скоординированность структурных перестроек его специализированных компонентов обеспечивает фагу T4 самую высокую эффективность заражения среди всех известных вирусов.

2 Введение РНК бактериофага φ6 (Cystovirus) в клетку хозяина – фитопатогенной псевдомонады Pseudomonas pseudoalcaligenes – представляет собой не менее уникальный механизм. Он включает целый ряд уже известных стадий: слияние мембран, лизис пептидогликана клеточной стенки, эндоцитоз и прямую пенетрацию.

Схематично этот процесс выглядит следующим образом: оболочечный вирус адсорбируется на клеточных рецепторах с использованием шипов, образованных прикрепительным белком P3, которые при этом сокращаются. Сокращение P3 позволяет белку слияния P6 войти в контакт с клеточной поверхностью. Слияние P6 с поверхностью псевдомонады активирует литический фермент P5, входящий в состав нуклеокапсида. Фермент Р5 осуществляет разрушение пептидогликана клеточной стенки. В результате этого нуклеокапсид приходит в контакт с цитоплазматической мембраной. Нуклеокапсид проникает через цитоплазматическую мембрану по механизму эндоцитоза, покидая эндосому путем прямой пенетрации с потерей основных белков нуклеокапсида P8 и P5. В цитоплазму выходит полимеразный комплекс, ассоциированный с тремя сегментами днРНК.

8.8 Типы взаимодействия фагов с бактериями

На основании особенностей жизненного цикла бактериофаги разделяют на две группы:

1) вирулентные бактериофаги – фаги, жизненный цикл которых завершается лизисом клетки хозяина и выходом зрелых фаговых частиц;

2) умеренные или лизогенизирующие бактериофаги – фаги, способные после проникновения в бактериальную клетку переходить в состояние профага и длительное время реплицироваться совместно с бактериальным геномом, передаваясь очередному поколению бактерий.

Существуют два основных типа взаимодействия фагов с бактериями – продуктивный и лизогенный, осуществляемый, соответственно, вирулентными и умеренными фагами.

Продуктивный тип взаимодействия. После проникновения нуклеиновой кислоты фага в клетку начинается экспрессия фаговых генов, при этом используется синтетический аппарат клетки-хозяина. В первую очередь синтезируются белки, регулирующие работу фагового генома, ферменты, участвующие в синтезе фаговых нуклеиновых кислот. Затем реплицируется геномная нуклеиновая кислота фага и синтезируются структурные белки фагового капсида. Механизм репликации фагового генома зависит от его вида и в общих чертах подчиняется принципам, изложенным в разделе «Репликация вирусных геномов». На последнем этапе происходит сборка фаговых зрелых частиц.

Продуктивный тип взаимодействия сопровождается наработкой зрелого вирусного потомства и может завершаться двумя исходами – лизисом клетки и внезапным выходом в среду вновь образовавшихся вирионов (литический тип взаимодействия) или секрецией вирионов в среду, не сопровождающейся разрушением клетки хозяина (секреторный тип взаимодействия).

При литическом типе взаимодействия к моменту завершения сборки фаговых частиц нарабатываются особые, так называемые, киллерные белки, которые убивают бактериальную клетку, останавливая все метаболические процессы и разрушая клеточную стенку. Зрелые фаговые частицы выходят во внешнюю среду не в результате механического разрушения бактериальной клетки, а в результате лизиса изнутри. Каждая из этих частиц способна инфицировать чувствительную бактериальную клетку и повторить вышеописанный цикл развития.

Уникальное завершение жизненного цикла наблюдается у иновирусов (фаги E. coli f1, M13). Зрелые нитевидные частицы этих фагов секретируются из зараженной клетки без лизиса последней. Иновирусы инфицируют только мужские клетки, так как адсорбируются на кончиках F-пилей. В процессе морфогенеза фаговые белки концентрируются на внутренней поверхности клеточной мембраны, зрелые молекулы ДНК проходят через мембрану, захватывая капсидный белок, и секретируются в среду. Иновирусы выделены из E. coli (фаги f1, fd, M13), Salmonella (фаги if1, if2), Pseudomonas (фаги Pf1, Pf3), Xanthomonas (бактериофаг Xf), Vibrio (бактериофаг v6). Особый интерес представляет фаг M13. Существование этого вируса в двух формах – репликативной (в форме плазмиды) и секреторной (инкапсидированная однонитевая кольцевая ДНК) делают его удобным инструментом молекулярногенетических исследований. Путем различных модификаций генома фага М13 сконструирован целый ряд удобных векторов клонирования на основе репликативной формы. Секретируемая одноцепочечная рекомбинантная молекула ДНК широко применяется при определении нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК.

Лизогенный тип взаимодействия. У умеренных бактериофагов первые две стадии жизненного цикла совпадают со стадиями жизненного цикла вирулентных фагов. После введения нуклеиновой кислоты в клетку хозяина умеренные фаги способны в дальнейшем либо пойти по литическому пути, аналогично вирулентному фагу, либо перейти в особое состояние, получившее название «профаг». При этом генетический материал фага интегрирует в бактериальную хромосому или переходит в плазмидоподобное состояние и реплицируется синхронно с геномом клетки. Все бактерии – потомки клетки, инфицированной умеренным фагом, содержат профаг. Такая бактериальная культура называется лизогенной. Лизогенная культура может существовать продолжительное время.

Лизогенная культура обладает следующими свойствами: она устойчива к повторной инфекции данным типом фага или фагами, близкородственными ему; всегда содержит небольшое количество зрелых фаговых частиц, о чем свидетельствует спонтанный лизис отдельных клеток в культуре.

Для системы «лизогенная бактерия – профаг» описано явление, получившее наименование индукция. При индукции профаг активизируется во всех клетках лизогенной культуры, в результате чего наблюдается продуктивный цикл развития фага, завершающийся полным лизисом клеток и выходом зрелого фагового потомства. Индукция может происходить как спонтанно, без видимых причин, так и в результате воздействия определенных факторов, получивших название индукторов. К индукторам относятся ультрафиолетовое излучение, мутагены, такие как нитрозогуанидин, акридиновые красители и ряд других.

В результате детального изучения различных типов мутантов фага λ было показано, что в формировании и поддержании лизогенного состояния участвует белок cI, получивший название иммунитетный репрессор. Установлено, что белок cI связывается с фаговой ДНК в районе области иммунности. В этой области на хромосомной карте фага λ, между геном N и геном CII находятся два промотора P_R (R – правый) и P_L (L – левый) с соответствующими им операторами O_R и O_L. Именно с этими операторами и связывается белок cI, выполняя регуляторную функцию белкарепрессора.

Блокирование белком cI левого оператора предотвращает синтез мРНК с гена N, а блокирование правого оператора предотвращает синтез мРНК с генов O и P.

Продукты генов N, O, P необходимы для выражения всех остальных генов фага λ, поэтому прямое действие репрессора на операторы O_R и O_L косвенным образом подавляет выражение практически всего генома.

Каждый оператор состоит из трех участков длиной 16 нуклеотидов, расположенных тандемно, и способен связывать от 1 до 3 молекул белка cI. Присоединение хотя бы одной молекулы репрессора предотвращает достижение РНК-полимеразой точки инициации транскрипции.

Существует репрессор синтеза репрессора cI, являющийся продуктом гена его. В клетке, содержащей геном фага λ, образование репрессора cI и репрессора репрессора cro являются взаимно исключающими состояниями. При лизогенизации и поддержании лизогении синтезируется репрессор cI и подавлен репрессор репрессора cro. При литической реакции репрессор репрессора образуется, а образование репрессора cI подавлено.

В клетке, инфицированной умеренным фагом λ, могут протекать как события, приводящие к лизогенизации, так и события, приводящие к продуктивному развитию фага. Выбор определяется соотношением уровня синтеза репрессора cI и уровня синтеза продукта гена его. Так, суперинфицирование нормальным фагом лизогенных клеток, содержащих продукт его, всегда приводит к литической реакции, а суперинфицирование нормальным фагом лизогенной клетки, содержащей репрессор cI, никогда не приводит к литическому ответу.

Кроме продуктов генов cI, cII, cIII, cro, промоторных и операторных участков существенную роль в процессах регуляции выражения генома фага λ играют гены N, O, P, Q.

Продукт гена N осуществляет позитивный контроль транскрипции всех остальных генов фага λ. При индукции профага, дефектного по гену N, с промотора P_L транскрибируется только сам ген N, а с промотора P_R – только ген его. При наличии продукта гена N с обоих промоторов транскрибируются длинные полигенные мРНК. Действие продукта гена N является примером аттенуаторного контроля (аттенуация – регуляция транскрипции на уровне терминации). Аттенуаторные участки закодированы в ДНК фага λ между генами N и CIII, между генами его и CII, а также между генами P и Q. Именно в этих точках обрывается синтез мРНК при отсутствии продукта гена N.

Под контролем группы генов C, генов его и N находится выражение, так называемых, ранних белков, участвующих в рекомбинации фаговой ДНК (int, xis, red, rex), регуляторных белков (cI, cII, cIII, cro, N), белков, участвующих в репликации фаговой хромосомы (С, Р). Ни один из этих белков не относится к компонентам зрелой фаговой частицы.

Структурные компоненты фага кодируются поздними генами, расположенными справа от гена Q. Их выражение начинается после того, как пройдет 1/3 латентного периода. Выражение поздних генов находится под позитивным контролем продуктов генов О, P, Q. Поздние гены транскрибируются в виде единой полигенной мРНК. При отсутствии продуктов генов O и P фаговая ДНК не реплицируется и не синтезируются продукты поздних генов.

Трансдукция. При изучении бактериофагов было открыто явление, получившее название трансдукция – перенос фагом генов бактерии-хозяина от клетки к клетке. Различают специфическую и неспецифическую (общую) трансдукцию.

Специфическая трансдукция впервые описана Ледербергом и его сотрудниками на примере колифага λ.. Они проводили заражение различных типов ауксотрофных мутантов штамма E. coli K12 фагом λ, выращенном на исходном прототрофном штамме K12. Чтобы проверить, не передались ли с помощью бактериофага ауксотрофам гены штамма дикого типа, культуры высевали на селективные среды. Результаты были в основном отрицательные, ни один из признаков донора не передавался фагом λ лизогенизированным реципиентам. Было лишь одно исключение – бактерии gal^– (не способные утилизировать галактозу) с вероятностью 10^-6 приобретали от донорского штамма признак gal⁺. Таким образом, было установлено, что фаг λ способен переносить (трансдуцировать) гены, но трансдукция носит специфический характер и ограничивается только генами gal, так как ДНК фага λ интегрирует в бактериальную хромосому в непосредственной близости от гена gal. С определенной вероятностью при выщеплении профага λ из состава бактериальной хромосомы происходит ошибка, и наряду с генами фага выходит область gal-гена E. coli, а часть фаговых генов остается в хромосоме. Трансдуцирующий фаг λ (λ gal) является дефектным. От 1/4 до 1/3 его генома замещается на область gal бактериальной хромосомы. Такие фаги не способны к вегетативному размножению, не образуют негативных колоний на газоне чувствительных бактерий. Однако при попадании в клетку хозяина, они делают ее устойчивой к повторной инфекции фагом λ. Дефектный фаг размножается и дает структурно полноценное потомство только при наличии фага-помощника (нормального фага λ, присутствующего в клетке-хозяине одновременно с дефектным). Такое возможно при одновременном инфицировании бактерии, как дефектным по гену gal, так и нормальным, диким фагом λ.

Неспецифическая (общая) трансдукция была описана Ледербергом и Татумом несколько раньше, чем специфическая. Это явление было открыто неожиданно, при попытке изучить половой процесс у Salmonella typhimurium. Для этого был использован метод, ранее позволивший продемонстрировать коньюгацию у E. coli. На синтетическую среду, содержащую только соли и углевод как источник углерода и энергии и не содержащую аминокислот, высевали смесь двух ауксотрофных мутантов S. typhimurium. Один из них нуждался для роста в фенилаланине, триптофане, тирозине (Phe^-, Trp^-, Tyr^-), другой – в метионине и гистидине (Met^-, His^-). Одна из 100 000 колоний образовывала прототрофные колонии. Они являлись результатом генетической рекомбинации этих двух штаммов, в котором объединились аллели дикого типа Phe⁺, Trp⁺, Tyr⁺ от одного штамма и Met⁺, His⁺ – от другого. Был сделан вывод, что у Salmonella, как и у Escherichia, может происходить генетический обмен, в результате которого образуются рекомбинанты с генетическими признаками разных предков. Однако, в отличие от E. coli, Для образования рекомбинантов у сальмонелл не требуется контакта между родительскими клетками. Обмен генов происходил за счет фага P22, который содержался в одном из родительских штаммов в форме профага.

Фаг P22 способен трансдуцировать любой ген Salmonella. Такой вариант трансдукции получил наименование «общая», «неспецифическая». Было выяснено, что частота трансдукции для всех генов приблизительно одинакова и невысока – 10^-5. Одновременно несколько признаков (генов), как правило, не передаются. Исключение составляют тесно сцепленные гены (расположенные рядом на хромосоме). Величина трансдуцируемого фрагмента ДНК ограничена объемом фаговой головки. Фаговая частица, осуществляющая общую трансдукцию и содержащая только бактериальную ДНК, не способна к вегетативному размножению и не «иммунизирует» клетку хозяина. Такие частицы возникают в результате ошибок при упаковке ДНК в фаговые капсиды.

Фаги, подобные P22, были выделены также и для E. coli, в частности фаг P1. В экспериментах по общей трансдукции генов E. coli фагом P1 была подтверждена правильность построения генетических карт хромосомы E. coli, уточнены расстояния между генами, созданы карты тонкой структуры генома.

При трансдукции фаги изменяют свойства бактериальной клетки, привнося в нее генетическую информацию (фрагмент хромосомы) от предыдущей клеткихозяина. Однако и сам «дикий» не дефектный профаг при лизогенизации клетки, делая ее «иммунной», может сообщать ей новые признаки. Такое явление получило название «фаговая конверсия». Например, E. coli после лизогенизации фагом λ приобретает устойчивость к ряду мутантов вирулентных T-четных фагов.

Наличие профага P1 в клетке E. coli делает ее устойчивой к инфицированию неродственным фагом λ. Фаг λ способен адсорбироваться на лизогенизированных клетках E. coli и инъецировать в них свою ДНК. Затем эта ДНК подвергается рестрикции (разрезанию на несколько фрагментов) за счет эндонуклеазы, кодируемой профагом P1, после чего внутриклеточное развитие фага λ прекращается.

Наиболее ярким примером лизогенной конверсии служит образование дифтерийного токсина у Corynebacterium diphtheriae. После обработки нетоксигенных штаммов коринобактерий умеренными дифтерийными фагами среди выживших бактерий можно выделить токсигенные штаммы. При этом существует четкое соответствие между токсигенностью и лизогенностью. Однако, в отличие от системы E. coli – фаг λ, где конверсия проявляется в состоянии профага, образование дифтерийного токсина происходит только после индукции профага, в период внутриклеточного вегетативного развития фага. Таким образом, дифтерийный токсин является побочным продуктом вегетативного развития фага.

8.9 Фаговые векторы

Генетические исследования фаговых геномов, построение их точных генетических карт, позволили разработать на основе фаговых ДНК векторные системы для решения генно-инженерных задач. Особенно удачный вектор был сконструирован на основе колифага λ.

Фаг λ – умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК геномом размером 48 502 п.н. Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор короток для упаковки в головку фага (размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома). Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор должен быть непременно встроен фрагмент чужеродной ДНК. Это приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов. Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, введен ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет.

Фаг M13 – нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.

Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos – сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости – то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.